1.一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，并将重构胚胎移植回0.5天假孕母鼠的输卵管中，在胚胎发育到E8.5天时进行解剖，分离体节组织；

步骤二：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中，并通过流式分选富集单倍体细胞，建立小鼠单倍体神经干细胞系；

步骤三：将获得的小鼠单倍体神经干细胞系培养于类脑培养液中，经过生长和空间折叠获得单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官；

步骤四：采用免疫荧光细胞和分子生物学进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤一还包括以下步骤：

S1：对性成熟的ICR母鼠进行超数排卵处理，并与公鼠进行合笼，第二天见栓的母鼠用于获取受精卵；

S2：在每个受精卵胚胎中注射8-12个BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞构成重构胚胎；

S3：将重构胚胎移植到0.5天假孕母鼠的输卵管中，继续饲养至E8.5天；

S4：在E8.5天将假孕母鼠处死，用无菌器械分离子宫，在体式镜下分离胚胎，剖出E8.5的完整胚胎，用解剖针分离该胚胎体节区域。

3.根据权利要求2所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤S2中在受精卵胚胎4-8细胞时期时注射。

4.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤二还包括以下步骤：

S11：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中每3-5天使用0.05% 的胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化传代形成细胞悬液；

S12：采用荧光染料对消化后的细胞悬液进行染色；

S13：通过流式分选富集单倍体1n峰，建立小鼠单倍体神经干细胞系。

5.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤二之后对小鼠单倍体神经干细胞特异性标志物进行鉴定。

6.根据权利要求1所述的一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，其特征在于，所述步骤三还包括以下步骤：

S111：将状态良好的小鼠单倍体神经干细胞消化为单细胞，离心后去除上清；

S112：用神经培养基础培养基重悬细胞沉淀并进行悬浮培养，24小时内观察单倍体神经干细胞重聚成3D球状结构；

S113：用神经培养基础培养基添加2μM SB-431542和DMH1悬浮诱导3D球状结构 7天后贴壁培养继续诱导8天，待神经花环样结构明显形成；

S114：采用毛细针将神经管样结构切下，随培养基转移至15ml离心管中自然沉降，用神经培养基础培养基添加2μM SB-431542、DMH1和2%的B27的培养基重悬神经管样的细胞球样沉淀，继续悬浮培养2-3天，即可自组织形成球状的前脑背侧类脑器官。

技术领域

[0001]本发明属于类脑器官的制备技术领域，特别涉及一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法。

背景技术

[0002]神经退行性疾病已逐渐成为威胁人类健康的主要因素。近年来，阿尔茨海默症，帕金森病及肌萎缩侧索硬化症等疾病引起了全世界的广泛关注，然而目前世界上尚无有效的治疗方法。因此有必要系统的解析神经退行性疾病发生的机制。

[0003]哺乳动物单倍体细胞系因其产生纯合基因型的优势近年来被广泛用于高通量遗传学筛选，以揭示重要生命进程或疾病发生的关键调控基因。哺乳动物单倍体神经谱系细胞系的建立将会成为解析神经系统疾病的发生机制的理想工具。前期文献报道所建立的单倍体神经干细胞类似细胞为体外分化所得，异质性较大，不利于功能基因的探索。除此以外，目前所报道的小鼠类脑器官的建立方法均为组织或胚胎干细胞来源，尚未有神经干细胞来源的小鼠类脑器官的报道。

[0004]公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

[0005]本发明的目的在于提供一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，从而克服上述现有技术中的缺陷。

[0006]为了实现上述目的，本发明提供了一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，包括以下步骤：

步骤一：将BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，并将重构胚胎移植回0.5天假孕母鼠的输卵管中，在胚胎发育到E8.5天时进行解剖，分离体节组织；

步骤二：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中，并通过流式分选富集单倍体细胞，建立小鼠单倍体神经干细胞系；

步骤三：将获得的小鼠单倍体神经干细胞系培养于类脑培养液中，经过生长和空间折叠获得单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官；

步骤四：采用免疫荧光细胞和分子生物学进行鉴定。

[0007]进一步的，作为优选，所述步骤一还包括以下步骤：

S1：对性成熟的ICR母鼠进行超数排卵处理，并与公鼠进行合笼，第二天见栓的母鼠用于获取受精卵；

S2：在每个受精卵胚胎中注射8-12个BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞构成重构胚胎；

