一种四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：在收集全国蓖麻种质资源建立蓖麻种质资源圃的基础上，通过对蓖麻形态学分析和染色体倍性鉴定，选取优良二倍体蓖麻品种作为四倍体诱变材料；采用混合诱变剂对人工去除胚乳的蓖麻裸胚进行强迫吸收法进行四倍体加倍处理，取F1代新生幼叶进行染色体分析与倍性鉴定，去除嵌合体和非整倍体，筛选出纯合四倍体植株，按照蓖麻常规栽培方法进行大田种植与栽培管理。

按照权利要求1所述的四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于所述的混合诱变剂是秋水仙素和胺磺灵的混合溶液。

按照权利要求1所述的四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于所述的蓖麻染色体基数为x＝10，体细胞二倍体染色体数目为2n＝2x＝20。

一种四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)首先对我国蓖麻种质资源进行广泛收集，建立蓖麻种质资源圃；

2)对蓖麻种质资源进行细胞学分析与染色体倍性鉴定，具体是采用植物染色体标本制备的去壁低渗法进行蓖麻染色体标本制备；蓖麻染色体基数为x＝10，体细胞二倍体染色体数目为2n＝2x＝20；

3)根据形态学、经济性状分析和倍性鉴定结果，选取农艺性状优良二倍体蓖麻品种作为四倍体诱变材料；

4)采用常规消毒方法进行种子无菌消毒，然后去除胚乳，剥出种胚，放入1/2MS培养基中，在23℃±2℃进行种胚无光照培养至种胚萌发；

5)转入含有质量的秋水仙素和胺磺灵混合诱变剂的水溶液中，在15-20℃较低温度的黑暗条件下加倍处理48～72小时；

6)转入1/2MS培养基中，在23℃±2℃，光照1000Lux，16小时/天，继续培养；

7)待幼苗发育至4片真叶期，根长3～5公分，进行瓶苗移栽，移栽到消毒的土壤中；移栽前3天打开瓶盖进行炼苗；移栽苗必须精心管理；

8)取F1代种胚新生的幼叶进行染色体分析与倍性鉴定，去除嵌合体和非整倍体，筛选出纯合四倍体植株；

9)按照蓖麻常规栽培方法进行蓖麻四倍体大田种植与栽培管理，对四倍体蓖麻F1代种子再次进行倍性鉴定与染色体分析，去除嵌合体与非整倍体，选出纯合四倍体蓖麻新种质。

按照权利要求4所述的四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于所述常规消毒方法为

用75％酒精消毒60秒，无菌水冲洗，然后用2％次氯酸钠消毒15分钟，无菌水冲洗3次。

按照权利要求4所述的四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于所述秋水仙素和胺磺灵溶液的质量百分比浓度分别为0.02％；所述混合诱变剂的终浓度为0.01％。

按照权利要求4所述的四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于所述移栽苗管理的条件为：温度保持在25℃±2℃，湿度65％±5；土壤条件为普通沙壤土。

按照权利要求4所述的四倍体蓖麻的培育方法，其特征在于所述染色体分析与倍性鉴定步骤为：上午8～9点取新生的幼叶，用0.002M8-羟基喹啉进行前处理3-4小时，然后按植物染色体标本制备的去壁低渗法流程进行蓖麻染色体标本制备，去除嵌合体和非整倍体植株，选取体细胞染色体为2n＝4x＝40的植株，即筛选出纯合四倍体植株。

四倍体蓖麻的培育方法

技术领域：

本发明涉及一种植物新品种的培育方法，特别是四倍体蓖麻新品种(系)的培育方法。

背景技术：

蓖麻(Ricinus communist L.)是世界十大油料作物之一，广泛应用于国防、航天、化工医药和机械制造等方面，它的主要特性是低温(-18℃)不凝固，高温(500～600℃)不变质，不燃烧，在国民经济建设中具有重要意义。

我国蓖麻资源分布广泛，南北方均可栽培，全国每年种植面积15万～20万hm2，年产蓖麻籽15万～25万吨，而蓖麻籽的年需求量已经超过60万吨，年加工蓖麻籽能力在100万吨以上，供需矛盾日渐突出。

