1.一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，包括添加了细胞因子、小分子药物或miRNA的管状聚合物纤维支架；

所述细胞因子包括TGF-β、VEGF、PDGF生长因子中至少一种；

所述小分子药物包括DMOG的至少一种；所述miRNA包括miRNA 221、miRNA-146a的至少一种；

所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料；所述血管支架用于血管细胞的低氧诱导培养，含氧量为2%；

所述管状聚合物纤维支架采用双层结构，内层为周向排列的熔融纺丝纤维，纤维直径10-60μm；外层为无序排列的静电纺丝纤维，纤维直径1-10μm。

2.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述管状聚合物纤维支架为侧壁多孔的结构。

3.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述可降解聚合物材料采用聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原中一种或几种的任意比例混合物。

4.根据权利要求1所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，其特征在于，所述管状聚合物纤维支架，内径为2-10mm，壁厚为200-1000μm，长度为5-40cm。

5.一种快速制备的脱细胞基质人工血管，其特征在于，以权利要求1-4任意一项所述的可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架为模板制备得到。

6.根据权利要求5所述的快速制备的脱细胞基质人工血管，其特征在于，利用如下方法制备：

首先接种平滑肌细胞或内皮细胞，尽量使细胞均匀分布在整个血管支架的纤维空隙内，静态培养1天，使接种的细胞完全贴附和伸展，随后置于流动培养生物反应器，与循环管路连接，逐渐加大液体流速、剪切力和压力至与生理水平相当的条件，持续培养1-6周；

培养结束后，对接种细胞并培养后的活性人工血管进行温和的脱细胞处理。

技术领域

[0001]本发明属组织工程领域，具体涉及一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架及脱细胞基质人工血管。

背景技术

[0002]在我国乃至世界范围内，心血管疾病的患病率和死亡率高居非传染性疾病之首，远超肿瘤、慢性呼吸系统疾病和糖尿病等其他疾病。《中国心血管疾病报告2018》指出，我国现阶段推算心血管病人数超过2.9亿，形成了严重的公共卫生问题，造成了巨大的健康与经济负担。针对心血管疾病的临床治疗手段主要包括血管扩张和血管移植手术，血管移植手术中最为理想的是使用患者自体血管，但由于患者健康状况、能够获取的血管长度等限制，满足手术要求的健康血管往往难以获得。口径大于6mm的人工血管已广泛应用于临床，术后通畅率较高，但用于外周血管搭桥或替换的小口径(内径<6mm)人工血管至今没有商业化的产品。因此，研发新型小口径人工血管以满足临床需求，具有重要的现实意义。

[0003]目前，常用的小口径人工血管支架材料主要有两大类,即以聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)(PLCL)等为代表的合成聚合物材料，和以胶原、脱细胞基质材料为代表的天然材料。合成聚合物材料有着较为良好的机械性能，可加工性强，但作为长期植入的血管替换材料而言生物活性较差，不利于血管组织的完全再生，容易引起钙化，从而导致移植失败，所以仍需进行进一步活性修饰。

[0004]脱细胞基质(Decellularized extracellular matrix，dECM)是近年来组织工程血管材料研究的热点之一。将取材与动物体内的血管脱细胞后，其dECM材料保留了大部分具有生物活性的胞外基质蛋白，如胶原蛋白和弹性蛋白等，同时去除了活细胞带来的免疫原性。能够有效促进血管组织再生。但是，天然血管往往无法与临床上所需移植血管的特定口径或长度相匹配。另外，天然dECM材料往往力学性能较差，脱细胞的过程还会不可避免的再次降低材料的力学性能，且其脱细胞后孔隙率小，结构致密，不利于宿主细胞的浸润和生长，极大限制了天然dECM材料在血管移植领域的应用。

