1.一种对克罗诺杆菌O抗原基因特异的核苷酸，其特征在于所述核苷酸为SEQ ID NO:3、4所示的核苷酸。

2.一种PCR试剂盒，包括

10 mMdNTP 30μL； 10×酶特异性反应缓冲液50μL；

5 U/μL 耐热DNA聚合酶 5μL；10μMPCR引物各10μl；

阳性对照品10μL，阴性对照品10μL；

ddH2O 5mL；

所述PCR引物分别如权利要求1中SEQ ID NO:3、4所示。

3.权利要求1所述对克罗诺杆菌O抗原基因特异的核苷酸在制备用于检测克罗诺杆菌的PCR试剂盒中的应用。

[0001]本发明申请是申请号：201410150358.2，申请日：2014.04.16，发明名称：一种对克罗诺杆菌O抗原特异的核苷酸及其应用的分案申请。

技术领域

[0002]本发明涉及一种对克罗诺杆菌O抗原基因簇特异的核苷酸，尤其涉及一种对克罗诺杆菌O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸。

背景技术

[0003]Cronobacter（克罗诺杆菌）是最近新分类的一个属，原称Enterobactersakazakii（阪崎肠杆菌）。2007-2008年由种上升为属，成为肠杆菌科的一个新属Cronobacter。目前包括7个种，Cronobacter sakazakii，C.malonaticus，C.muytjensii，C.dublinensis，C.turicensis，C.condimenti和C.universalis。现有研究表明，所有克罗诺杆菌不同菌株之间有着明显的致病性差异，其中和婴幼儿感染相关的菌集中在Cronobacter sakazakii，C.malonaticus和C.dublinensis上。

[0004]克罗诺杆菌是重要的食源性致病菌，分布广泛，在婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶叶、草药、调味料以及豆腐等多种食品中被检测到。在对一些新生儿克罗诺杆菌感染事件的调查中发现婴幼儿奶粉是主要感染渠道。随着一系列与该菌相关的奶粉召回和重大感染事件的爆发，婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的感染问题受到全世界的普遍关注，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，死亡率可达40％～80%。世界卫生组织（WHO）和美国食品药品监督管理局（FDA）相继在2004年和2006年召开了讨论该菌的会议。

[0005]目前克罗诺杆菌的分类地位刚刚建立，其O抗原血清型的研究也逐渐成为热点。脂多糖是革兰式阴性细菌的主要表面成分，包括类脂A，核心多糖和O抗原。O抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖分子的最外层结构，它是由多个寡糖重复单位组成的多糖链，重复单位一般由3～6个单糖组成。在大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌中，负责O抗原合成的基因相邻排列于两个持家基因galF和gnd之间，在染色体上形成一个基因簇。O抗原基因簇内部的基因通常分为三类：单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。单糖合成酶负责单糖前体的合成，糖基转移酶负责将单糖串联成寡糖重复单位，而寡塘单位处理酶负责将寡糖单位从内膜内侧转运到内膜外侧，并将寡糖单位进行串联。

[0006]脂多糖特别是其中的O-抗原的组成和结构的变化决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性，比如国际上根据脂多糖的结构特性而鉴定过沙门氏菌属的抗原类型多达2107个。血清分型是一种经典和常用的流行病学调查手段，对于临床研究及疫苗研制具有重要意义。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此,建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为目前的发展方向。现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。

[0007]近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于阪崎肠杆菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

[0008]不同抗原的糖基转移酶和寡糖单位处理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型特异性，可用作靶基因进行分子生物学鉴定。寡糖单位处理酶基因包括O抗原转运酶基因(wzx)和O抗原聚合酶基因(wzy)。利用上述两个基因作为血清型分型检测的特异靶基因是十分理想的。如大肠杆菌（王威，彭霞，2006年）、变形杆菌和沙门氏菌均有利用该基因做特异检测的实例。

[0009]聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction,简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为克罗诺杆菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。

发明内容

[0010]本发明的一个目的在于提供了一种对克罗诺杆菌O抗原基因特异的核苷酸，其特征在于所述核苷酸为：

[0011]1）SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸中的至少一种

[0012]2）与SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。其中所述互补的核苷酸指的是由SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸按照碱基配对原则（A=T,G≡C）得出的与它们互补的核苷酸， 如SEQ ID NO1： 5' GAAGCGGCAGATTCATTTA3'的互补核苷酸为5‘TAAATGAATCTGCCGCTTC 3’。

