1.用于检测膀胱癌的胞外囊泡生物标志物，其特征在于，所述标志物由胞外囊泡膜蛋白GLUT1，以及任选胞外囊泡膜蛋白MUC-1、CCDC25中的一种或多种组成。

2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述标志物由胞外囊泡膜蛋白GLUT1、MUC-1和CCDC25组成。

3.一种用于检测权利要求1-2任意一项所述生物标志物的试剂，其特征在于，所述试剂包括具有核壳结构的纳米水凝胶，所述核选自具有过氧化物酶功能的金属纳米颗粒，所述金属纳米颗粒表面经双键修饰，所述壳包括交联聚合的水凝胶壳层，且水凝胶壳层表面连接有胆碱磷酸单体，水凝胶壳层具有容纳过氧化物酶底物的活性位点的多孔结构。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述具有过氧化物酶功能的金属纳米颗粒选自铂纳米颗粒、金纳米颗粒、氧化铈纳米颗粒中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述交联聚合的水凝胶选自丙烯酰胺聚合物、烷基丙烯酰胺聚合物或者N-烷基丙烯酰胺聚合物中的一种或多种。

6.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述交联聚合的水凝胶通过自由聚合法形成水凝胶壳层。

7.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测样本中权利要求1中所述的标志物的表达水平，所述样本选自血液、血浆、血清、尿液。

8.一种诊断膀胱癌的试剂盒或芯片，其特征在于，其包括权利要求3-7任意一项所述的试剂。

9.根据权利要求1-2任意一项所述的生物标志物在制备诊断膀胱癌、膀胱癌术后监测的产品中的应用。

10.根据权利要求3-7任意一项所述的试剂或权利要求8所述的试剂盒或芯片在制备诊断膀胱癌、膀胱癌术后监测的产品中的应用。

技术领域

[0001]本发明属于疾病诊断技术领域，具体涉及一种用于检测膀胱癌的胞外囊泡生物标志物及其诊断试剂。

背景技术

[0002]膀胱癌(BC)是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，其五年生存率与肿瘤分期密切相关，从原位癌的95.8％下降到转移癌的4.6％，这一事实强调了膀胱癌患者进行早期诊断和预后的重要性。目前，膀胱镜检查和细胞学检查是膀胱癌最常用的诊断方法(参见Witjes,J.A.；Douglass,J.,The role of hexaminolevulinate fluorescence cystoscopyinbladder cancer.Nat.Clin.Pract.Urol.2007,4,542-549)。然而，膀胱镜诊断具有很强的侵入性，且很难检测到早期的微小肿瘤。细胞学检查是一种公认的BC诊断和复发检测方法。然而，它对早期肿瘤的敏感性和特异性较差，这些肿瘤的特点是细胞间粘附性强，剥离能力弱(参见Tilki,D.；etal.,Urine Markers for Detection and Surveillance ofNon–Muscle-Invasive Bladder Cancer.Eur.Urol.2011,60,484-492.)。CN117604109A公开了用于膀胱癌诊断和预后判断的生物标志物，其借助循环肿瘤细胞的生物标志物KANK2和/或TBX1进行诊断，但是循环肿瘤细胞数量稀少，难以获取并准确的检测。EP4306658A2公开了诊断膀胱癌的方法，该方法包括：(a)将得自受试者的尿液样品的DNA用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化，得到限制性内切核酸酶处理的DNA；(b)从限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增至少一个包含SEQ ID NO:1所示基因座的限制性基因座和对照基因座，从而产生每个基因座的扩增产物；(c)测定每个产生的扩增产物的信号强度；(d)计算每个所述至少一个限制性基因座和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；(e)检测所述比率相对于相应膀胱癌参考比率的高概率分数，从而鉴定所述人类受试者中的膀胱癌。但尿样含有相对低量的DNA，且检测所述比率相对于相应膀胱癌参考比率的高概率分数来获得，其准确性不易保证。另外，W02013/144362公开了用于膀胱癌的诊断测定，其涉及检测ECRG4和/或ITIH5基因的启动子的甲基化。US2013224738描述了用于膀胱癌的诊断测定，其涉及评估由BCL2、CDKN2A和NID2组成的基因的甲基化状态。虽然DNA甲基化生物标志物分析的灵敏度和特异性较高，但是受于技术限制和具有癌症特异性的靶标的衍生，且检测结果还不能获得通过膀胱镜检查的性能特征。同时，目前已有部分商业化开发尿液中存在特定蛋白的检测试验，如包括人补体因子H相关蛋白、癌胚抗原(CEA)、膀胱肿瘤细胞相关粘蛋白和核有丝分裂装置蛋白22(NMP22)，但是每次测定检测到的蛋白质数量较低，并且特异性和敏感性仍然不令人满意(参见Tilki D,etal，:Urine markers for detection andsurveillance of non-muscle-invasive bladder cancer.Eur Urol 2011,60:484-492.)。因此，现有方法无法满足对早期BC进行可靠且非侵入性的临床需求。

[0003]细胞外囊泡(EVs)是磷脂双层封闭结构，大小从30纳米到几微米不等，由细胞分泌并释放到血清、尿液和唾液等体液中。EVs从来源细胞继承了特定的分子信息而被认为是“液体活检”的癌症生物标志物。BC来源于膀胱粘膜，因此BC细胞分泌的EV会直接释放到尿液中。已经表明，在检测膀胱疾病方面，尿液EV(uEV)表现出比传统生物标志物更高的灵敏度和特异性。酶联免疫测定(ELISA)是EV蛋白检测的传统方法。然而，尿液中EV含量很低，低于传统ELISA的检测灵敏度。目前，已经开发了一系列用于EV蛋白检测的方法，包括暗场显微镜、热泳适体传感器(TAS)、荧光测定、和表面增强拉曼散射(SERS)。这些方法依赖于定制的实验室仪器，而且无法进行生物标志物的高通量筛选。