[0005]利用体外生物反应器构建组织工程人工血管能够克服天然组织脱细胞基质的缺点，充分发挥dECM材料的优势。体外生物反应器以材料作为支架，在其上种植种子细胞，材料为细胞的生长和增殖提供了空间，而细胞按照材料支架的构形增殖，种子细胞分泌细胞外基质逐渐替代降解的材料，最终成为具有生物功能的血管组织。在以往研究中，有研究者把平滑肌细胞(VSMCs)种植在聚乙醇酸(PGA)血管支架上，将其放入生物反应器中，经过八周的培养后进行脱细胞处理，获得了具有良好生物相容性的dECM人工血管。但是，利用这种方法制备的血管材料需要在体外培养时间长达八周，增加了制造和维护成本的同时还容易因长时间培养细胞导致染菌等问题而失败，一定程度上限制了其应用与商品化。如何在体外实现快速制备dECM人工血管，是目前研究中亟待解决的问题。

[0006]综上所述，调控种子细胞迁移、增殖和胞外基质的分泌是体外组织工程人工血管制备的关键。为了解决上述问题，我们在材料上种植血管细胞并利用生物反应器对其进行培养，生物反应器提供的流体力学刺激和环境刺激能够促进种子细胞的增殖和胞外基质分泌。除了力学和培养环境的控外，在组织工程血管的制备过程中，通过细胞因子、小分子药物或miRNA等的添加，对种子细胞状态和功能进行调节，实现促进所种植的血管细胞快速增殖及其ECM的沉积，提高体外反应器制备人工血管的效率。

发明内容

[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种促进细胞快速增殖及促进其ECM沉积的血管支架、血管支架的制备方法及脱细胞基质人工血管，所得产品能够用于小口径血管移植和搭桥手术，解决现有小口径人工血管再生差、远期通畅率低的问题。

[0008]本发明公开了一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架，包括添加了细胞因子、小分子药物或miRNA的管状聚合物纤维支架；所述活性因子包括TGF-β、VEGF、PDGF生长因子中至少一种；所述小分子药物包括DMOG的至少一种；所述miRNA包括miRNA-221、miRNA-146a的至少一种；所述管状聚合物纤维支架采用可降解聚合物材料；所述培养条件调控手段包括低氧诱导培养。

[0009]进一步地，所述管状聚合物纤维支架为侧壁多孔的结构。

[0010]进一步地，所述可降解聚合物材料采用聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚乙二醇(PEO)、明胶、胶原中一种或几种的任意比例混合物。

[0011]优选地，所述管状聚合物纤维支架，内径为2-10mm，壁厚为200-1000μm，长度为5-40cm。

[0012]进一步地，所述管状聚合物纤维支架为单层或双层结构。

[0013]优选地，所述管状聚合物纤维支架采用双层结构时，内层为周向排列的熔融纺丝纤维，纤维直径10-60μm，有助于血管平滑肌细胞的仿生排列和中膜组织再生；外层为无序排列的静电纺丝纤维，纤维直径1-10μm。此双层结构有助于保持血管支架的拉伸强度并防止渗漏。

[0014]本发明还公开了一种可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架的制备方法，包括以下步骤：

[0015]制备管状聚合物支架，所述管状聚合物纤维支架的制备方法包括：熔融纺丝、3D打印、静电纺丝、编织、浇铸中的至少一种；

[0016]添加细胞因子、小分子药物或miRNA，所述活性因子的添加方式包括：在聚合物溶液中添加、在支架表面吸附、自组装或化学键接枝固定。

[0017]添加的细胞因子、小分子药物或miRNA可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质，有利于实现血管移植后的重构和再生。

[0018]本发明还公开了一种快速制备的脱细胞基质人工血管，利用如下方法制备：

[0019]首先接种平滑肌细胞或内皮细胞，尽量使细胞均匀分布在整个血管支架的纤维空隙内，静态培养1天，使接种的细胞完全贴附和伸展，随后置于流动培养生物反应器，与循环管路连接，逐渐加大液体流速、剪切力和压力至与生理水平相当的条件，持续培养1-6周。培养结束后，对接种细胞并培养后的活性人工血管进行温和的脱细胞处理，确保细胞的彻底脱除，同时最大程度保留活性的细胞外基质，并且不破坏内部的聚合物纤维原始结构。