S3：将重构胚胎移植到0.5天假孕母鼠的输卵管中，继续饲养至E8.5天；

S4：在E8.5天将假孕母鼠处死，用无菌器械分离子宫，在体式镜下分离胚胎，剖出E8.5的完整胚胎，用解剖针分离该胚胎体节区域。

[0008]进一步的，作为优选，所述步骤S2中在受精卵胚胎4-8细胞时期时注射。

[0009]进一步的，作为优选，所述步骤二还包括以下步骤：

S11：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中每3-5天使用0.05% 的胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化传代形成细胞悬液；

S12：采用荧光染料对消化后的细胞悬液进行染色；

S13：通过流式分选富集单倍体1n峰，建立小鼠单倍体神经干细胞系。

[0010]进一步的，作为优选，所述步骤三还包括以下步骤：

S111：将状态良好的小鼠单倍体神经干细胞消化为单细胞，离心后去除上清；

S112：用神经培养基础培养基重悬细胞沉淀并进行悬浮培养，24小时内观察单倍体神经干细胞重聚成3D球状结构；

S113：用神经培养基础培养基添加2μM SB-431542(MCE, HY10431,USA) 和DMH1(MCE, HY12273, USA)悬浮诱导3D球状结构 7天后贴壁培养继续诱导8天，待神经花环样结构明显形成；

S114：采用毛细针将神经管样结构切下，随培养基转移至15ml离心管中自然沉降，用神经培养基础培养基添加2μM SB-431542(MCE, HY10431,USA) 、DMH1(MCE, HY12273,USA)和2%的B27的培养基重悬神经管样的细胞球样沉淀，继续悬浮培养2-3天，即可自组织形成球状的前脑背侧类脑器官。

[0011]与现有技术相比，本发明的一个方面具有如下有益效果：

本发明将BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，再经过分离培养建立体内来源的小鼠单倍体神经干细胞，最后通过体外培养形成单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官，异质性较小，有助于功能基因的探索，系统的解析神经退行性疾病发生的机制；

本发明对建立的小鼠单倍体神经干细胞以及获得的小鼠类脑器官均进行了鉴定，可以提高小鼠类脑器官制作的可靠性。

附图说明

[0012]图1为本发明从小鼠体内解剖的E8.5胚胎图，左边为E8.5嵌合胚胎图，右边为E8.5野生型胚胎图，比例尺为100μm；

图2为本发明嵌合胚胎来源的小鼠单倍体神经干细胞图，比例尺为100 μm；

图3为本发明利用流式分选对建成的小鼠神经干细胞系进行第一次单倍体分选流式图；

图4为本发明建立的小鼠单倍体神经干细胞系的DNA含量流式图；

图5为本发明小鼠单倍体神经干细胞表达神经谱系特异性标志物PAX6、SOX1、NESTIN图，比例尺为50μm；

图6为本发明小鼠单倍体神经干细胞来源的类脑器官，比例尺为100μm；

图7为小鼠单倍体神经干细胞来源的类脑器官表达神经谱系特异性标志物PAX6和TUJ1图，比例尺为50μm。

具体实施方式

[0013]下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

[0014]以下给出一个或多个方面的简要概述以提供对这些方面的基本理解。此概述不是所有构想到的方面的详尽综览，并且既非旨在指认出所有方面的关键性或决定性要素亦非试图界定任何或所有方面的范围。其唯一的目的是要以简化形式给出一个或多个方面的一些概念以为稍后给出的更加详细的描述之序。

[0015]一种体内来源单倍体细胞制作类脑器官的方法，包括以下步骤：

步骤一：将BCL2过表达（BCL2-OE）的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，并将重构胚胎移植回0.5天假孕母鼠的输卵管中，在胚胎发育到E8.5天时进行解剖，分离体节组织，如图1所示，为从小鼠体内解剖的E8.5胚胎，左为E8.5嵌合胚胎图（供体细胞为BCL2过表达的 haESCs），右为E8.5野生型胚胎图，比例尺为100 μm；

步骤二：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中，获得形态标准的小鼠单倍体神经干细胞，如图2所示，并通过流式分选富集单倍体细胞，建立小鼠单倍体神经干细胞系，如图3、图4所示，图3、图4中单倍体（1n）峰比例代表单倍体的G0/G1时期细胞占总细胞数的比例；

步骤三：对小鼠单倍体神经干细胞特异性标志物进行鉴定，如图5所示为小鼠单倍体神经干细胞表达神经谱系特异性标志物PAX6、SOX1、NESTIN图，比例尺为50μm；

步骤四：将获得的小鼠单倍体神经干细胞系培养于类脑培养液中，经过生长和空间折叠获得单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官，如图6所示；