[0004]无机纳米酶因其高催化效率和良好的稳定性而被广泛应用于生物医学研究，在ELISA中的信号放大方面优于生物酶(如辣根过氧化物酶、HRP)。为了赋予纳米酶对靶蛋白的特异性识别，纳米酶的表面通常用抗体或适配体进行修饰。考虑到纳米酶的催化活性取决于表面的活性位点，这些表面修饰策略可能会损害其酶活性。已经有多种基于抗体或适配体制备的纳米探针用于EV蛋白生物标志物的多重分析。然而，由于EV的小尺寸和靶蛋白的低拷贝数(通常为每个EV 1-5个)，只有少数纳米探针可以被EV膜蛋白识别，从而导致假阴性结果。因此，迫切需要获得高效准确的尿液EV相关生物标志物，以及开发新的信号放大策略，使用临床现有的仪器和程序对uEV相关生物标志物进行高通量筛选和高灵敏度检测。

发明内容

[0005]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测膀胱癌的胞外囊泡生物标志物及其诊断试剂，该标志物能够准确区分膀胱癌同其它泌尿性疾病如膀胱炎、肾癌，具有高度的诊断特异性以及灵敏度，能够用于膀胱癌的临床诊断。同时本发明的胆碱磷酸接枝包覆的纳米酶探针允许模板分子预先与纳米酶的活性位点结合，然后通过表面聚合反应在纳米酶上包封一层功能聚合物。去除模板后，纳米酶的有效位点重新暴露于新的模板分子中，具有更高的选择性和灵敏度，能显著提高信号背景信噪比，能够满足对痕量EV生物标志物进行准确检测的需求。而且本发明提供了一种膀胱癌无创检查的方法，为患者提供早诊、BC进展简便可行的临床诊断方法。

[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007]本发明首先提供用于检测膀胱癌的胞外囊泡生物标志物，所述标志物由胞外囊泡膜蛋白GLUT1，以及任选胞外囊泡膜蛋白MUC-1、CCDC25中的一种或多种组成。

[0008]优选由胞外囊泡膜蛋白GLUT1和MUC-1组成的生物标志物组，或由胞外囊泡膜蛋白GLUT1和CCDC25组成的生物标志物组。进一步优选由胞外囊泡膜蛋白GLUT1、MUC-1和CCDC25组成的生物标志物组。

[0009]另一方面，本发明还提供检测膀胱癌的试剂，其能够检测样本上述标志物的表达水平，所述样本选自血液、血浆、血清、尿液，优选尿液。

[0010]本发明用于检测上述生物标志物的试剂，优选包括具有核壳结构的纳米水凝胶，所述核选自具有过氧化物酶功能的金属纳米颗粒，所述金属纳米颗粒表面经双键修饰，所述壳包括交联聚合的水凝胶壳层，且水凝胶壳层表面连接有胆碱磷酸单体，水凝胶壳层具有容纳过氧化物酶底物的活性位点的多孔结构。

[0011]所述双键为碳碳双键。

[0012]所述具有过氧化物酶功能的金属纳米颗粒选自铂纳米颗粒、金纳米颗粒、氧化铈纳米颗粒中的一种或多种，优选铂纳米颗粒。所述铂纳米颗粒的粒径为1-20nm，优选3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm。

[0013]所述交联聚合的水凝胶选自丙烯酰胺聚合物、烷基丙烯酰胺聚合物或者N-烷基丙烯酰胺聚合物中的一种或多种，优选丙烯酰胺聚合物。

[0014]本发明交联聚合的水凝胶通过自由聚合法形成水凝胶壳层，具体地，通过金属纳米颗粒表面的双键与可聚合双键的交联剂发生聚合反应，使交联剂聚合至金属纳米颗粒表面形成水凝胶，同时胆碱磷酸单体连接在所形成的水凝胶壳层表面上。优选通过丙烯酰胺或其衍生物、交联剂和自由基引发剂在水中的水性自由基聚合来制备纳米水凝胶。

[0015]可聚合双键的交联剂选择酰胺类化合物，如丙烯酰胺聚合物、烷基丙烯酰胺聚合物或者N-烷基丙烯酰胺聚合物，优选自丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、叔丁基丙烯酰胺、N,N-二丙基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺中的至少一种。

[0016]在一些实施方案中，本发明制备水凝胶的有机单体也可以选自乙烯基单体、丙烯酸单体或其两种或更多种的组合。乙烯基单体包括乙烯醇、N-乙烯基-己内酰胺、N-乙烯基-吡咯烷酮、N-乙烯基-乙酰胺、N-乙烯基-甲酰胺和N-乙烯基-异丙基酰胺、乙烯基吡啶、或其两种或更多种的组合。丙烯酸单体包括甲丙烯酸、甲基丙烯酸、基丙烯酸2-羟基-乙基酯(HEMA)、2-羟基-乙基-丙烯酸酯(HEA)、甲基丙烯酸羟基丙基酯、甲基丙烯酸甘油酯、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、或其两种或多种的组合。

[0017]在实施方案中，水凝胶壳层具有容纳过氧化物酶底物的活性位点的多孔结构，该多孔结构为多孔网状结构，优选该多孔结构与金属纳米颗粒表面相通或连接，优选该多孔结构与金属纳米颗粒表面有效结合位点相连；优选该孔穴为氧化物酶底物分子印迹的多孔结构，其能与底物分子(如TMB)的形状、大小、电荷形成互补；

[0018]所述胆碱磷酸单体具有下式1结构：

[0019]

[0020]所述式1胆碱磷酸单体，R选自C1-C10烷基或甲氧基乙醇，优选甲基、乙基、丙基、异丙基或正丁基。

[0021]本发明的纳米水凝胶具有负电荷，其zeta电位为-8mV至-20mV之间，优选-10mV、-11mV、-12mV、-13mV、-14mV、-15mV、-16mV、-17mV，所述纳米水凝胶粒径约在6-50nm之间，优选7nm、8nm、10nm、12nm、14nm、16nm、18nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm。

