1.多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液；

2)向步骤1)中所述混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，得到聚合物；

3)在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，对步骤2)中所述聚合物进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物；

所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix-coil构象转变的多肽；

所述多肽交联剂的构象状态通过圆二色光谱CD进行检测，当CD谱在222nm、208nm处呈负峰，在190nm±5nm有一正峰时，为helix构象；当CD谱在199nm处呈负峰，220nm±5nm有一正峰时为coil构象。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为2～100个。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为5～30个；所述多肽交联剂具体的选自下述式I～式VI结构的多肽：





4.根据权利要求1～3任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的水溶性溶剂包括磷酸缓冲液，Tris缓冲液和NaClO4溶液中的一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白的质量比为(10～30):(0.5～2):(5～20):(5～20)。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂选自过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺、过硫酸铵溶液和亚硫酸氢钠、过硫酸钾溶液和四甲基乙二胺以及过硫酸钾溶液和亚硫酸氢钠中的一组。

7.权利要求1～6任意一项所述的制备方法制备获得的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物。

8.权利要求7所述的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在蛋白质富集、分离和纯化中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下，进行目标蛋白的吸附，在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，进行目标蛋白的洗脱。

技术领域

[0001]本发明属于生物分离工程技术领域，尤其涉及多肽交联蛋白质分子印迹聚合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002]分子印迹聚合物是受抗体特异性识别抗原启发而提出的一类人工合成受体。与抗体等天然受体相比，分子印迹聚合物具有制备简单、稳定性好、成本低等优点，在环境、生命等许多领域有重要用途。分子印迹的一般过程为：(1)聚合单体和交联剂在模板分子存在条件下进行聚合，(2)模板洗脱，在聚合物中留下与模板分子在化学和空间上互补的印迹位点，(3)当重新暴露在含有模板分子的溶液中时，印迹聚合物能识别并选择性地重新结合目标分子。

[0003]小分子印迹聚合物的研究已经取得很大的成功。但是生物大分子印迹，特别是蛋白质的印迹依然困难重重。蛋白质印迹面临的一个首要问题是模板洗脱困难。这是因为蛋白质分子量大，在交联的聚合物网络中扩散困难。目前一般采用一些苛刻的条件进行蛋白模板的洗脱，如用高浓度盐溶液(例如1M NaCl)或醋酸/表面活性剂(SDS或Tween-20)混合溶液(常用配方为10％SDS/10％AcOH)进行洗脱。也有用蛋白水解酶，如胰蛋白酶消化模板蛋白从而除去模板蛋白。这些处理并不能保证模板蛋白的完全去除，且常常导致印迹聚合物网络结构的改变、蛋白质的非特异性吸附、以及印迹位点的阻塞等问题。更重要的是苛刻的洗脱条件极易导致模板蛋白的变性、失活，使得洗脱下来的目标蛋白失去了使用价值，而蛋白水解酶消化的方法更是直接破坏了模板蛋白。蛋白质印迹的很多应用中，例如蛋白的富集、分离和纯化，需要回收有活性的目标蛋白，因此苛刻的洗脱条件使得此类印迹聚合物在很大程度上失去了应用价值。

[0004]蛋白质印迹面临的第二个严重问题是印迹效果差。蛋白质只溶于水且易变性失活，不能使用在小分子印迹中常使用的有机溶剂，而只能在水溶液中进行印迹。这一方面限制了单体的选择，同时由于水的存在破坏模板和功能单体之间氢键的形成，使得模板与功能单体之间作用力减弱。为了能识别目标分子，必须保持聚合物中印迹位点的大小和空间构型不变，因此在小分子印迹中，聚合物交联度常高达50％以上。然而在蛋白质印迹中，由于模板极难去除，因此只能使用较低的交联度。由于这些原因，现有的蛋白质印迹材料的印迹效果并不理想。例如Chen等公开了一种以溶菌酶为模板蛋白的印迹聚合物，该印迹聚合物以N-异丙基丙烯酰胺为主单体、甲基丙烯酸和丙烯酰胺为功能单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂聚合而成，交联剂含量为3.11mol％。模板蛋白用1M NaCl进行洗脱。印迹容量Qm为350mg/g dry gel，印迹因子仅为1.167(Z.Chen,et al.Journal ofMolecularRecognition,2008,21(1),71-77)。