[0020]进一步地，所述平滑肌细胞为人源iPS，通过诱导分化制备的平滑肌细胞或内皮细胞。iPS的制备及其向平滑肌细胞或内皮细胞定向诱导分化遵循商品试剂盒的使用说明。

[0021]进一步地，所述脱细胞处理的方法包括：SDS法或液氮冻融法。

[0022]优选地，SDS法的操作步骤如下：将组织工程血管浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上，室温缓慢振荡12h，之后用无菌的生理盐水冲洗除去SDS，随后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中，其中酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成；DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml，于摇床上室温振荡24h，随后用无菌的生理盐水冲洗残留的DNase和RNase，最后将得到的材料置于无菌PBS中，4℃保存备用。

[0023]本发明的有益效果在于：

[0024]1、能够快速制备脱细胞基质人工血管；

[0025]2、制备的脱细胞基质人工血管再生性好，远期通畅率高。

附图说明

[0026]图1为平滑肌细胞在不同氧气浓度培养条件下增殖情况；

[0027]图2为平滑肌细胞在不同氧气浓度培养条件下增殖情况图；

[0028]图3为内皮细胞在不同人造血管支架上增殖情况图；

[0029]图4为平滑肌细胞在不同人造血管支架上培养14天后胶原沉积情况图；

[0030]图5为平滑肌细胞在不同人造血管支架上培养14天后，胞外基质分泌相关基因表达情况检测图。

具体实施方式

[0031]下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0032]实施例1

[0033]一种通过低氧调控，可快速制备的脱细胞基质人工血管，其制备方法包括以下步骤：

[0034]1、支架制备

[0035]采用静电纺丝法制备支架，具体操作步骤如下：称取3g分子量为80000的PCL，加入到12mL体积比为5：1的氯仿与无水甲醇的混合溶剂中，室温搅拌溶解过夜，制得浓度分数为25％(m/v)的PCL溶液；将静电纺丝装置置于通风橱内，直径2mm的不锈钢管(接收棒)与旋转电机相连，将PCL溶液吸入注射器中，将注射器安装在注射泵上，注射器针头与接收棒距离10cm，使用高压直流电源在21G金属针头上加12kV电压。设定注射泵推进速度为8mL/h，接收棒转速为100rpm，纺丝时间为10min。可得到PCL血管支架，其纤维直径5μm，厚度100μm，内径为2mm，总壁厚为400μm。

[0036]2、种子细胞制备

[0037](1)iPSCs体外培养

[0038]人尿液源多功能诱导干细胞(iPSCs)购自赛贝生物。iPSCs保存于液氮罐，复苏细胞前将Matrigel提前铺在细胞培养皿中，放置37℃孵育至少4小时。同时将人多能干细胞无饲养层培养基(mTeSR)细胞培养基放置室温复温。将细胞从液氮罐中拿出后迅速放入37℃水浴锅中，解冻至溶液状态，转移至无菌操作台将细胞悬液转移至新的15mL离心管中离心(900rpm/min，3min)。并将细胞培养皿中的Matrigel上清液弃去，加入mTeSR培养基重悬细胞，轻柔吹吸2-4次混匀。接种到准备好的培养皿中，显微镜下观察细胞呈4～10个细胞大小的团块。每天更换新鲜的mTeSR培养基。每隔5-7天，利用分散酶进行细胞传代。

[0039](2)iPSCs向平滑肌细胞诱导分化

[0040]当iPSCs密度达到80％左右时，在37℃条件下，用分散酶消化细胞15分钟，获得拟胚体(EBs)，将EBs种植在低粘附力且含有mTeSR培养基的六孔板中培养。第二天将培养基更换为比例为1:3的mTeSR培养基和拟胚体(EBs)分化培养基。第三天将培养基替换为EBs分化培养基，连续培养3天。第5天时，将EBs转移至明胶(Gelatin)包被的六孔板中，再用EB分化培养基培养5天，每天更换新的EBs培养基。培养5天后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，将其接种于Matrigel凝胶包被的T75瓶上，用平滑肌细胞生长培养基培养基(SmGM-2)培养7天，每隔一天换新鲜培养基，最终可获得iPSCs诱导分化的血管平滑肌细胞(iPSC-SMCs)。