[0022]本发明的纳米水凝胶的酶活性Michaelis常数(Km)为180-300μM，优选200-280μM、210-240μM，和催化常数(kcat)为5-20s-1，优选6-18s-1，8-15s-1，10-15s-1，11-15s-1。

[0023]本发明还提供纳米水凝胶的制备方法，其包括：(1)将金属纳米颗粒溶液与过氧化物酶的底物和具有双键修饰的原料(如甲基丙烯酸2-氨基乙酯、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐)反应，制得表面经双键修饰的金属纳米颗粒，以及纳米颗粒表面结合底物分子的活性结合位点。

[0024](2)用自由基聚合法将步骤1的纳米颗粒包裹有经胆碱磷酸修饰的的纳米水凝胶层

[0025]优选，将步骤(1)制备的经修饰的金属纳米颗粒溶液与胆碱磷酸单体(CP单体)和双键交联剂(如双丙烯酰胺)混合，然后再加入引发剂(过硫酸铵和TEMED)，进行聚合反应制得核壳结构的纳米水凝胶，其中金属纳米颗粒(PtNP)核周围产生了纳米水凝胶壳层，且凝胶壳层表面连接有胆碱磷酸单体。

[0026]优选步骤1制备的纳米材料(ml)：胆碱磷酸单体(mg)：交联剂(mg)：过硫酸铵(mg)：TEMED(ml)的比例为5：55：2.5：2：0.005。

[0027](3)将步骤(2)制备的纳米水凝胶，加入过氧化物除去底物模板即得。优选加入H2O2使其与底物模板的TMB反应，再多次冲洗，制得具有TMB印迹的纳米水凝胶。

[0028]本发明还提供一种诊断膀胱癌的试剂盒或芯片，其包括上述的试剂。

[0029]本发明还提供上述的生物标志物在制备诊断膀胱癌、膀胱癌术后监测的产品中的应用。

[0030]本发明还提供上述试剂或上述的试剂盒或芯片在制备诊断膀胱癌、膀胱癌术后监测的产品中的应用。

[0031]本发明还提供用于诊断膀胱癌或膀胱癌术后监测的装置，其包括以下模块：

[0032]检测模块：检测样本中上述胞外囊泡膜蛋白的生物标志物GLUT1、MUC-1以及CCDC25的表达水平；

[0033]分析模块：将上述检测得到的生物标志物表达水平作为输入变量，输入预测或者诊断膀胱癌的诊断模型进行分析；

[0034]评估模块：输出样本对应的个体患膀胱癌癌的诊断结果。

[0035]所述诊断模型选自核方法(例如，SVM)、多维量表(MDS)、非参数方法(例如，k最近邻分类器)、判别分析(DA)(例如，线性DA、二次DA、正则化DA)、判别函数分析(DFA)、PLS(偏最小二乘法)、广义线性模型(例如，逻辑回归)、基于树的方法(例如，逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting/Bagging方法)、基于主成分的方法(例如，SIMCA)、广义相加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。优选主成分分析、逻辑回归分析、最近邻分析、支持向量机、神经网络模型、随机森林，更优选基于梯度下降的逻辑回归分析法。

[0036]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0037]1、本发明发现了膀胱癌(BC)的3个尿液中胞外囊泡(uEV)膜蛋白生物标志物，如MUC-1,CCDC25或GLUT1。在临床验证队列(n＝99)中，这些生物标志物的组合对BC的诊断灵敏度达到98％，远远高于基于尿液细胞学(56％)或多种尿液蛋白(62％)的诊断灵敏度，能够准确区分膀胱炎和肾癌，能够用于膀胱癌的临床诊断。同时本发明免疫检测结果可以被用于评估手术中肿瘤组织是否已被完全切除。

[0038]2、本发明采用分子印迹聚合物(MIPs)允许模板分子预先与纳米酶的活性位点结合，然后通过表面聚合反应在纳米酶上包封一层功能聚合物。去除模板后，纳米酶的有效位点重新暴露于新的模板分子中，能够进行高选择性和灵敏的检测。

[0039]3、本发明的胆碱磷酸接枝包覆的纳米酶探针，尤其是Pt@CPs探针可以通过安装在纳米酶上的CP和EVEV膜上的“CP反向”磷脂酰胆碱(PC)之间的非特异性多价相互作用快速吸附到EV表面，EV表面PC的丰度远高于膜蛋白，大量的Pt@CP探针可以与EVEV表面结合以产生比传统ELISA中基于抗体-抗原识别的探针更强的信号。同时，CP是具有防污效果的两性离子部分基团，从而避免了对Pt@CPs在测定基质上信号的干扰。因此基于Pt@CP-based构建的免疫测定方法提供了高的信号背景信噪比，以满足对痕量EVEV生物标志物进行检测的要求需求。

[0040]4、本发明基于Pt@CPs的免疫检测与商业ELISA检测条件和所需仪器完全兼容，且具有更高的检测灵敏度、更低的成本和易操作性，因此可以很容易地纳入临床工作流程，用于BC进展的无创监测。

附图说明

[0041]图1本发明纳米酶@CPs的制备、表征和催化活性测试，其中(a)为纳米酶@CPs合成的示意图，通过MIP将两性离子CP修饰在纳米酶表面；(b)PtNPs的DLS数据，粒径的增加可用于评估Pt@CPs的成功制备；(c)ζ电位数据；(d)和(e)显示了PtNPs和Pt@CPs的催化活性对比；(f)Pt@CPs的TEM图像具有清晰的核壳结构特征；(g)游离PtNP或Pt@CPs与TMB孵育30分钟后，反应溶液的UV-vis光谱；(h)通过652nm处的吸光度监测TMB氧化动力学；(i)三种纳米酶和MIP纳米凝胶包裹的纳米酶的催化速率。在25℃的柠檬酸盐缓冲液中，在10mM H2O2的催化下，所有测试样品都含有相同浓度的纳米酶(1nM)和TMB(0.5mM)。