[0005]对于蛋白质印迹，模板洗脱困难和印迹效果差的问题似乎是其固有的问题，且两个问题相互掣肘，难以同时解决。人们经过长期研究仍未能找到有效的解决方法，使得蛋白质印迹的前景蒙上了阴影(Culver,H.R.；Peppas,N.A.,Chemistry ofMaterials,2017,29(14),5753-5761)。

发明内容

[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供多肽交联蛋白质分子印迹聚合物及其制备方法和应用。

[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0008]多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

[0009]1)将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液；

[0010]2)向步骤1)中所述混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，得到聚合物；

[0011]3)在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，对步骤2)中所述聚合物进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物；

[0012]所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix-coil构象转变的多肽。

[0013]优选的，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为2～100个。

[0014]优选的，所述多肽交联剂中氨基酸的数量为5～30个。

[0015]优选的，步骤1)中所述的水溶性溶剂包括磷酸缓冲液，Tris缓冲液和NaClO4溶液中的一种。

[0016]优选的，步骤1)中所述主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白的质量比为(10～30):(0.5～2):(5～20):(5～20)。

[0017]优选的，所述引发剂选自过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺、过硫酸铵溶液和亚硫酸氢钠、过硫酸钾溶液和四甲基乙二胺以及过硫酸钾溶液和亚硫酸氢钠中的一组。

[0018]优选的，所述多肽交联剂的构象状态通过圆二色光谱进行检测，当CD谱在222nm、208nm处呈负峰，在190nm±5nm有一正峰时，为helix构象；当CD谱在199nm处呈负峰，220nm±5nm有一正峰时为coil构象。

[0019]本发明提供了所述的制备方法制备获得的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物。

[0020]本发明提供了所述的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在蛋白质富集、分离和纯化中的应用。

[0021]优选的，所述多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下，进行目标蛋白的吸附，在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，进行目标蛋白的洗脱。

[0022]本发明的有益效果：本发明提供的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，用多肽交联剂代替传统的交联剂(例如N,N'-亚甲基双丙烯酰胺)，利用多肽交联剂在不同条件下存在不同构象变化的这一特殊性质，在所述多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，在所述多肽交联剂以coil构象存在的条件下进行模板洗脱。当所述多肽交联剂由helix构象转变为coil构象时，蛋白质分子印迹聚合物发生溶胀，可在温和条件下实现模板蛋白的去除。当所述多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在应用时，调节外界环境参数，使所述多肽交联剂由coil构象重新转变为helix构象，整个蛋白质分子印迹聚合物发生收缩；更重要的是由于多肽交联剂由coil构象折叠为helix构象时高度专一，蛋白质分子印迹聚合物中的印迹位点在大小和空间构型上能够完全恢复，因此能特异性识别目标蛋白质。

[0023]本发明提供的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物不仅可以在温和的条件下完全去除模板蛋白，而且能够大幅提高了蛋白质分子印迹聚合物的印迹效果。根据实施例1的记载，利用本发明所述的方法制备的与文献(Z.Chen,et al.Journal of MolecularRecognition,2008,21(1),71-77)中同样配方的以lysozyme为模板的蛋白质印迹聚合物，交联剂含量仍为3.1mol％，只是将常用的交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺改为实施例1中记载的多肽交联剂。以pH7.4磷酸缓冲溶液(含生理离子强度的NaCl)为洗脱液实现模板蛋白的完全洗脱；蛋白吸附研究结果表明，新合成的印迹聚合物印迹容量Qm为679mg/g drygel，印迹因子为10.0。参考文献(Z.Chen,et al.Journal of Molecular Recognition,2008,21(1),71-77)的印迹聚合物的最大吸附容量Qm为350mg/g dry gel，印迹因子为1.167。与参考文献相比，多肽交联的印迹聚合物的印迹效果大幅提升。

附图说明

[0024]图1为实施例1中的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在不同条件下的CD谱，显示多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物中的多肽链段的构象可逆地从helix变为coil；

[0025]图2为多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物MIP和相应的非印迹聚合物NIP对模板蛋白的吸附等温图；