虽然我国蓖麻杂交育种与新品种培育取得了显著成绩，但全国平均亩产只有400公斤左右。据申请者调查与鉴定，目前我国蓖麻的栽培品种和野生资源均为二倍体。最近研究资料显示，现在地球上生活的高等植物全部都是多倍体，从晚侏罗纪到第三纪至少经历了三次全部基因组加倍事件。因此，基因组进化是高等植物进化的普遍趋势，由此引发的基因组多倍化与多倍体研究再次成为生命科学研究的热点。多倍体是个强势的生物种群，多倍化后抗逆性增强，生物学产量显著提高。

中国专利CN102159066 B报道了一种生产蓖麻种子的方法，其特点是包括对多倍体蓖麻植物进行自交育种或杂交育种，其中所述多倍体蓖麻植物通过同基因的二倍体蓖麻祖代的蓖麻种子中的基因组倍增而获得，其中所述基因组倍增通过以下步骤实施：(a)将磁场应用于二倍体蓖麻种子；和(b)在磁场下用微管聚合抑制物或微管组装抑制物接触所述蓖麻种子，从而产生多倍体蓖麻种子，所述多倍体蓖麻种子产生的所述多倍体蓖麻植物的繁殖力至少相同于所述同基因的二倍体蓖麻祖代。所述多倍体蓖麻植物是四倍体。

但是，我国蓖麻多倍体育种还处于空白，目前尚未见报道，其原因是蓖麻多倍体诱变非常困难。蓖麻多倍体育种之所以困难，是因为蓖麻种子结构很特殊，储存的营养非常丰富，可以保持至4片真叶期营养的需要，很难吸收外来诱变剂，所以蓖麻四倍体诱变难度很大。

发明内容：

本发明的目的是提供一种四倍体蓖麻的培育方法。该方法是采用混合诱变剂，在蓖麻种子萌发过程中去除胚乳,强迫裸胚吸收诱变剂，打断纺锤丝的形成，大大提高了诱变频率，首次在国内获得了蓖麻纯合四倍体新品系,采用F1代幼叶进行染色体分析与鉴定，减

少了嵌合体和非整倍体的混杂，大大提高了纯合四倍体的筛选频率。通过对F2代植株经济性状的分析筛选,3-4年就培育出具有优良性状的四倍体蓖麻新品系(种)。

本发明提供的一种四倍体蓖麻的培育方法包括以下步骤：在收集全国蓖麻种质资源建立蓖麻种质资源圃的基础上，通过对蓖麻形态学分析和染色体倍性鉴定，选取优良的二倍体蓖麻品种作为四倍体诱变材料；采用混合诱变剂对人工去除蓖麻胚乳的蓖麻裸胚进行强迫吸收法进行四倍体加倍处理，取F1代新生幼叶进行染色体分析与倍性鉴定，去除嵌合体和非整倍体，筛选出纯合四倍体蓖麻植株，按照蓖麻常规栽培方法进行大田种植与栽培管理。

本发明提供的一种四倍体蓖麻的培育方法包括以下步骤：

1)首先对我国蓖麻栽培品种与野生资源进行广泛收集，建立蓖麻种质资源圃；

2)对蓖麻种质资源进行细胞学分析与染色体倍性鉴定；采用植物染色体标本制备的去壁低渗法进行蓖麻染色体标本制备。蓖麻染色体基数为x＝10，体细胞二倍体染色体数目为2n＝2x＝20；

3)根据形态学、经济性状分析和倍性鉴定结果，从中筛选出优良的二倍体蓖麻品系；选取农艺性状优良二倍体蓖麻品种作为四倍体蓖麻诱变材料；

4)采用常规消毒方法进行种子无菌消毒，然后去除胚乳，剥出种胚，放入1/2MS培养基中，在23℃±2℃条件下进行无光照培养至种胚萌发；

所述常规消毒方法为用75％酒精消毒60秒，无菌水冲洗，然后用2％次氯酸钠消毒15分钟，无菌水冲洗3次；

5)进行四倍体人工诱变，转入含有质量的秋水仙素和胺磺灵(Oryzalin)混合诱变剂溶液中，在15～20℃较低温度的黑暗条件下加倍处理48～72小时；所述混合诱变剂的终浓度为0.01％；所述秋水仙素和胺磺灵溶液的质量浓度分别为0.02％；