[0042]图2纳米酶@CPs的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)；

[0043]图3Pt@CPs可作为免疫检测的通用EV探针。(a)通过Pt@CPs构建的免疫检测方法检测uEV的示意图；(b)EV与Pt@CPs孵育后的代表性TEM图像。(c)定量Pt@CPs与单EV(n＝21)孵育后，Pt@CPs吸附在EV膜上的数量；(d)Pt@CPs滴定以最大限度地提高免疫测定中的信噪比；(e)常规ELISA检测EV蛋白示意图；(f)基于Pt@CPs构建的免疫检测方法的灵敏度高于常规ELISA法；(g)基于Pt@CPs构建的免疫检测方法检测三种类型样本中CD63的表达水平：i)PBS,ii)使用PBS进行稀释的标准EVs,iii)被裂解以破坏其膜结构，然后使用PBS进行稀释的标准EVs；(h)捕获抗体分别为CD63、CD9、CD81和MUC-1的免疫分析方法检测外泌体膜蛋白，检测抗体分别为Ab1/HRP-Ab2和Pt@CPs。

[0044]图4Pt@CPs和PtNP孵育细胞变色对比图。

[0045]图5传统ELISA法中单个EV上特定蛋白的拷贝数。

[0046]图6紫外分光光度法Pt@CPs稀释曲线。

[0047]图7不同保存时间Pt@CPs构建的免疫检测方法测定结果的可重复性评估。

[0048]图8本发明Pt@CPs对不同临床样本的EV检测。

[0049]图9本发明Pt@CPs检测EJ细胞胞外囊泡不同浓度下的CD63、CD9、CD81和MUC-1表达水平的校准曲线。

[0050]图10细胞系中BC生物标志物的筛选，其中图(a)(b)和(c)分别是EJ、T24、5637细胞系衍生的EVs的NTA结果和TEM图像。比例尺:100nm；图(d)Western blot检测BC细胞系来源的EVs表面CD9、CD63和CD81的表达。图(e)Pt@CP-based免疫分析来自BC细胞系(EJ,T24,5637和BIU87)和正常膀胱上皮细胞系(SV)的EVs中的生物标志物表达水平；图(f)等蛋白量(30μg)使蛋白质印迹法分析来自5个细胞系的EVs中的生物标志物表达；图(g)雷达图显示了通过Pt@CP-based免疫检测法分析的EVs上的生物标志物表达谱。

[0051]图11本发明Pt@CPs对不同尿液检测样本的uEVs的检测能力。

[0052]图12本发明基于EV分析的BC检测。(a)肿瘤组织图像和(b)uEV分析。分别使用免疫组化和基于Pt@CP构建的免疫检测方法评估肿瘤组织和尿液样本中的3个BC蛋白标志物(MUC-1,CCDC25和GLUT1)。显示了两个典型患者的数据。误差条，均值±标准误差(n＝3)；(c)分析了8例BC患者的肿瘤组织(左)和uEV样本(右)中MUC-1,CCDC25和GLUT1的表达水平。分别使用蛋白质印迹法和基于Pt@CP构建的免疫检测方法评估肿瘤组织和尿液样本中的标志物(MUC-1,CCDC25和GLUT1)。肿瘤组织中相对蛋白标志物表达水平由条带的强度表示；(d)分析了48例BC患者术前、27例膀胱炎患者和24例健康对照者的尿液样本。基于Pt@CP的免疫测定方法测定了MUC-1,CCDC25和GLUT1的表达水平；(e-g)BC患者中所选标志物的平均水平高于膀胱炎患者或健康对照者。(h)EVBC是基于梯度下降的逻辑回归确定的三个标志物水平(MUC-1,CCDC25和GLUT1)的加权和；(i)每个BC标志物和EVBC的ROC曲线，AUC：曲线下面积。

[0053]图13本发明基于Pt@CP免疫分析的BC患者纵向样本检测。(a)术前和术后(第2周)的纵向尿液收集。(b)分析了BC患者术前和术后的尿液样本(n＝9)，其中总EV浓度没有显著变化(P＝0.491，配对双侧t检验)。图中的每个数据点代表三个重复的平均值；(c)uEV分析显示所有患者的EVBC值均降低(P<0.001，配对双侧t检验)。虚线绿线表示EVBC的临界值；(d)手术前后的膀胱镜照片(左)，手术切缘的H&E染色(右)。H&E染色显示手术切缘仍有残留肿瘤组织，这意味着患者可能需要二次手术；(e)手术前后的膀胱镜照片(左)，手术切缘的H&E染色(右)。H&E染色显示手术切缘无残留肿瘤组织。

[0054]图14本发明Pt@CPs检测的标志物区分腺性膀胱炎和膀胱癌的ROC曲线。

[0055]图15肾脏疾病对本发明生物标志物诊断膀胱癌的影响。

具体实施方式

[0056]下面将通过实施例对本发明作进一步完整表述，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

[0057]实施例1

[0058]胆碱磷酸单体(CP)的制备

[0059]将0.08摩尔异丙醇，0.12摩尔甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，200毫克对苯二酚甲醚和50毫升乙腈在氩气保护下加入到单口瓶中，然后降温到-55℃。随后逐滴加入0.05摩尔2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷，并继续反应。反应体系转移至室温过夜后，将反应体系置于-20℃孵育30分钟，过滤沉淀后将反应温度升高到70～75℃继续反应。反应结束后冷却至室温，使用过量乙醚沉淀得到白色固体，随后用四氢呋喃洗涤，待洗涤上清澄清后真空干燥获得产物，即得胆碱磷酸单体(CP)。

[0060]实施例2

[0061]金属纳米颗粒(纳米酶)的制备

[0062]铂纳米颗粒(PtNPs)的制备：在38.5mL去离子水中加入0.5mL六水氯铂酸(1.44％，m/V)。在搅拌状态下向上述溶液中添加1mL柠檬酸钠水溶液(40mM)，然后将0.8mL新鲜制备的50mM硼氢化钠水溶液快速注入混合液中，反应10min后获得5nmPtNPs,4℃保存备用。

