本发明提供了一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用,该模型以天然或化学合成聚合物为基质材料,制备亚微米级微球,内部包埋或表面固定细胞因子,与细胞共培养,形成含有微球的复合细胞聚集体,实现由内而外调控聚集体内细胞生物学活性。该模型可用于干细胞三维状态下增殖、分化的研究,克服了传统干细胞三维培养时由于培养基中液性因子传质不均、作用时间短而导致的细胞聚集体组成/结构非均质、细胞增殖效率低及定向诱导分化效率低的问题,可在三维立体仿生条件下模拟细胞‑细胞、细胞‑细胞外基质以及细胞‑可溶性因子间的相互作用,为体外构建和优化干细胞培养技术,以及组织工程化构建各类组织器官类似物或等同物提供理论和技术支持。
1.一种三维复合细胞聚集体模型,其特征在于:是内部含有微球的干细胞聚集体,由所述微球表面固定化基因工程钙黏素蛋白家族的融合蛋白分子,该融合蛋白分子与干细胞通过干细胞自有的钙黏素粘附因子进行构建,进而使所述微球与干细胞通过促聚集三维共培养而获得的,具体方法为:
(1)使用天然或化学合成聚合物制备缓慢释放生长因子的亚微米级微球,所述聚合物的粒径范围在15±5μm;
(2)将经过真核细胞蛋白表达体系表达并纯化的hE-cad-Fc融合蛋白稀释,浸泡微球,在4℃至37℃,孵育0.5-24小时;
(3)弃上清,用PBS淋洗1-3遍,除去未稳定固定的融合蛋白hE-cad-Fc,获得hE-cad-Fc基质化的微球;
(4)将干细胞与上述hE-cad-Fc基质化微球混匀,通过悬滴法、离心法培养技术促进微球与干细胞形成三维含材料微球的多细胞聚集体。
2.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型,其特征在于:所述步骤(4)中离心法培养技术为采用Stem Cell AggrewellTM进行培养,1000rpm离心5min后静置培养16h。
3.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型,其特征在于:所述聚合物为天然聚合物,包括胶原、明胶、海藻酸、壳聚糖、透明质酸;或为化学合成聚合物,包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚乙二醇或聚苯乙烯。
4.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型,其特征在于:所述干细胞为胚胎干细胞或间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型,其特征在于:所述融合蛋白分子是利用基因工程技术将E-钙黏素蛋白胞外域和免疫球蛋白Fc结构域基因重组,构建含有E-钙黏素蛋白和Fc双功能融合蛋白基因序列,经基因转染、表达及分离纯化而制得,所述融合蛋白分子通过Fc介导固定于微球表面。
6.根据权利要求1所述的三维复合细胞聚集体模型,其特征在于:所述融合蛋白分子hE-cad-Fc的碱基序列为序列1所述序列。
7.权利要求1-6之一所述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,其特征在于:具体步骤如下:
(1)使用天然或化学合成聚合物制备缓慢释放生长因子的亚微米级微球,所述聚合物的粒径范围在15±5μm;
(2)将经过真核细胞蛋白表达体系表达并纯化的hE-cad-Fc融合蛋白稀释,浸泡微球,在4℃至37℃,孵育0.5-24小时;
(3)弃上清,用PBS淋洗1-3遍,除去未稳定固定的融合蛋白hE-cad-Fc,获得hE-cad-Fc基质化的微球;
(4)将干细胞与上述hE-cad-Fc基质化微球混匀,通过悬滴法、离心法方法诱导干细胞形成三维聚集体。
8.根据权利要求7所述的三维复合细胞聚集体模型的制备方法,其特征在于:所述hE-cad-Fc融合蛋白使用浓度为0.1-20μg/ml。
9.根据权利要求7所述的三维复合细胞聚集体模型的制备方法,其特征在于:所述细胞与hE-cad-Fc基质化微球混合比例为1:1-10:1。
10.权利要求1-6之一所述三维复合细胞聚集体模型的应用,其特征在于:能够用于提高材料的干细胞黏附、增殖以及批量扩增及经时、定向调控诱导干细胞分化、及分化细胞功能的表达和维持。
技术领域