[0026]图3为模板蛋白为溶菌酶(Lys)的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物MIP和相应的非印迹聚合物NIP对各种蛋白的吸附结果；

[0027]图4为低盐和高盐溶液洗脱的模板蛋白溶菌酶及未处理溶菌酶的相对活性；

[0028]图5为SDS-PAGE分析从鸡蛋清中提取溶菌酶结果，其中第一道为溶菌酶标样，第二道为未处理的鸡蛋清样品，第三道为用多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物处理后的鸡蛋清样品，第四道为用多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物处理鸡蛋清后再用低盐溶液洗脱时洗脱液的样品。

具体实施方式

[0029]本发明提供了多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：1)将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液；2)向步骤1)中所述混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，得到聚合物；3)在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，对步骤2)中所述聚合物进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物；所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix-coil构象转变的多肽。

[0030]本发明中，所述多肽交联剂为氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix-coil构象转变的多肽。在本发明中，所述多肽交联剂的helix-coil构象转变优选的在不同条件下发生；在本发明具体实施过程中，所述helix-coil构象转变的条件可以为多肽交联剂溶液温度的变化，pH值的变化以及离子强度的变化等；本发明对所述helix-coil构象转变的条件没有特殊要求，根据不同的多肽交联剂的种类进行确定，只要能够实现helix-coil构象转变即可。在本发明中，所述多肽交联剂的构象状态通过圆二色光谱进行检测，当CD谱在222nm、208nm处呈负峰，在190nm±5nm有一正峰时，为helix构象；当CD谱在199nm处呈负峰，220nm±5nm有一正峰时为coil构象。

[0031]本发明对所述多肽交联剂中氨基酸的数量、种类以及序列没有特殊要求，所有符合氨基酸序列的两端具有能够聚合的双键，并且能够发生helix-coil构象转变的多肽均可作为本发明中所述的多肽交联剂。在本发明具体实施过程中，所述多肽交联剂中氨基酸的数量优选为2～100个，更优选为5～30个。本发明实施例中所述多肽交联剂具体的可选自下述式I～式VI结构的多肽：

[0032]

[0033]

[0034]

[0035]本发明将主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白混合溶解于水溶性溶剂中获得混合溶液。本发明对所述主单体、功能单体的种类没有特殊限定，采用本领域蛋白质分子印迹聚合物制备中常规的主单体和功能单体即可。本发明对所述模板蛋白的种类没有特殊限定，任何种类的蛋白质均可作为模板蛋白。本发明中，所述水溶性溶剂优选的包括但不限于磷酸缓冲液，Tris缓冲液和NaClO4溶液中的一种；本发明中所述水溶性溶剂优选的浓度和pH值根据水溶性溶剂的种类以及具体的多肽交联剂的种类确定。当所述水溶性溶剂为磷酸缓冲液时，所述磷酸缓冲液的浓度为1～100mmol/L，更优选为10-20mmol/L；所述磷酸缓冲液的pH值优选为5.0～5.6；当所述水溶性溶剂为Tris缓冲液时，所述Tris缓冲液的浓度优选为1～50mmol/L，更优选为10～20mmol/L；所述Tris缓冲液的pH值优选为7.0～10；当所述水溶性溶剂为NaClO4溶液时，所述NaClO4溶液的浓度为0.05～0.50mol/L，更优选为0.1～0.3mol/L。本发明中，所述主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白的质量比优选为(10～30):(0.5～2):(5～20):(5～20)。本发明中，所述主单体、功能单体、多肽交联剂和模板蛋白的总质量与水溶性溶剂的体积的比例优选为(1～5):(5～15)。

[0036]本发明在获得所述混合溶液后，向所述混合溶液中加入引发剂，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，得到聚合物。本发明中，所述引发剂优选的选自过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺、过硫酸铵溶液和亚硫酸氢钠、过硫酸钾溶液和四甲基乙二胺以及过硫酸钾溶液和亚硫酸氢钠中的一组；更优选为过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺；当所述引发剂选择过硫酸铵溶液和四甲基乙二胺时，所述过硫酸铵溶液的质量浓度优选为1～20％，更优选为5～10％；所述过硫酸铵溶液与四甲基乙二胺的体积比优选为(8～12)：1，更优选为10:1。本发明中，所述混合溶液与所述引发剂的体积比优选为(25～50):(1～5)。本发明中，所述聚合的时间优选为20～28h，更优选为24h；所述聚合的温度根据具体多肽交联剂的种类进行相应调整，能够使所述多肽交联剂以helix构象存在即可。