[0063]金纳米颗粒(AuNPs)的制备：将0.5mL氯金酸三水合物(1％，m/V)添加到38.5mL去离子水中。在搅拌状态下向上述溶液中添加2mL(38.8mM)柠檬酸钠水溶液；2min后，将1mL新鲜制备的20mM硼氢化钠水溶液快速注入混合液中，反应10min后，得到5nm的AuNPs，并在4℃下保存以备使用。

[0064]氧化铈纳米颗粒(CeNPs)的制备：将2.74g(NH4)2Ce(NO3)6以及10gCH3COONa溶于50ml去离子水中，然后向该溶液中加入10ml冰醋酸，并在室温下搅拌2h，加热反应，制得5nm的AuNPs，并在4℃下保存以备使用。

[0065]铂纳米颗粒(PtNPs)、氧化铈纳米颗粒(CeNPs)和金纳米颗粒(AuNPs)为类似过氧化物酶的纳米酶，其尺寸在1-20nm纳米的范围，代表了具有强大的过氧化物酶样活性的纳米酶。将TMB和H2O2与相同浓度的上述纳米酶混合，所有的纳米酶都可以在几分钟内氧化TMB显示蓝色，表明这些纳米颗粒具有类似过氧化物酶的纳米酶，且在相同浓度(1nM)下，5nm的PtNPs显示出比CeNPs和AuNPs高得多的催化活性(参见图1i)。

[0066]实施例3

[0067]铂纳米酶@CP探针的制备

[0068](1)将实施例2中铂纳米颗粒(PtNPs)溶液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，过氧化物酶的底物)和甲基丙烯酸2-氨基乙酯孵育反应，制得表面经双键修饰的铂纳米颗粒，且该铂纳米颗粒表面结合底物分子(使模板分子预先与纳米颗粒酶形成活性结合位点)。

[0069]其中，纳米颗粒(ml)：甲基丙烯酸2-氨基乙酯(摩尔浓度)：TMB(摩尔浓度)的比例为5：0.01：0.01；

[0070](2)自由基聚合法合成胆碱磷酸修饰的纳米水凝胶

[0071]将步骤1制备的经修饰的铂纳米颗粒溶液与胆碱磷酸单体(CP单体)和双丙烯酰胺交联剂混合，然后再加入过硫酸铵和TEMED，室温搅拌聚合反应，随后透析除去多余的单体和引发剂，制得核壳结构的纳米水凝胶，其中铂纳米颗粒(PtNP)核周围产生了纳米水凝胶壳层，且凝胶壳层表面连接有胆碱磷酸单体。

[0072]其中，步骤1制备的纳米材料(ml)：胆碱磷酸单体(mg)：双丙烯酰胺(mg)：过硫酸铵(mg)：TEMED(ml)的比例为5：55：2.5：2：0.005。

[0073](3)将步骤2制备的纳米水凝胶，加入H2O2使其与底物模板的TMB反应，再多次冲洗，制得具有TMB印迹的纳米水凝胶，其中作为底物模板的TMB被除去以释放活性位点，水凝胶壳层形成多孔结构或多孔网状结构，形成的孔穴能与底物分子(如TMB)的形状、大小、电荷形成互补。

[0074]具体制备过程如图1a所示，其中表面的CP基团可以通过多价PC-CP相互作用吸附在EV表面，作为底物模板的TMB被除去以释放活性位点。

[0075]实施例4

[0076]金纳米酶@CP探针的制备：参照实施例3的方法制备，其中原料采用实施例2制备的金纳米颗粒替换铂纳米颗粒。

[0077]实施例5

[0078]氧化铈纳米酶@CP探针的制备：参照实施例3的方法制备，其中原料采用实施例2制备的氧化铈纳米颗粒替换铂纳米颗粒。

[0079]实验例1

[0080]纳米酶@CP探针的结构检测及表征，以实施例3的铂纳米酶@CP探针(Pt@CPs)为例，采用Malvern Zetasizer 3000HS动态光散射仪器分别测定包裹水凝胶前后的纳米粒径变化(参见图1b)，结果表明，包裹水凝胶后的Pt@CPs粒径约在6-25nm之间，相比PtNPs粒径增大。

[0081]采用zeta电位测定分别测定包裹水凝胶前后的纳米粒径变化(参见图1c的ζ-电势所示)，结果表明，包裹水凝胶后的Pt@CPs电位约为-13.7mV，相比PtNPs的电位下降明显。

[0082]采用透射电子显微镜(TEM)检测Pt@CPs的结构，图1f表明该纳米水凝胶具有清晰的核壳结构特征。

[0083]采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)检测Pt@CPs，图2表明其存在1725cm-1和1234cm-1处的吸收峰，这分别归因于CP单体中的P-O键和交联剂中的N–H键。

[0084]实验例2

[0085]纳米酶的活性检测，采用典型的过氧化反应，将100μl的TMB(0.5mM)溶液与100μl的PtNPs(10nM)或Pt@CPs(10nM)混合，在25℃下添加10mM H2O2后测定氧化TMB的吸光度(652nm)。采用不同浓度的TMB(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75和1mM)进行酶学参数鉴定。然后通过Beer定律:A＝ξcl(其中TMB的ξ＝39,000，L为光的路径长度，1cm)，将UV吸光度A转化为浓度c。对于所有的动力学，背景信号都被减去。通过对动力学曲线的初始线性区域进行直线拟合得到氧化速率(V)。根据Michaelis-Menten方程拟合得到Vmax和Km:V＝Vmax[S]/(Km+[S])，kcat通过Vmax＝kcat[E]计算得到，其中[S]和[E]分别代表TMB和纳米酶浓度。同时采用相同的方法测定AuNPs、Au@CPs，CeNPs以及Ce@CPs。