步骤五：对小鼠类脑器官进行鉴定，如图7所示，为小鼠单倍体神经干细胞来源的类脑器官表达神经谱系特异性标志物PAX6和TUJ1图，比例尺为50μm。

[0016]1、步骤一也即嵌合胚胎的获得，包括以下步骤：

S1：对性成熟的ICR母鼠进行超数排卵处理，即向母鼠腹腔注射5 IU的PMSG，48小时后注射5 IU的hCG，并与公鼠进行合笼，第二天见栓，的母鼠用于获取受精卵，见栓当天定为E0.5；

S2：在每个4-8细胞周期的受精卵胚胎中注射8-12个BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞以获得重构胚胎；

S3：将重构胚胎移植到0.5天假孕母鼠的输卵管中，继续饲养至E8.5天；

S4：在E8.5天将假孕母鼠处死，用无菌器械分离子宫，在体式镜下分离胚胎，剖出E8.5的完整胚胎，用解剖针分离该胚胎体节区域。

[0017]2、步骤二也即从E8.5嵌合胚胎中获得单倍体神经干细胞，包括以下步骤：

S11：将分离后的体节组织培养于神经干细胞培养基中每3-5天使用0.05% 的胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化传代形成细胞悬液；

具体的，将分离后体节组织用0.05%的trypsin-EDTA（品牌Thermo，货号25200062）消化后，种在预铺Metrigel（品牌BD，货号354230）的24孔板中，并培养于神经干细胞培养液中，每天进行半量换液，并在显微镜下观察神经干细胞的形成，每3-5天进行传代；

其中每100 mL的小鼠神经干细胞培养基配方如下：

100 mL Ndiff medium （品牌Takara，货号Y40002）

10 ng/mL bFGF（品牌Pepro Tech，货号10018B）

10 ng/mL mEGF（品牌Pepro Tech，货号31509）；

S12：采用荧光染料对消化后的细胞悬液进行染色；

具体的包括以下步骤：

配置DNA染液，用神经干细胞培养基将Hoechst33342（品牌Thermo FisherScientific，货号H3570）稀释至3μg/ml，每1×106细胞需要准备3ml染液，在37℃水浴锅中预热，注意避光；

将嵌合小鼠来源的单倍体神经干细胞和野生型神经干细胞分别用0.05%Trypsin-EDTA在37℃消化3 min，将细胞消化为单细胞，加入MEF培养基（DMEM+10%FBS）终止消化后，1200rpm离心3min收集细胞，弃掉上清；

S13：通过流式分选富集单倍体1n峰，建立小鼠单倍体神经干细胞系；

具体的包括以下步骤：

用已预热的DNA染液重悬细胞沉淀，置于37 ℃水浴锅中避光孵育20-25min，期间每5min晃动离心管，避免细胞沉底；

1200rpm离心3 min 收集细胞，弃掉上清，加入500μl的神经干细胞培养基重悬细胞，用40μl孔径细胞筛过滤，将细胞悬液过滤到5 ml流式管（品牌Falcon, 货号352054）中，取新的流式管并加入1ml新鲜的神经干细胞培养液作为收集管；

用野生型神经干细胞作为二倍体对照圈门，用流式细胞仪将新建立的单倍体神经干细胞中的单倍体（1n）峰细胞分选到收集管中；

将收集的单倍体细胞转移到15ml离心管中，1200rpm离心3min收集细胞，在神经干细胞培养基中继续培养。

[0018]3、步骤三也即对小鼠单倍体神经干细胞特异性标志物进行鉴定，通过免疫荧光染色检测了神经干细胞标志物蛋白的表达，包括PAX6 (品牌ABclonal, 货号A7334) ，SOX1(品牌CST, 货号4194S) ，NESTIN (品牌ABclonal, 货号A11861)，PAX6，SOX1，NESTIN也称为一抗，具体方法包括以下步骤：

1）将细胞在爬片上培养后，用4％多聚甲醛（PFA）将细胞在室温固定15 min，用0.3％Triton X-100/2%BSA在室温封闭打孔一小时；

2）用封闭打孔液分别将一抗PAX6 (品牌ABclonal, 货号A7334) 、SOX1 (品牌CST, 货号4194S) 、NESTIN (品牌ABclonal, 货号A11861)按照说明书建议比例将一抗稀释按照1:200稀释，室温孵育1 h，PBS洗3次，每次10min将一抗洗掉；

3）用封闭打孔液按照说明书建议比例将二抗稀释将二抗Cy3 goat anti-rabbit(品牌ABclonal, 货号AS007)按照1：200稀释，室温孵育1 h，PBS洗3次，每次10min将二抗洗掉；