[0037]本发明在得到所述聚合物后，在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，对所述聚合物进行模板洗脱，获得多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物。在本发明中，所述洗脱用洗脱液优选的与对应的水溶性溶剂一致，所述洗脱的pH值或者温度与聚合时不同。本发明对所述洗脱的条件没有特殊限定，能够使所述多肽交联剂以coil构象存在即可。

[0038]本发明提供了所述的制备方法制备获得的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物。

[0039]本发明提供了所述的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物在蛋白质富集、分离和纯化中的应用。在本发明具体实施过程中，所述多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物，在多肽交联剂以helix构象存在的条件下，进行目标蛋白的吸附，在多肽交联剂以coil构象存在的条件下，进行目标蛋白的洗脱。

[0040]下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0041]实施例1

[0042]印迹聚合物的合成：

[0043]将200mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，4μL甲基丙烯酸，115mg多肽交联剂和100mg模板蛋白溶菌酶溶于2mL 20mM pH5.5磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入50μL 10％APS及5μLTEMED引发聚合，在37℃下反应24h，得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白溶菌酶。多肽交联剂结构如式I所示：

[0044]

[0045]模板蛋白的洗脱:

[0046]在37℃下用20mM pH7.4磷酸缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱。测定洗脱液的吸光度值，利用紫外分光光度计绘制目标蛋白在特定波长下吸光度-浓度的标准曲线，根据该曲线将蛋白溶液的吸光度值转换为浓度值。结果如下：洗脱液每次用100mL，第一次洗脱后洗脱液中模板蛋白的浓度为0.927mg/mL，第二次洗脱后洗脱液中模板蛋白的浓度为0.0474mg/mL，第三次洗脱后洗脱液中模板蛋白的浓度为0.0037mg/mL，第四次洗脱后用紫外分光光谱仪未检测到洗脱液中含有模板蛋白。洗脱率＝洗脱蛋白总量/印迹蛋白总量，印迹蛋白总量为100mg，洗脱率为97.8％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0047]印迹效果研究:

[0048]用20mM pH5.5磷酸缓冲溶液配制不同浓度的溶菌酶溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中溶菌酶的浓度，计算吸附量。吸附量计算采用本领域常规计算方法，参见文献Z.Hua，et al.Langmuir，2008，24，5773-5780。绘制吸附等温图(平衡蛋白浓度-吸附量曲线)，用Langmuir模型进行曲线拟合，得MIP的印迹容量Qm为679mg/g dry gel，印迹因子为10.0。本实施例配方与参考文献(Z.Chen,et al.JournalofMolecular Recognition,2008,21(1),71-77)相同，仅用相同摩尔量的多肽交联剂取代了参考文献中用的交联剂。参考文献(Z.Chen,et al.Journal of MolecularRecognition,2008,21(1),71-77)的印迹聚合物的最大吸附容量Qm为350mg/g dry gel，印迹因子为1.167。与参考文献相比，本实施例制备的印迹聚合物的印迹效果大幅提升。

[0049]用20mM pH5.5磷酸缓冲溶液分别配制浓度为0.4mg/mL的各种蛋白溶液，包括溶菌酶、细胞色素c(Cyt C)、血红蛋白(Hb)、辣根过氧化物酶(HRP)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶抑制因子(Try)。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，紫外检测上清液的吸光度值，计算吸附量。得各种蛋白的印迹因子分别为10.48(Lysozyme)、3.70(Cyt C)、1.15(Hb)、1.57(HRP)、1.02(BSA)、1.24(Try)，表明印迹聚合物能选择性吸附溶菌酶。

[0050]对比例1

[0051]印迹聚合物的合成：

[0052]将200mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，4μL甲基丙烯酸，9mgN,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)和100mg模板蛋白溶菌酶溶于2mL 20mM pH5.5磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入50μL 10％APS及5μL TEMED引发聚合，在37℃下反应24h，得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白溶菌酶。该配方与文献(Z.Chen,et al.Journal ofMolecular Recognition,2008,21(1),71-77)完全相同。与实施例1中的印迹聚合物配方相比，仅把多肽交联剂换成了相同摩尔量的常用交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺。