[0086]结果表明，当TMB(0.5mM)与相同浓度(1nM)的游离PtNPs或Pt@CPs持续孵育30分钟时，Pt@CPs在同一时间段内氧化的TMB比游离的PtNPs更多，因此显示出更深的蓝色和更高的吸光度(图1d、e和g)。在CeNPs v.s Ce@CPs，AuNPs v.sAu@CPs的测试中也观察到了类似的结果。本发明的方法获得了增强的纳米酶催化活性。接下来，比较了PtNPs和Pt@CPs的催化动力学(图1h)，也获得了类似的结果，Pt@CPs(纳米酶@CPs)显示出比相应的游离纳米酶(PtNPs)更高的活性。同时通过测量纳米酶在不同TMB浓度下的反应速率来获得催化参数(结果如图1i所示)。根据Michaelis-Menten模型，所制备的纳米酶和纳米酶@CPs的Michaelis常数(Km)和催化常数(kcat)如表1所示。Pt@CPs的各项指标远高于其他纳米酶@CPs探针。基于以上结果，Pt@CPs被视为用作EV标记的最佳探针。

[0087]表1纳米酶和纳米酶@CPs的Michaelis常数(Km)和催化常数(kcat)

[0088]

[0089]如上述结果，由于TMB底物带有正电荷，PtNPs、Pt@CPs带有负电荷，使得TMB能与上述纳米酶相互结合进而发生反应，如实验例1表明Pt@CPs相比PtNPs负电荷电位降低，而这种降低对两者的结合以及酶活性具有不利的影响。然而意外的发现，虽然Pt@CPs的电位降低，但是其酶活性却反而明显提高，本发明利用凝胶壳层形成分子印迹的多孔结构，在测定时，加入底物TMB，TMB就会钻入活性位点孔位，反应结束后，就会跑出来，新的底物TMB会再进去，反复循环，实现了信号放大。而与裸露的PtNPs，TMB底物是随机和纳米酶结合的，无法实现反复循环结合，导致结合效率低。

[0090]实施例6

[0091]基于Pt@CPs构建的免疫检测方法

[0092]首先，将抗体固定在酶标板孔底并与含有EVs的样品一起孵育，然后加入Pt@CPs作为捕获的EV的通用探针；最后添加TMB以产生读出信号(如图3a)。通过固定化抗体和EV上的膜蛋白之间的高度特异性相互作用，将EV捕获到酶标板孔底表面上。Pt@CPs由信号放大结构域(PtNP)和EV识别结构域(CP组成的纳米凝胶)组成。本发明纳米水凝胶壳层表面暴露的CP可以通过高亲和力的多价相互作用识别生物膜上的PC(磷脂酰胆碱)。为了验证这一点，将多聚甲醛固定的EJ细胞(膀胱癌细胞系)与1nM PtNP或Pt@CPs在室温下孵育30分钟，去除游离的纳米酶后，加入TMB用于细胞膜上的显色反应。如图4所示，Pt@CPs可以快速吸附到细胞表面以诱导产生的蓝色，而用相同浓度的PtNP孵育的细胞不会变蓝。

[0093]采用超速离心法从不含FBS的细胞培养基上清液的EJ细胞(人膀胱癌细胞)中收集EVs。将EV颗粒小心地重新分散到PBS中，通过BCA蛋白定量测定EV浓度为60μg/mL(6×109EVs)。将Pt@CPs与上述EV孵育后，Pt@CPs通过CP-PC相互作用均匀沉积在囊泡表面，而未改变EV形态(图3b)。在传统ELISA中，单个EV表面只能结合数种检测抗体进行信号放大，单个EV上特定蛋白(如CD63、EpCAM和EGFR)的拷贝数通常小于10拷贝(如图5)。基于PC-CP识别的策略允许23-189Pt@CPs吸附在每个EV上(如图3c)，从而大大提高了检测灵敏度。

[0094]接下来，进一步确定Pt@CP构建的免疫检测方法的分析能力。

[0095]在450nm测定吸光度分析Pt@CPs稀释曲线，表明本发明的方法具有很大的线性，方差很小(如图6)。随后进一步研究了Pt@CPs对免疫测定的信噪比和检测灵敏度的影响。将不同浓度的Pt@CPs与EV样品孵育，以确定在低EV浓度下最大化信号信噪比所需的探针浓度。结果表明Pt@CPs可以在广泛的浓度范围内实现高信噪比(>6)(图3d)。这些特征提高了Pt@CPs作为信号放大探针的冗余度，减少了实际操作中的可变因素，有利于复杂临床样本中EV蛋白生物标志物的高通量检测。

[0096]为了比较Pt@CP构建的免疫检测方法和传统ELISA的检测灵敏度，将含有不同浓度EVs的样本与CD63抗体修饰的96孔板孵育，然后与100μL Pt@CPs或CD63兔抗体(Ab1)/HRP标记的山羊抗兔IgG(HRP-Ab2)对同时孵育以进行信号放大(图3e)。结果显示Pt@CP构建的免疫检测方法比夹心法ELISA的检测限低38倍(图3f)。传统ELISA中使用的Ab1和HRP-Ab2需要低温保存(-20℃-80℃)，但保存不当会影响检测灵敏度。然而Pt@CPs作为一种包被水凝胶结构的金属纳米材料，在室温保存即可保持其较高的催化活性和稳定性。将制备的Pt@CPs在室温下保存1、7和28d后评估Pt@CP构建的免疫检测方法测定结果的可重复性。对于相同的标记，不同检测日检测到的信号在统计学上保持一致(图7)。将标准EV加入无EV血清或尿液中使用本发明的方法进行检测(如图8)后，在两个样本中观察到相似的信号变化，这意味着该检测法在临床样本中的通用性较高。

[0097]与传统ELISA难以区分可溶性蛋白和修饰在EV膜上的蛋白不同，Pt@CPs构建的免疫检测方法只检测表达在EV表面的蛋白，由于缺乏与Pt@CPs结合的磷脂膜结构，无法鉴定可溶性蛋白。如图3g所示，裂解后的EVs的信号强度与pbs样品一样弱。相反，在使用完整膜结构的标准EVs制备的样品中，观察到信号强度增加了3倍。这一结果突出了Pt@CP构建的免疫检测方法在检测EV蛋白标记方面具有高特异性和高灵敏度的独特特征。