[0013]本发明另一个目的在于提供了一种用于检测克罗诺杆菌的PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物如SEQ ID NO:1-12所示核苷酸中的至少一种。如用于检测C.dublinensis O1的引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，和用于检测C.dublinensis O2引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

[0014]这种试剂盒，还包括如下试剂：10 mM dNTP 30μL；10×酶特异性反应缓冲液50μL；5 U/μL 耐热DNA聚合酶 5μL；引物1（10μM） 10μl；引物2（10μM）10μl；阳性对照品10μL；阴性对照品10μL；ddH2O 5mL。

[0015]本发明再一个目的在于提供了所述核苷酸在制备用于检测克罗诺杆菌的基因芯片中的应用。所述的基因芯片为微列阵芯片。包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸如SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸中的至少一种。

[0016]本发明公开的用于快速检测克罗诺杆菌的核苷酸与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0017]（1）实用性强

[0018]应用本发明所配制的PCR试剂盒等配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低。

[0019]（2）准确性高

[0020]本发明设计了对克罗诺杆菌O抗原基因特异的引物，以克罗诺杆菌的基因组为模板做PCR能够得到条带单一，大小正确的目的条带，而以其它细菌的基因组为模板做PCR时，不能得到正确的目的条带。

[0021]附图说明：

[0022]附图中的G2539是C.sakazakiiO1，G2356是C.sakazakiiO2，G2594是C.sakazakiiO4，G2732是C.dublinensisO1，G3983是C. dublinensisO2，G3882是C.turicensisO2，G3874是C.turicensisO3，G3886是C.muytjensiiO2，G3864是C.malonaticusO1；

[0023]图1表示g2732wzm基因P1和P2引物的筛选，目的条带为336bp，其余的菌没有任何条带；

[0024]图2表示g 3983wzy基因P3和P4引物的筛选，目的条带为725bp，其余的菌没有任何条带；

[0025]图3表示g3882wzy基因P5和P6引物的筛选，目的条带为266bp，其余的菌没有任何条带；

[0026]图4表示g3874wzy基因P7和P8引物的筛选，目的条带为362bp，其余的菌没有任何条带；

[0027]图5表示g3886wzy基因P9和P10引物的筛选，目的条带为378bp，其余的菌没有任何条带；

[0028]图6表示g3864wzy基因P11和P12引物的筛选，目的条带为267bp，其余的菌没有任何条带。

具体实施方式

[0029]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989）中所述的条件。

[0030]实施例1：

[0031]基因组的提取：

[0032]37℃ 2YT液体培养基（配方为：蛋白胨16g/L,酵母粉10g/L,NaCl5g/L）培养克罗诺杆菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下：

[0033]用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul10%SDS，50℃温育2小时，再加入3 ul 10mg/ml 的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0034]实施例2：

[0035]O抗原基因簇破译：

[0036]（1） 通过Long-PCR扩增克罗诺杆菌的O抗原基因簇。根据Genbank中的galF基因设计上游引物，再根据gnd基因设计下游引物。

[0037]PCR反应程序如下：在94℃预变性5分钟;然后94℃变性30秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸8分钟,得到PCR产物，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并8管50 μl long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

[0038] 构建O抗原基因簇文库：用shot-gun法构建O抗原基因簇文库，反应体系是600ng PCR纯化产物，经过核酸片段仪剪切成1～3kb片段、补平粘性末端、pUC18的载体连接（采用fastlink ligase）连接得到测序的基因文库。

[0039] 对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的200个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到8～10倍的覆盖率，从而获得O抗原基因簇的所有序列。

[0040] 核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC分子生物学实验室出版的Stadenpackage 软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列后，用美国国家生物技术信息学中心的orf finder发现基因，找到开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到克罗诺杆菌的基因簇的序列。

[0041]实施例3 ：

[0042]引物设计及筛选

[0043]根据基因簇破译情况，我们发现wzy/wzm确实是克罗诺杆菌特异的基因，所以选取该基因特异区段设计特异引物。将上述基因导入Primer Premier 5进行引物设计，引物的长度最好在18～24bp之间，Tm值在50～55℃。

[0044]引物设计之后在Genbank中进行BLAST，设计的引物不能与其它近缘细菌的序列相似性过高，这样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应。这一点对于避免非特异条带的产生和实验的成败十分重要。设计出的引物如表1所示。

[0045]表1 用于PCR的引物序列

[0046]

[0047]基因鉴定引物筛选用到的PCR体系(25μl)和反应条件如下：

[0048]超纯水 15.7μl

[0049]缓冲液(10X) 2.5μl

[0050]dNTP(10mM) 0.5μl

[0051]引物1（10μM） 0.5μl

[0052]引物2（10μM） 0.5μl

[0053]DNA聚合酶（rTaq） 0.3μl(5U/μl)