[0053]模板蛋白的洗脱:

[0054]在37℃下用20mM pH7.4磷酸缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱。第一次洗脱率为35.77％，第二次洗脱率为5.52％，第三次洗脱率为2.85％，第四次洗脱率为0。总洗脱率为44.14％。结果表明在此条件洗脱，仍有一半以上的模板蛋白不能洗脱下来。而实施例1中制备的多肽交联的印迹聚合物在相同条件下可将模板蛋白完全洗脱。

[0055]为了与多肽交联剂合成的蛋白质分子印迹聚合物的印迹实验对比，在37℃下改用含1MNaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液进行蛋白洗脱，直至将剩余模板蛋白完全洗脱。

[0056]印迹效果研究:

[0057]MIP用含1M NaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液进行蛋白洗脱，完全除去模板蛋白。用20mM pH5.5磷酸缓冲溶液配制不同浓度的溶菌酶溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中溶菌酶的浓度，计算吸附量。吸附量计算采用本领域常规计算方法，参见文献Z.Hua，et al.Langmuir，2008，24，5773-5780。绘制吸附等温图(平衡蛋白浓度-吸附量曲线)，用Langmuir模型进行曲线拟合，得MIP的印迹容量Qm为387.0mg/gdry gel，NIP的最大吸附容量Qm为210.9mg/g dry gel，印迹因子为1.83。与参考文献(Z.Chen,et al.Journal ofMolecular Recognition,2008,21(1),71-77)报道结果相当。

[0058]对比例1配方与实施例1基本相同，唯一的不同之处是对比例1使用普通交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，而实施例1使用相同摩尔量的多肽交联剂。可以看到，使用多肽交联剂不仅可使模板蛋白在温和条件下完全洗脱，而且可使印迹效果大幅提升。

[0059]实施例2

[0060]印迹聚合物的合成：

[0061]将200mg N-异丙基丙烯酰胺，2.5mg丙烯酰胺，8μL甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，115mg多肽交联剂和100mg模板蛋白牛血清白蛋白(BSA)溶于2mL 20mM pH5.5磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入引发剂50μL 10％APS和5μLTEMED，37℃下反应24h。得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白牛血清白蛋白。多肽交联剂结构同实施例1。

[0062]模板蛋白的洗脱:

[0063]在37℃下用20mM pH7.4磷酸缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱，四次洗脱率分别为95.24％，2.05％，0.24％，0％。总洗脱率为97.51％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0064]印迹效果研究:

[0065]用20mM pH5.5磷酸缓冲溶液配制不同浓度的BSA溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白牛血清白蛋白的浓度，绘制吸附等温图(平衡蛋白浓度-吸附量曲线)，用Langmuir模型进行曲线拟合，得MIP的最大吸附容量Qm为420.3mg/g dry gel，NIP的最大吸附容量Qm为54.4mg/g dry gel，印迹因子为7.72。

[0066]对比例2

[0067]印迹聚合物的合成：

[0068]将200mg N-异丙基丙烯酰胺，2.5mg丙烯酰胺，8μL甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，9mgN,N-亚甲基双丙烯酰胺和100mg模板蛋白牛血清白蛋白(BSA)溶于2mL 20mM pH5.5磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入引发剂50μl 10％APS和5μLTEMED，37℃下反应24h。得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白牛血清白蛋白。

[0069]模板蛋白的洗脱:

[0070]在37℃下用20mM pH7.4磷酸缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱。第一次洗脱率为54.77％，第二次洗脱率为6.96％，第三次洗脱率为0.75％，第四次洗脱率为0。总洗脱率为62.48％。结果表明在此条件洗脱，仍有大量模板蛋白不能洗脱下来。而实施例2中制备的多肽交联的印迹聚合物在相同条件下可将模板蛋白完全洗脱。

[0071]在37℃下改用含1M NaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液进行蛋白洗脱，直至将模板蛋白完全洗脱。

[0072]印迹效果研究:

[0073]MIP用含1M NaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液进行蛋白洗脱，完全除去模板蛋白。用20mM pH5.5磷酸缓冲溶液配制不同浓度的BSA溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白牛血清白蛋白的浓度计算吸附量，绘制吸附等温图(平衡蛋白浓度-吸附量曲线)，用Langmuir模型进行曲线拟合，得MIP的最大吸附容量Qm为214.7mg/g dry gel，NIP的最大吸附容量Qm为126.3mg/g dry gel，印迹因子为1.69。

[0074]对比例2配方与实施例2基本相同，唯一的不同之处是对比例2使用普通交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，而实施例2使用相同摩尔量的多肽交联剂。可以看到，使用多肽交联剂不仅可使模板蛋白在温和条件下完全洗脱，而且可使印迹效果大幅提升。

[0075]实施例3

[0076]印迹聚合物的合成：

[0077]将200mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，4μL甲基丙烯酸，51.74mg多肽交联剂和100mg模板蛋白细胞色素C(Cyt C)溶于2mL 20mM pH5.5磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入引发剂50μL 10％APS和5μLTEMED，37℃下反应24h。得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白细胞色素C。多肽交联剂结构同实施例1。

[0078]模板蛋白的洗脱:

[0079]在37℃下用20mM pH7.4磷酸缓冲溶液(含0.154MNaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱，四次洗脱率分别为93.40％，2.06％，1.34％，0％。总洗脱率为96.8％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0080]印迹效果研究:

[0081]用20mMpH5.5磷酸缓冲溶液配制不同浓度的Cyt C溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白细胞色素C的浓度绘制吸附等温图(平衡蛋白浓度-吸附量曲线)，用Langmuir模型进行曲线拟合，得MIP的最大吸附容量Qm为562.0mg/g dry gel，NIP的最大吸附容量Qm为79.6mg/g drygel，得印迹因子为7.1。

[0082]对比例3

[0083]印迹聚合物的合成：

[0084]将200mgN-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，4μL甲基丙烯酸，4mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺和100mg模板蛋白细胞色素C(Cyt C)溶于2mL20mMpH5.5磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入引发剂50μL 10％APS和5μL TEMED，37℃下反应24h。得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白细胞色素C。

[0085]模板蛋白的洗脱:

[0086]在37℃下用20mM pH7.4磷酸缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱。第一次洗脱率为48.32％，第二次洗脱率为5.85％，第三次洗脱率为2.59％，第四次洗脱率为0。总洗脱率为56.76％。结果表明在此条件洗脱，仍有大量模板蛋白不能洗脱下来。而实施例3中制备的多肽交联的印迹聚合物在相同条件下可将模板蛋白完全洗脱。

[0087]在37℃下改用含1M NaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液进行蛋白洗脱，直至将模板蛋白完全洗脱。

[0088]印迹效果研究:

[0089]MIP用含1M NaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液进行蛋白洗脱，完全除去模板蛋白。用20mM pH5.5磷酸缓冲溶液配制不同浓度的Cyt C溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白牛血清白蛋白的浓度计算吸附量，绘制吸附等温图(平衡蛋白浓度-吸附量曲线)，用Langmuir模型进行曲线拟合，得MIP的最大吸附容量Qm为328.4mg/g dry gel，NIP的最大吸附容量Qm为236.4mg/g dry gel，印迹因子为1.39。

[0090]对比例3配方与实施例3基本相同，唯一的不同之处是对比例3使用普通交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺，而实施例3使用相同摩尔量的多肽交联剂。可以看到，使用多肽交联剂不仅可使模板蛋白在温和条件下完全洗脱，而且可使印迹效果大幅提升。

[0091]实施例4

[0092]印迹聚合物的合成：

[0093]将200mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，4μL甲基丙烯酸，150mg多肽交联剂和100mg模板蛋白溶菌酶(Lyz)溶于2mL 20mM pH5.0磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入引发剂50μL 10％APS和5μL TEMED，37℃下反应24h。得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白溶菌酶。多肽交联剂结构如式II所示：

[0094]

[0095]模板蛋白的洗脱:

[0096]在37℃下用20mM pH7.4磷酸缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱，洗脱率为97.8％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0097]印迹效果研究:

[0098]用20mM pH5.0磷酸缓冲溶液配制不同浓度的溶菌酶(Lyz)溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白溶菌酶的浓度计算吸附量，得印迹因子为10.21。

[0099]实施例5

[0100]印迹聚合物的合成：

[0101]将400mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，16μL N-[3-(dimethylamino)propyl]-methacrylamide(DMAPMA)，200mg多肽交联剂和100mg模板蛋白BSA溶于2mL 10mMpH10.0Tris缓冲溶液。通氮气除氧30分钟，加入50μL 10％APS及5μLTEMED，室温下反应24h，得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白BSA。多肽交联剂结构如式III所示：

[0102]

[0103]模板蛋白的洗脱:

[0104]在37℃下用10mM pH7.4tris缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱，洗脱率为96.8％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0105]印迹效果研究:

[0106]用10mM pH10.0tris缓冲溶液配制不同浓度的BSA溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白BSA的浓度，计算吸附量，得印迹因子为10.13。

[0107]实施例6

[0108]印迹聚合物的合成：

[0109]将400mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，16μL N-[3-(dimethylamino)propyl]-methacrylamide(DMAPMA)，210mg多肽交联剂和100mg模板蛋白BSA溶于2mL 10mMpH10.0Tris缓冲溶液。通氮气除氧30分钟，加入50μL 10％APS及5μLTEMED，室温下反应24h，得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白BSA。多肽交联剂结构如式IV所示：

[0110]

[0111]模板蛋白的洗脱:

[0112]在37℃下用10mM pH7.4tris缓冲溶液(含0.154M NaCl模拟生理离子强度)进行蛋白洗脱，洗脱率为98.2％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0113]印迹效果研究:

[0114]用10mM pH10.0tris缓冲溶液配制不同浓度的BSA溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白BSA的浓度计算吸附量，得印迹因子为10.96。

[0115]实施例7

[0116]印迹聚合物的合成：

[0117]将400mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，16μL N-[3-(dimethylamino)propyl]-methacrylamide(DMAPMA)，210mg多肽交联剂和100mg模板蛋白BSA溶于2mL 0.2MNaClO4溶液。通氮气除氧30分钟，加入50μL 10％APS及5μL TEMED，25℃下反应24h，得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白BSA。多肽交联剂结构同实施例6。

[0118]模板蛋白的洗脱:

[0119]在25℃下用0.154M NaCl溶液进行蛋白洗脱，洗脱率为97.1％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0120]印迹效果研究:

[0121]用2mL 0.2M NaClO4溶液配制不同浓度的BSA溶液。37℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白BSA的浓度，计算吸附量，得印迹因子为10.38。

[0122]实施例8：

[0123]印迹聚合物的合成：

[0124]冰水浴下将400mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，16μL N-[3-(dimethylamino)propyl]-methacrylamide(DMAPMA)，200mg多肽交联剂和100mg模板蛋白BSA溶于10mM pH7.0tris缓冲溶液。通氮气除氧30分钟，加入50μL 10％APS及5μL TEMED,0℃下反应24h，得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白BSA。多肽交联剂结构如式V所示:

[0125]

[0126]模板蛋白的洗脱:

[0127]在37℃下用10mM pH7.0tris缓冲溶液进行蛋白洗脱，洗脱率为98.8％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0128]印迹效果研究:

[0129]用2mL 10mM pH7.0tris缓冲溶液配制不同浓度的BSA溶液。0℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白BSA的浓度，计算吸附量，得印迹因子为10.87。

[0130]实施例9：

[0131]印迹聚合物的合成：

[0132]冰水浴下将400mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，16μL N-[3-(dimethylamino)propyl]-methacrylamide(DMAPMA)，210mg多肽交联剂和100mg模板蛋白BSA溶于10mM pH7.0tris缓冲溶液。通氮气除氧30分钟，加入50μL 10％APS及5μL TEMED,0℃下反应24h，得到印迹聚合物MIP。非印迹聚合物NIP的制备与印迹聚合物的制备相同，只是不加模板蛋白BSA。多肽交联剂结构如式VI所示:

[0133]

[0134]模板蛋白的洗脱:

[0135]在37℃下用10mM pH7.0tris缓冲溶液进行蛋白洗脱，洗脱率为97.2％。最后用去离子水清洗印迹聚合物以洗去残留的氯化钠。

[0136]印迹效果研究:

[0137]用2mL 10mM pH7.0tris缓冲溶液配制不同浓度的BSA溶液。0℃下，加入MIP或NIP，充分吸附后，用紫外分光光谱仪检测上清液中模板蛋白BSA的浓度，计算吸附量，得印迹因子为10.96。

[0138]实施例10：

[0139]印迹聚合物的合成：

[0140]将200mg N-异丙基丙烯酰胺，5mg丙烯酰胺，4μL甲基丙烯酸，115mg多肽交联剂和100mg模板蛋白溶菌酶溶于2mL 20mM pH5.5磷酸缓冲溶液。充分混合后，加入50μL 10％APS及5μLTEMED引发聚合，在37℃下反应24h，得到印迹聚合物MIP。多肽交联剂结构如式I所示。

[0141]模板蛋白的洗脱回收:

[0142]在37℃下分别用两种不同的溶液进行模板蛋白溶菌酶洗脱。第一种溶液是含0.154M NaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液，第二种溶液是含1M NaCl的20mMpH7.4磷酸缓冲溶液。洗脱液经透析脱盐，冷冻干燥，得到回收的模板蛋白溶菌酶。

[0143]测定回收溶菌酶样品的圆二色谱，并与原始样品进行比较。结果表明，用含0.154MNaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液洗脱回收的蛋白，其二级和三级结构几乎没有变化。而用含1M NaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液洗脱回收的蛋白，其二级和三级结构则发生明显变化。结果显示，温和条件下进行蛋白洗脱对蛋白高级结构影响很小，而用含高浓度盐溶液进行蛋白洗脱则会导致蛋白高级结构的破坏。

[0144]以滕黄微球菌为底物，测定两个回收溶菌酶样品的生物活性，并与原始样品进行比较。温和条件下洗脱的溶菌酶样品活性仍高达89％，而用含高浓度盐溶液洗脱的溶菌酶样品活性仅为8％。显示温和条件进行模板蛋白洗脱有利于保存目标蛋白的活性。

[0145]实施例11：

[0146]用实施例1中合成的溶菌酶印迹聚合物从鸡蛋清中提取溶菌酶。已知鸡蛋清中含有148种蛋白质，其中溶菌酶含量为3-3.5％。

[0147]鸡蛋清中溶菌酶的提取：

[0148]新鲜鸡蛋清用20mM pH5.5磷酸缓冲溶液稀释20倍。加入20mg印迹聚合物，在37℃下孵育10h。取出印迹聚合物，用含0.154MNaCl的20mM pH7.4磷酸缓冲溶液洗脱，回收吸附的溶菌酶蛋白。用SDS-PAGE对提取结果进行分析。第一道为溶菌酶标样，第二道为未处理的鸡蛋清样品，第三道为用印迹聚合物处理后的鸡蛋清样品，第四道为印迹聚合物洗脱液的样品。结果显示，实施例1合成的溶菌酶印迹聚合物能选择性地从鸡蛋清中提取溶菌酶。用HPLC对提取结果进行分析，再次验证实施例1合成的溶菌酶印迹聚合物能选择性地从鸡蛋清中提取溶菌酶。且从HPLC结果可知，用此法提取溶菌酶，回收率高达96.3％，产品纯度达93.4％。

[0149]以滕黄微球菌为底物，测定提取溶菌酶样品的生物活性，得其相对活性为92％(相对于原始商品样品)。

[0150]由上述实施例可知，本发明提供的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物的制备方法，在所述多肽交联剂以helix构象存在的条件下进行聚合，在所述多肽交联剂以coil构象存在的条件下进行模板洗脱。可在温和条件下实现模板蛋白的去除，蛋白质分子印迹聚合物中的印迹位点在大小和空间构型上能够完全恢复，能特异性识别目标蛋白。本发明提供的多肽交联的蛋白质分子印迹聚合物不仅可以在温和的条件下完全去除模板蛋白，而且能够大幅提高蛋白质分子印迹聚合物的印迹效果。

[0151]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。