[0098]在传统的ELISA系统中，针对非特异性表达的膜蛋白的捕获抗体被用来尽可能多的抓住EV然后使用Ab1识别目标EV蛋白，随后加入HRP-Ab2进行信号读取和放大。本发明筛选了用于检测多种胞外囊泡膜蛋白(CD63、CD9、CD81和MUC-1)的捕获抗体和Ab1/HRP-Ab2，并与Pt@CPs进行了灵敏度比较。结果表明，无论捕获抗体是什么，Pt@CPs均提供了比Ab1/HRP-Ab2对高得多的视觉信号，采用本发明的Pt@CPs作为通用探针，同时检测EJ细胞来源的EVs上CD63、CD9、CD81和MUC-1的表达水平。结果表明，Pt@CP构建的免疫检测方法的稀释曲线显示出良好的线性，方差很小(如图9所示)，这表明该免疫检测法可以灵敏地定量检测EV蛋白的表达水平。

[0099]上述结果表明，基于CP-PC相互作用，Pt@CPs可以吸附在所有EVs表面，本发明的纳米凝胶中PtNPs的过氧化物酶样活性可以放大免疫检测信号，这些优点使Pt@CPs成为EV检测的通用工具，在灵敏度、简单性和通量方面优于传统利用Ab1/HRP-Ab2的检测方法。

[0100]实施例7

[0101]膀胱癌相关细胞系EVs的蛋白质生物标志物的筛选

[0102]选取5株不同分化程度的细胞株进行BC生物标志物筛选，包括1株正常人膀胱上皮细胞株(SV-HUC-1)、2株高分化BC细胞株(BLU-87、5637)和2株低分化BC细胞株(EJ-1、T24)。收集上述5个细胞系不含FBS的培养上清液，通过低速离心和过滤去除细胞碎片。采用超速离心法分离细胞上清液中的EVs。根据MISEV 2018的指导，通过冷冻电子显微镜(cryo-EM)和纳米颗粒跟踪分析(NTA)对它们进行了表征。在冷冻电子显微镜下，标准EV表现出特征性的碟形形态，粒径分布范围为30-400nm(图10a-c)。典型EV生物标志物包括CD9、CD63和CD81通过蛋白质印迹法进一步表征(图10d)。

[0103]采用Pt@CP构建的免疫检测方法检测BC细胞来源的EVs上8种蛋白标志物的表达水平。将100μL EV溶液添加到用不同捕获抗体固定的96孔板中。将平板在4℃下保存过夜，随后用PBS缓冲液冲洗4次。每孔加入100μL Pt@CPs溶液，室温孵育1h。用PBS缓冲液洗涤4次去除游离的Pt@CPs后，每孔加入50μL TMB。5min内溶液变蓝，最后使用1M的H2SO4停止反应，溶液颜色由蓝色变为黄色。结果表明，来自测试细胞系的EVs膜蛋白具有不同的表达量。GLUT1在4种BC细胞系EVs中均呈高表达，且表达水平与分化程度呈正相关。CCDC25和MUC-1仅在EJ和BIU87来源的EVs中过表达。令人印象深刻的是，这三种蛋白在正常细胞(SV-HUC-1)衍生的EV上几乎没有表达(图10e)，这意味着GLUT1、CCDC25和MUC-1可作为BC诊断的潜在EV蛋白标志物。

[0104]为验证上述结果，采用Western blotting检测8种EV蛋白的表达水平，所有实验中蛋白的负载量优化为30μg。如图10f所示，在等蛋白浓度分析中，8种蛋白的表达水平与基于Pt@CP的免疫分析的结果相似，表明的方法可以准确地测量EV表面特定蛋白的表达。在雷达图(图10g)中总结了不同细胞系中8种EV蛋白的Pt@CP构建的免疫检测分析结果。

[0105]其中Western blot分析：分离自不同细胞系的EVs用RIPA缓冲液在20min的冰浴中裂解，并用BCA法进行定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离所有裂解产物，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5％脱脂奶粉将膜封闭30min，然后与单抗在4℃孵育过夜。将膜洗涤5次5min(1×TBS,0.5％吐温20)，然后与HRP标记的抗小鼠IgG或HRP标记的抗兔IgG作为二抗(1:2000)在37℃孵育2小时。然后，用增强的化学发光孵育膜进行免疫检测。最后，在C600(Azure)系统上进行化学发光成像。

[0106]蛋白质印迹法：将组织样本用预冷的PBS洗涤3次以去除血渍，然后用预冷的剪刀将其切成小块。将组织片置于匀浆管中，加入匀浆珠和裂解液(使用前加入蛋白酶抑制剂)匀浆。将样品在冰上孵育30min，之后在4℃下以12,000rpm离心10min。收集上清液，用BCA试剂盒定量蛋白浓度。采用Fuj i软件对信号强度进行定量分析。

[0107]实施例8

[0108]膀胱癌细胞系EVs的蛋白质生物标志物的临床验证

[0109]临床标本采集，BC组织和尿液标本均来源于天津市第一中心医院。取上午中段尿样，8000g离心30min，去除细胞碎片和凋亡小体。收集上清液并在-81℃保存于10mL分装液中。将10mL尿液在4℃环境中缓慢解冻，然后通过0.22μm的过滤器去除冷冻过程中可能产生的无机盐晶体，生成过滤后的尿液样本。然后将尿液样品加入100kDa滤器中，将EVs富集至500μL。滤过的尿液直接用于Pt@CP-based免疫测定实验。

[0110]采用Pt@CP构建的免疫检测方法检测BC来源的uEVs(尿液来源的胞外囊泡)。从尿液样本中收集uEVs，并通过NTA和TEM进行表征。为了验证Pt@CP构建的免疫检测uEVs的方法是否可行，使用CD63抗体捕获了三份尿液样本中的EVs:i)100μL被超离除去EVs的尿液，ii)100μL含有uEVs的正常尿液，iii)100μLEVs被裂解破坏的尿液。随后加入100μL Pt@CPs溶液测定CD63抗体捕获的EV数量。如图11所示，无EV尿液的信号强度与EV膜被破坏处的尿液一样弱。相比之下，在正常的尿液样本中观察到信号强度增加了三倍，其中EVs保持完整。结果突出了基于Pt@CP的免疫测定对uEVs的检测能力。