6)转入1/2MS培养基中，在23℃±2℃，光照1000Lux，16小时/天，继续培养；

7)待幼苗发育至4片真叶期，根长3～5公分，进行瓶苗移栽，移栽到消毒的土壤中；移栽前3天打开瓶盖进行炼苗；移栽苗管理阶段：加倍处理的幼苗损伤较大，生长缓慢，要精心管理，加强温度与湿度的控制，减少苗的非正常死亡，成活率达到90％以上；

所述移栽苗管理的条件为：温度保持在25℃±2℃，湿度65％±5，土壤条件为普通沙壤土；

8)取F1代种胚新生的幼叶进行染色体分析与倍性鉴定，去除嵌合体和非整倍体，筛选出纯合四倍体植株；

所述染色体分析与倍性鉴定步骤为：上午8～9点取新生的幼叶，用0.002M 8-羟基喹啉进行前处理3-4小时，然后按植物染色体标本制备的去壁低渗法流程进行蓖麻染色体标本制备，去除嵌合体和非整倍体植株，选取体细胞染色体为2n＝4x＝40的植株，即筛选出纯合四倍体植株；

9)按照蓖麻常规栽培方法进行四倍体蓖麻大田种植与栽培管理，对四倍体蓖麻F1代种子再次进行倍性鉴定与染色体分析，去除嵌合体与非整倍体，因为蓖麻F1代中存在较低频率的嵌合体和非整倍体，需要重复鉴定，选出纯合四倍体蓖麻新种质。

术语:胺磺灵的英文通用名：Oryzalin，又称水稻素；中文别名：氨磺乐灵，氨磺灵；商品名称：Surflan，生产厂家：美国Dow Agrosciences公司,化学名称：3,5-二硝基N4，N4-丙基磺胺(3,5-dintro-N4，N4-dipropyl sulfanilamide),化学结构式：



本发明提供了一种四倍体蓖麻的培育方法。采用去除胚乳，强迫种胚直接吸收诱变剂，提高了蓖麻四倍体诱变频率，使诱变率达到50％左右。同时蓖麻根系发达，吸收诱变剂的能力很强，致使根很容易加倍，造成根部的多倍体和嵌合体诱变率很高，所以倍性鉴定不能以根为材料，本发明以F1代幼叶为材料，进行染色体倍性鉴定，可以有效地排除嵌合体和非整倍体，极大提高了纯合四倍体的筛选频率。

附图说明

图1：二倍体蓖麻植株外形(a)，染色体数目为2n＝2x＝20(b)。

图2：四倍体蓖麻植株外形(a)，染色体数目为2n＝4x＝40(b)。

图3：二倍体蓖麻种子(b)与四倍体蓖麻种子外形(a)比较。

图4:蓖麻种质资源圃图。

具体实施方式

本发明突出的特点和显著进步可从下述实例中得以体现，但不会对本发明作任何限制。

本发明提供的一种四倍体蓖麻的培育方法包括以下步骤：

1)种质资源收集：从全国不同地区收集了蓖麻栽培品种和野生资源49份，国外品种5份(见表1)，包括我国云南、四川、江苏、新疆、山东、山西、河北、天津以及以色列和法国等地，建立蓖麻种质资源圃(见图4)；

表1. 54份蓖麻种质资源的类型、品种和来源



2)对蓖麻种质资源进行细胞学分析与染色体倍性鉴定：采用植物染色体标本制备的去壁低渗法进行蓖麻染色体标本制备。蓖麻染色体基数为x＝10，体细胞二倍体染色体数目为2n＝2x＝20；

3)根据形态学、经济性状分析和染色体倍性鉴定结果，从中筛选出优良的二倍体蓖麻品系；选取优良二倍体蓖麻品种作为四倍体诱变材料；

4)采用常规消毒方法进行种子无菌消毒，然后去除胚乳，剥出种胚，放入1/2MS培养基中，在23℃±2℃条件下进行无光照培养至种胚萌发；

所述常规消毒方法为用75％酒精消毒60秒，无菌水冲洗，然后用2％次氯酸钠消毒15分钟，无菌水冲洗3次；

5)进行四倍体人工诱变，将萌发的幼小种胚转入含有质量的秋水仙素和胺磺灵(水稻素)混合诱变剂溶液中，在15～20℃较低温度的黑暗条件下加倍处理48～72小时；

混合诱变剂的配制：首先分别配制0.02％秋水仙素(质量百分比浓度)和0.02％胺磺灵，然后按体积比1：1混合，秋水仙素与胺磺灵的最终浓度为0.01％。

6)转入1/2MS培养基中继续培养，在23℃±2℃，光照1000Lux，16小时/天，继续培养；

7)在真叶生长至4片以上，根系发育正常后进行幼苗移栽，移栽前3天打开瓶盖进行炼苗，移栽到消毒的土壤中。加倍处理后的幼苗损伤较大，移栽后要加强管理，温度保持在25℃±2℃，湿度65％左右，减少苗的非正常死亡；