[0054]模板DNA 5μl

[0055]这个步骤中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

[0056]

[0057]上述步骤在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

[0058] 取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5：1的体积比混合；

[0059] 将混合液上样于1.2％的琼脂糖凝胶上；

[0060] 将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用DL2000 Marker进行对照；

[0061] 观察并记录结果。

[0062]引物筛选这个环节用到的基因组模板提取采用煮菌法。通过基本PCR反应之后引物筛选的工作基本结束，必要的长度调整对整体反应条件影响不大，本发明中用到的引物序列全部总结在表1中。

[0063]实施例4：

[0064]PCR检测试剂盒的应用

[0065] PCR试剂盒的组成

[0066]包括PCR引物、dNTP、缓冲液、DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品。试剂盒使用的量都是20μl为一个基本用量。每个试剂盒可以检测20个样品。

[0067]（2）检测实验所需材料及设备的准备

[0068]其中10×buffer 、dNTP、Taq 聚合酶由均由上海生工公司提供；引物混合物为自行设计的序列提供给北京英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH2O由我们自行制备。实验的设备PCR仪、电泳设备、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。

[0069] PCR试剂盒的使用具体实例

[0070] 待测样品的处理。如果有条件提取基因组也可以，为了节省时间和耗材，可以直接取500μl菌液，离心后用500μl ddH2O重悬，100℃煮沸10分钟，然后12000rpm离心10min，取中层上清为模板。

[0071] 取PCR试剂盒的试剂20μl于PCR管中，加入5μl模板。

[0072] PCR反应条件如下：

[0073]

[0074] 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测试验结果。

[0075] 结果的分析和记录。

[0076]结论：用这些引物对克罗诺杆菌和其它相近种属菌株进行特异性检测，发现引物特异。通过这些引物对克罗诺杆菌属内菌种间进行特异性检测，结果见附图。实验中所用到的菌株见表2。

[0077]表2 特异性检测用到的菌株

[0078]

[0079]SEQUENCE LISTING

[0080]<110> 南开大学

[0081]<120> 一种对克罗诺杆菌O抗原特异的核苷酸及其应用

[0082]<160> 12

[0083]<170> PatentIn version 3.5

[0084]<210> 1

[0085]<211> 19

[0086]<212> DNA

[0087]<213> 人工序列

[0088]<400> 1

[0089]gaagcggcag attcattta 19

[0090]<210> 2

[0091]<211> 19

[0092]<212> DNA

[0093]<213> 人工序列

[0094]<400> 2

[0095]ttccgtcggt atccacatt 19

[0096]<210> 3

[0097]<211> 19

[0098]<212> DNA

[0099]<213> 人工序列

[0100]<400> 3

[0101]tttcatctga gccgttact 19

[0102]<210> 4

[0103]<211> 18

[0104]<212> DNA

[0105]<213> 人工序列

[0106]<400> 4

[0107]gacgataggc attccaag 18

[0108]<210> 5

[0109]<211> 18

[0110]<212> DNA

[0111]<213> 人工序列

[0112]<400> 5

[0113]actgcggcaa ataaccac 18

[0114]<210> 6

[0115]<211> 20

[0116]<212> DNA

[0117]<213> 人工序列

[0118]<400> 6

[0119]cacaggcaat aacaagaaaa 20

[0120]<210> 7

[0121]<211> 18

[0122]<212> DNA

[0123]<213> 人工序列

[0124]<400> 7

[0125]ttaataaacg gcgtcagg 18

[0126]<210> 8

[0127]<211> 20

[0128]<212> DNA

[0129]<213> 人工序列

[0130]<400> 8

[0131]acagagcgag caaaatacac 20

[0132]<210> 9

[0133]<211> 20

[0134]<212> DNA

[0135]<213> 人工序列

[0136]<400> 9

[0137]gcgttatggt ttctattcaa 20

[0138]<210> 10

[0139]<211> 21

[0140]<212> DNA

[0141]<213> 人工序列

[0142]<400> 10

[0143]attttggcaa ctatctactg a 21

[0144]<210> 11

[0145]<211> 20

[0146]<212> DNA

[0147]<213> 人工序列

[0148]<400> 11

[0149]ccttggtaga ttcggtacta 20

[0150]<210> 12

[0151]<211> 18

[0152]<212> DNA

[0153]<213> 人工序列

[0154]<400> 12

[0155]tattccacat cccatcct 18