[0041]3、种子细胞种植与培养

[0042]PCL支架种植细胞前，需用胶原蛋白预包被。具体步骤如下：将制备的PCL支架提前在PBS中浸润，然后将其浸泡在浓度为1mg/ml的I-型胶原蛋白的1％乙酸溶液中，4℃孵育过夜后用PBS冲洗三次，去除残余的未包被的胶原蛋白。取平滑肌细胞悬液，从一端注入血管支架内腔，静置5分钟后，将血管支架放在滤纸上均匀地来回滚动以吸干培养基，重复以上操作6次，血管两端各进行3次，以保证种植均匀。种植完成后将种有细胞的血管放入六孔板中静置10分钟，随后加入10毫升培养基。在37℃，5％CO2的培养箱中静置培养24小时，每隔4小时旋转90°，以使平滑肌细胞粘附于血管支架上。使用TEB 500生物反应器对人工血管进行流动培养。培养环境设置为37℃，5％CO2，氧气浓度设置为2％，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，缓慢调节流速至额定速率。

[0043]低氧诱导可以刺激iPSC-SMCs向分泌增殖型转化，促进iPSC-SMCs增殖与其胞外基质分泌，从而缩短人工血管体外培养时间，短时间内得到具有良好生物活性的细胞外基质人工血管。

[0044]4、脱细胞处理

[0045]将上述制得的活性人工血管浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上，室温缓慢振荡12小时，之后用无菌的生理盐水冲洗去除SDS，随后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成；DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温振荡24小时，随后用无菌的生理盐水冲洗残留的DNase和RNase，最后将得到的材料置于无菌PBS中，4℃保存备用。

[0046]如此得到的脱细胞人工血管具有良好的血管再生活性，能够满足临床治疗的需要。

[0047]为了进一步说明本实施例的有益效果，特设置如下实验：

[0048]低氧培养对平滑肌细胞增殖影响检测：

[0049]将平滑肌细胞种植在步骤1中所得静电纺丝PCL血管支架上，在不同氧气浓度条件下培养，设置正常氧气浓度(21％)培养条件为对照组1-1；设置氧气浓度10％培养条件作为对照组1-2；设置氧气浓度5％培养条件作为对照组1-3；比较以上对照组相比实施例1中所述的，氧气浓度2％的培养条件下细胞增殖情况。

[0050]实验结果如附图1所示(***p<0.001)。由图1可以看出，2％氧气浓度培养条件相比其他氧气浓度能够有效促进平滑肌细胞增殖，有助于体外培养脱细胞基质人造血管的快速构建。

[0051]低氧培养对平滑肌细胞分泌细胞外基质影响检测：

[0052]将平滑肌细胞种植在步骤1中所得静电纺丝PCL血管支架上，在不同氧气浓度条件下培养7天。设置正常氧气浓度(21％)培养条件为对照组1-1；比较对照组相比实施例1中所述的，氧气浓度2％的培养条件对平滑肌细胞在血管支架材料上细胞外基质分泌积累情况。