8)染色体分析与倍性鉴定：上午8～9点取新生的幼叶，用0.002M 8-羟基喹啉进行前处理3-4小时，然后按植物染色体标本制备的去壁低渗法流程进行蓖麻染色体标本制备，去除嵌合体和非整倍体植株，选取体细胞染色体为2n＝4x＝40的植株，即筛选出纯合四倍体植株，幼苗继续培养；

9)大田移栽：按照蓖麻常规栽培方法进行大田种植与栽培管理。对四倍体蓖麻F1代种子再次进行倍性鉴定与染色体分析，去除嵌合体与非整倍体，因为蓖麻F1代中存在较低频率的嵌合体和非整倍体，需要重复鉴定，选出纯合四倍体蓖麻新种质。

具体应用实施例

2013年5月～12月，从全国不同地区收集蓖麻栽培品种和野生资源54份，首先对其进行染色体分析与倍性鉴定，确定蓖麻染色体基数为x＝10，体细胞染色体均为二倍体，即：2n＝2x＝20；2014年4月从以上种质资源中选出优良的二倍体蓖麻作为四倍体诱变材料进行四倍体人工诱变。首先采用常规消毒方法进行种子无菌消毒，即：在无菌条件下用75％酒

精消毒60秒，无菌水冲洗，2％次氯酸钠消毒15分钟，无菌水冲洗3次，随后去除胚乳，剥出种胚，放入1/2MS培养基中，在23℃±2℃条件下进行无光照培养至种胚萌发；然后进行四倍体人工诱变，将萌发的幼小种胚转入含有质量的秋水仙素和胺磺灵混合诱变剂溶液中，在15～20℃较低温度的黑暗条件下加倍处理48～72小时；后转入1/2MS培养基中继续培养，在23℃±2℃，光照1000Lux，16小时/天，继续培养；

混合诱变剂的配制：首先分别配制0.02％秋水仙素(质量百分比浓度)和0.02％胺磺灵的水溶液，然后按体积比1：1混合，秋水仙素与胺磺灵的最终浓度为0.01％。

2014年5月对人工诱变的材料进行幼苗移栽，然后对幼苗的倍性逐一鉴定，即：前处理：上午8:00取幼叶放入0.002M 8-羟基喹啉中，在20～22℃条件下处理3～4h→前低渗：0.075M KCl 22℃低渗15分钟→去壁：2.5％混合酶(果胶酶+纤维素酶)25℃酶解处理60分钟→后低渗：0.075M KCl 25℃低渗15分钟→固定：3:1(甲醇：冰醋酸)固定液固定30分钟以上→染色体标本制备→染色：40:1(磷酸缓冲液：Giemsa)染色液染色60分钟→显微镜观察，进行染色体分析与倍性鉴定，选取纯合四倍体植株，淘汰嵌合体与非整倍体植株；2014年6月进行大田移栽，按照蓖麻常规栽培方法进行栽培管理；2014年10月收获四倍体蓖麻F1代种子；2014年12月对四倍体蓖麻种子再次进行染色体鉴定，淘汰F1代种子中仍可能存在较低频率的嵌合体与非整倍体；2015年4月进行四倍体蓖麻的大田种植(见图1～图3二倍体蓖麻与四倍体蓖麻的比较结果)。

该方法是采用混合诱变剂，在蓖麻种子萌发过程中去除胚乳,强迫裸胚吸收诱变剂，打断纺锤丝的形成，大大提高了诱变频率，首次在国内获得了纯合四倍体蓖麻新品系,采用F1代幼叶进行染色体分析与鉴定，减少了嵌合体和非整倍体的混杂，大大提高了纯合四倍体的筛选频率。