[0111]在检测MUC-1、CCDC25和GLUT1在临床样本uEVs上的表达水平之前，先研究了这些蛋白标志物是否也可以在BC患者的肿瘤组织中观察到。为此，本发明收集了10例BC患者的术前尿液样本和手术中切除的肿瘤组织。使用免疫组织化学对组织样本中这三种标志物进行染色(n＝2)。通过分析总细胞中标记阳性细胞的面积和信号强度，对相对表达水平进行分级(图12a)。通过使用相同标记的Pt@CP构建的免疫检测uEVs(图12b)，发现三种标记物在组织和uEVs上的表达水平是一致的。随后进一步使用Western blotting检测了裂解后剩余8个肿瘤组织样本中3种标志物的相对表达水平，并同时使用Pt@CP构建的免疫检测方法测量了术前uEVs上的相同标志物(图12c)。总体而言，3种标记物在组织和uEV样本之间的表达特征具有良好的一致性和正相关性(Spearman's秩相关系数＝0.73,P<0.0001)，这意味着uEV主要来源于BC分泌。以上结果支持可以通过测量尿液中BC来源EVs的丰度来进行BC的早期检测。

[0112]而传统的BC液体活检标志物，如膀胱肿瘤抗原(BTA)或核基质蛋白22(NMP22)的临床敏感性和特异性较低，且常受到膀胱炎的干扰，不能准确地早期诊断BC。对于本发明在uEVs上鉴定的三个蛋白标记物(MUC-1,CCDC25和GLUT1)，在48例BC患者，27例膀胱炎患者和24例健康供者的不同尿液样本中检测了它们的表达谱，BC患者中三种标志物的平均表达水平均高于膀胱炎患者或健康供者(图12d)。同时本发明还使用EV标记物的加权总和来分析检测结果，其中最优权重通过基于梯度下降的logistic回归确定。MUC-1、CCDC25和GLUT1组合成一个互补标记(EVBC)，以区分BC与其他组(P<0.0001，非配对t检验)(图12e)。根据检测结果绘制ROC曲线(图12f)，计算AUC，探讨MUC-1、CCDC25和GLUT1的诊断效能。EVBC的AUC显著高于各EV标志物(均P<0.001,DeLong’s检验)(图12g)。

[0113]此外，截断值为0.312的EVBC显示出比单个EV标志物对BC的诊断能力更高(根据ROC分析结果，MUC-1,CCDC25和GLUT1的截断值分别为0.129,0.147和0.216)，EVBC(48个中有47个，98％)能进一步提高单个EV标志物的诊断敏感性。

[0114]实施例9

[0115]BC手术期间的EV实时监测

[0116]上皮组织表面的实体瘤可以通过部分切除肿瘤周围癌旁组织来尽可能清除肿瘤残留。而膀胱是一个囊性结构，无法通过切除部分膀胱的方法以确保癌细胞被完全清除。膀胱镜检查是指导从膀胱壁切除肿瘤的最常用工具，尤其是对于非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)。考虑到膀胱镜视野的局限性和医生经验的差异，原发肿瘤可能无法完全清除，而残留肿瘤将增加BC的复发率。对8,409例NMIBC的系统回顾显示，初次手术后残留肿瘤的复发率为17-71％，这表明准确评估手术质量对于延长BC患者的寿命很重要。

[0117]本发明利用Pt@CPs进一步对BC手术患者在标准临床治疗期间uEV表达量的变化进行实时监测。首先，比较了手术前后的uEV浓度情况(图13a)，于术前24小时和术后1周内收集了同一患者的尿液样本(n＝9)。如图13b所示，总体uEV浓度没有显著变化(P＝0.491，配对t检验)。相比之下，所有患者的EVBC在术后均下降(P<0.001，配对t检验)(图13c)。进一步分析了因非BC疾病(如腺性膀胱炎)接受膀胱内手术的患者(n＝4)的尿液样本。结果如图14显示，手术本身不会显著影响uEVBC的丰度，这意味着EVBC水平的下调是由于肿瘤的切除造成的。

[0118]尽管所有BC患者的uEVBC水平在术后均降低，但有2例仍高于阈值。为了探究原因，分析了9例患者术中膀胱镜图片和手术切缘组织学染色，虽然9例患者术后膀胱镜下均未见肉眼可见的肿瘤组织，但2例阈值以上患者的手术切缘可见肿瘤组织(图13d)，其余7例患者的手术切缘均未见肿瘤组织(图13e)。这一现象表明，2例患者术后EVBC含量高可能是由于残留的肿瘤组织持续释放EVBC所致。因此，基于Pt@CPs的免疫检测方法检测uEVBC的表达可用于评估手术质量，并作为评估临床进一步手术必要性的重要指标。

[0119]实施例10

[0120]肾脏疾病对本发明生物标志物诊断膀胱癌的影响

[0121]肾脏疾病(如肾炎和肾癌)也会产生大量的EV进入尿液中，从而影响膀胱癌的诊断，进而还研究了肾脏疾病对检测方法的影响。如图15所示，MUC-1和CCDC25单独使用很难将膀胱癌(BC)和肾炎(Nephritis)、肾盂癌(CRP)分开。结果可能归因于肾炎引起的肾脏通透性异常和肾脏本身的功能(即大量来自其他器官的EV也可以从肾脏排泄到尿液中)，从而削弱了这两种uEV标志物的分析性能。相比之下，uEV上的GLUT1能够很好地区分膀胱癌、肾炎和肾盂癌。此外，这三种标志物的联用(EVBC)也能特异性的诊断出膀胱癌(图15)，而肾炎和肾癌的信号降低，不影响膀胱癌诊断。

[0122]本发明通过上述实施例来说明本发明的技术构思，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。