4）用5μg/ml的Hoechst染细胞核，室温15 min；PBS洗3次，每次10 min将Hoechst洗掉；

5）用防荧光淬灭剂封片后即可在激光共聚焦显微镜下观察蛋白的表达情况。

[0019]其中封闭打孔液为0.3%的Triton X-100（Sigma，T8787）和3%BSA（Sigma，A1933）混合液。

[0020]4、步骤四也即获得单倍体神经干细胞来源的类脑器官，包括以下步骤：

S111：将状态良好的小鼠单倍体神经干细胞消化为单细胞，离心后去除上清；

S112：用神经培养基础培养基（Ndiff medium）重悬细胞沉淀并进行悬浮培养，24小时内观察单倍体神经干细胞重聚成3D球状结构；

S113：用添加了2μM SB-431542 (MCE, HY10431,USA)和DMH1(MCE, HY12273,USA)的Ndiff medium悬浮诱导3D球状结构7天后贴壁培养继续诱导8天，待神经花环样结构明显形成；

S114：采用毛细针将神经管样结构切下，随培养基转移至15ml离心管中自然沉降，用添加了2μM SB-431542 (MCE, HY10431,USA)、DMH1(MCE, HY12273, USA)和2%的B27的Ndiff medium重悬神经管样的细胞球样沉淀，继续悬浮培养2-3天，即可自组织形成球状的前脑背侧类脑器官。

[0021]5、步骤五也即对小鼠类脑器官进行鉴定，通过免疫荧光染色进行了鉴定，具体方法包括以下步骤：

1）将已诱导成型的类脑器官置于包埋小室中并加入OCT覆盖所有的类器官，用1ml注射器的针头将类脑器官位置调整至中央，包埋小室转移-80℃冰箱过夜冻存；

2）将切片机的内部温度及刀头调至-20～-22℃，取出切片机内部的底座，涂抹一层厚度均匀的OCT，随后将速冻好的包埋小室倒扣于OCT中，迅速将其放至于速冻台，调整切片厚度为10µm/片，收集所有切片样本至切片盒，放至-20℃冰箱保存；

3）取出带有冰冻切片的玻片，应用PBS将玻片浸没后置于摇床漂洗3次，每次5分钟，漂洗完成后用滤纸吸干玻片上残留的液体。使用防水笔在样本的边缘画圈以分割染色区域；

4）用2%的Triton溶液和5%的BSA按照1:1体积混合，配制打孔-封闭混合液，将打孔-封闭混合液逐滴加在样本上方，室温封闭2小时；

5）应用打孔封闭液按照1:200～1:1000的比例配制一抗PAX6(品牌ABclonal, 货号A7334)以及TUJ1 (品牌Abcam, 货号ab7751)稀释液（PAX6和TUJ1），将玻片放入湿盒并向玻片各区域加入20-40μl一抗稀释液，盖上湿盒的盖子，放入4℃冰箱孵育24 h；

6）吸去一抗稀释液，加入PBS漂洗，漂洗3次，每次5分钟；应用打孔封闭液按照1:200的比例配制二抗Cy3 goat anti-rabbit (品牌ABclonal, 货号AS007)以及FITC goatanti-mouse (品牌ABclonal, 货号AS001)稀释液，将玻片放入湿盒并向玻片各区域加入20-40μl二抗稀释液，盖上湿盒的盖子，放入4℃冰箱孵育过夜；

7）吸去二抗稀释液，加入PBS漂洗，漂洗3次，每次5分钟；应用PBS按照1:2000的比例配置核染料，向玻片各区域加入20-40μl核染料，室温避光孵育30 min；

9）吸去核染料，加入PBS漂洗，漂洗3次，每次10分钟；滴加适量封片剂进行封片，将封好片的玻片避光保存，自然风干4-6小时。

[0022]其中封闭打孔液为0.3%的Triton X-100（Sigma，T8787）和3%BSA（Sigma，A1933）混合液。

[0023]本发明将BCL2过表达的小鼠单倍体胚胎干细胞通过胚胎注射的方法获得重构胚胎，再经过分离培养建立体内来源的小鼠单倍体神经干细胞，最后通过体外培养形成单倍体神经干细胞来源的小鼠类脑器官，异质性较小，有助于功能基因的探索，系统的解析神经退行性疾病发生的机制；且本发明对建立的小鼠单倍体神经干细胞以及获得的小鼠类脑器官均进行了鉴定，可以提高制作的可靠性。

[0024]前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。