[0053]实验结果如下图2所示(***p<0.001)：

[0054]A)对照组1-1人造血管支架种植平滑肌细胞体外培养7天后，内表面整体扫描电镜图片。

[0055]B)对照组1-1人造血管支架种植平滑肌细胞体外培养7天后，内表面扫描电镜局部放大图片。

[0056]C)实施例1人造血管支架种植平滑肌细胞体外低氧(2％)培养7天后，内表面整体扫描电镜图片。

[0057]D)实施例1人造血管支架种植平滑肌细胞体外低氧(2％)培养7天后，内表面扫描电镜局部放大图片。

[0058]由图2可以看出，2％氧气浓度培养条件相比正常氧气浓度(21％)能够有效促进平滑肌细胞分泌保外基质，有助于体外培养脱细胞基质人造血管的快速构建。

[0059]实施例2

[0060]一种添加有小分子药物DMOG，可加快脱细胞基质人造血管制备的人造血管支架，其制备方法包括以下步骤：

[0061]1、支架制备

[0062]采用静电纺丝法制备支架，具体操作步骤如下：称取1.5g分子量为80000的PCL，加入到6mL体积比为5：1的氯仿与无水甲醇的混合溶剂中，室温搅拌溶解过夜，制得浓度分数为25％(m/v)的PCL溶液；再向其中加入200μL浓度为24mg/mL的DMOG-甲醇溶液，室温搅拌溶解1小时。将静电纺丝装置置于通风橱内，直径2mm的不锈钢管(接收棒)与旋转电机相连，将PCL溶液吸入注射器中，将注射器安装在注射泵上，注射器针头与接收棒距离10cm，使用高压直流电源在21G金属针头上加12kV电压。设定注射泵推进速度为8mL/h，接收棒转速为100rpm，纺丝时间为10min。可得到PCL-DMOG血管支架，其纤维直径5μm，厚度100μm，内径为2mm，总壁厚为400μm。

[0063]即可得到添加有小分子药物DMOG，可加快脱细胞基质人造血管制备的人造血管支架。进一步的，还可通过在该人造血管支架上通过体外细胞培养获得快速制备的脱细胞基质人造血管。方法如下：

[0064]2、种子细胞制备

[0065](1)iPSCs体外培养

[0066]与实施例1方法相同

[0067](2)iPSCs向内皮细胞诱导分化

[0068]第0-1天，使用添加4-8μM的GSK3I的CDM3分化培养基对细胞密度达到95％以上的人多能干细胞进行诱导分化；第2天，使用添加40-60ng/mLbFGF的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第3-5天，使用添加40-60ng/mL VEGF和20-30ng/mLBMP4的CDM3分化培养基对上一步诱导培养后的细胞进一步诱导分化；第6天对上一步诱导培养后的细胞进行消化，随后采用内皮细胞培养基继续培养3-4天，即可获得iPSCs诱导分化的内皮细胞(iPSC-ECs)。

[0069]3、种子细胞种植与培养

[0070]iPSC-ECs细胞种植方法与实施例1相同。

[0071]使用TEB 500生物反应器对人工血管进行流动培养。培养环境设置为37℃，5％CO2，氧气浓度设置为21％，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，缓慢调节流速至额定速率。

[0072]4、脱细胞处理

[0073]与实施例1方法相同

[0074]由此即可得到快速制备的脱细胞基质人造血管。

[0075]为了进一步说明本实施例的有益效果，特设置如下实验：

[0076]取与实施例2所述的血管支架相同尺寸的纯PCL材料的人造血管支架作为对照组2-1

[0077]测试内皮细胞在对照组2-1、实施例所述的负载DMOG的PCL血管支架上的增殖情况，实验结果如附图3所示(**p<0.01，***p<0.001)。由图3可以看出，DMOG的负载能够有效促进内皮细胞增殖，有助于体外培养脱细胞基质人造血管的快速构建。

[0078]实施例3

[0079]一种添加有miRNA-221，可促进平滑肌细胞快速增殖及其胞外基质迅速累积的人造血管支架，其制备方法包括以下步骤：

[0080]1、miRNA-221复合物的制备

[0081]用DEPC水，将miRNA-221配置成浓度为0.665mg/mL的溶液，再将带正电的聚合物三甲基壳聚糖(TMC)配置成6mg/mL的溶液，将上述两种溶液以体积比1:10的比例混合，涡旋振荡30s并在室温条件下孵育30min，即可获得miRNA-221复合物纳米颗粒溶液。

[0082]2、支架制备

[0083]称取2g分子量为80000的PCL，加入到10mL体积比为5：1的氯仿与无水甲醇的混合溶剂中，加入120mg乳化剂F127，室温搅拌溶解过夜，形成均匀的油相溶液。随后，将步骤1中制备的水相溶液以水油比1：25的比例混合，室温搅拌45min，形成均一的乳液。随后设置注射器针头与直径2mm的接收棒距离15cm，使用高压直流电源在21G金属针头上加15-18kV电压。设定注射泵推进速度为6-8mL/h，直径为2mm的接收棒转速为100rpm，纺丝时间为10min-20min。制备所得血管支架壁厚约为400μm-500μm。

[0084]如此即可得到能够缓释miRNA-221的可促进平滑肌细胞快速增殖及其胞外基质迅速累积的人造血管支架。

[0085]此血管支架在进行体外平滑肌细胞培养时，可逐渐释放miRNA-221，促进血管平滑肌细胞去分化，提高VSMC增殖、潜移等相关基因表达，诱导种植的平滑肌细胞快速增殖及其保外基质迅速积累。

[0086]实施例4

[0087]一种负载TGF-β的可促进种植的平滑肌细胞分泌细胞外基质的PCL血管支架，其制备方法包括以下步骤：

[0088]首先采用同轴电纺技术制备负载TGF-β的PCL血管支架。壳层溶液是将PCL溶于氯仿和甲醇(体积比5：1)混合溶剂，制备成浓度为25％(w/v)的PCL溶液，在每毫升PCL溶液中加入20mg的聚乙二醇(PEG)，以促进芯层结构中TGF-β的释放。将牛血清白蛋白(BSA)以1mg/mL的浓度溶解于PBS缓冲液中，再向其中加入TGF-β，配置为浓度20μg/mL的芯层溶液，其中BSA起到稳定剂的作用。将壳、芯两种溶液分别加入两个10mL注射器内，接入同轴电纺针头。电压设置为14kV，壳层纺丝液注射泵推进速度为6mL/h，芯层纺丝液注射泵推进速度为0.6mL/h，直径为2mm的接收棒转速设置为100rpm，纺丝时间为10min。

[0089]即可得到负载TGF-β的可促进种植的平滑肌细胞分泌细胞外基质的PCL血管支架。进一步的，还可通过在该人造血管支架上通过体外细胞培养获得快速制备的脱细胞基质人造血管。方法如下：

[0090]2、种子细胞制备

[0091]与实施例1方法相同

[0092]3、种子细胞种植与培养

[0093]iPSC-SMCs细胞种植方法与实施例1相同。

[0094]使用TEB 500生物反应器对人工血管进行流动培养。培养环境设置为37℃，5％CO2，氧气浓度设置为21％，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，缓慢调节流速至额定速率。

[0095]4、脱细胞处理

[0096]与实施例1方法相同

[0097]由此即得到快速制备的脱细胞基质人造血管。

[0098]为了进一步说明本实施例的有益效果，特设置如下实验：

[0099]取与实施例4所述的血管支架相同尺寸的纯PCL材料的人造血管支架作为对照组4-1

[0100]测试在对照组4-1、实施例4所述的负载TGF-β的PCL血管支架上种植平滑肌细胞并体外培养14天后，支架材料上胶原沉积情况。分别将培养14天后的两组人造血管液氮速冻后进行冷冻干燥，将冻干后的样品称重，然后按照检测定量试剂盒的操作说明对人造血管进行胶原蛋白定量分析。最终以干重的形式来标定纤维蛋白的含量(μg/mg)，实验结果如附图4所示(***p<0.001)。

[0101]从结果可以看出，TGF-β的负载显著加快了平滑肌细胞在体外的增殖速度，有助于体外培养脱细胞基质人造血管的快速构建。

[0102]测试平滑肌细胞在对照组4-1、实施例所述的负载TGF-β的PCL血管支架上，体外培养14天后胞外基质分泌相关基因的表达情况。实验结果如附图5所示(***p<0.001)：

[0103]A：I型胶原分泌相关基因(COL1α1)；

[0104]B：Ⅲ型胶原分泌相关基因(COL3α1)；

[0105]C：纤连蛋白分泌相关基因(FN1)

[0106]从结果可以看出，TGF-β的加入诱导平滑肌细胞分泌胶原、纤连蛋白等胞外基质成分的能力增强，能够加快胞外基质积累，有助于体外培养脱细胞基质人造血管的快速构建。

[0107]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。