[0001]本发明涉及细胞体外培养技术领域,尤其是一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]在体内,细胞处于一个高度信息化的微环境中,其中包括各种时间/空间动态变化的物理化学信号,细胞受各种信号刺激调控,以实现其特定的生物学功能。这种细胞与微环境间的相互作用包括来自周围细胞、细胞外基质和可溶性因子的各种复杂的生物化学、生物力学和生物电学等信号刺激响应。其中,细胞与细胞之间是通过直接接触或旁分泌可溶性因子而发生相互作用。这种细胞间的通讯作用是维持细胞、组织及器官结构与功能的重要环节,同时也是调节体内外组织修复与重建的关键因素。如何有效模拟体内微环境、调控细胞与外界微环境间的相互作用,对于细胞形态与功能的维持以及体外组织的仿生重建至关重要。细胞三维培养(three-dimensional cell culture,TDCC)是指将具有三维结构的材料载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。该培养方式中通过载体材料的设计与制备,既能最大程度的模拟体内环境使细胞功能稳定表达,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势,是目前体内外组织结构及其功能重建的最常用手段之一。
[0003]近年来,利用干细胞体外三维扩增及诱导分化的方法,进行体内组织修复的策略已成为生命科学、再生医学等领域的研究热点。其中,胚胎干细胞(ESCs)由于其具有在体内、外向多种类型组织细胞分化的潜能,具有广阔的应用前景。间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,且在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,能够作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
[0004]胚胎干细胞的分化应首先在无血清的培养基中诱导其聚集形成细胞聚集体,即拟胚体(EB),此后模仿体内胚胎发生的条件,依次改变拟胚体的生长环境,诱导其分化出特定细胞。而现有的MSCs的扩增及诱导分化方法主要为二维平板培养。由于在三维培养体系中细胞的生长方式更接近体内,能够更为真实的模拟复杂的体内细胞微环境,促进干细胞体外诱导分化,有学者采用模拟胚胎干细胞拟胚体(EB)的形态结构制备间充质干细胞聚集体,发现该培养方式能够提高间充质干细胞中细胞因子的分泌,还能显著提高细胞诱导分化效率。但是,目前以上二者的培养及定向诱导分化过程中均存在有长期培养细胞活性降低,诱导分化效率较低,诱导效果不稳定,以及体内诱导效果不确切等问题亟待解决,限制其进一步向临床应用转化。
[0005]借助工程学、材料学等相关学科的发展,采取在细胞聚集体中加入微球的方式,有望改善聚集体内部的结构,进而提高三维细胞聚集体中细胞活性和定向诱导分化效率。但目前学者采用的微球材质主要为常见的天然细胞外基质或合成化学材料,并没有脱离传统细胞培养中基于整合素家族信号分子改善材料与细胞相互作用的设计思路。
[0006]钙黏素蛋白是细胞间黏着连接的重要组成成分,具有介导细胞-细胞间特异性链接的功能。有文献表明,E-钙黏素融合蛋白能够促进多种细胞增殖并提高细胞活性。如T.AKaike课题组率先构建了鼠源E-cadherin胞外域和IgG蛋白Fc端重组蛋白mE-cadherin-Fc。实验结果表明,以胶原对照,鼠肝原代细胞能够在细胞膜蛋白E-cadherin介导下更好地粘附于mE-Cadherin-Fc涂膜的平板表面,且细胞DNA合成活性降低和色氨酸合酶的表达保持不变,同时,该课题组也将mE-cadherin-Fc应用于鼠源胚胎干细胞的培养,发现胚胎干细胞在该平板表面不形成集落,能够大量扩增并且显著抑制细胞自分化。目前有关人源钙黏素蛋白的相关研究则少见报道。本发明人先前曾在包被有人源细胞膜蛋白E-钙黏素的培养平板上二维培养人骨髓间充质干细胞,将细胞与细胞间相互作用转化到细胞与基质之间,发现在hE-Cad-Fc融合蛋白基质显著改善二维培养间充质干细胞的粘附、增殖及肝定向诱导分化效率。
[0007]在此背景下,通过基因工程技术制备具有E-钙黏素功能的融合蛋白,并用于生物材料微球的表面改性,制备E-钙黏素介导的生物材料微球与干细胞的复合细胞聚集体,建立更加有效促进间充质干细胞扩增及定向诱导分化的细胞三维培养技术,对于细胞-细胞、细胞-细胞外基质以及细胞-可溶性因子间的相互作用、以及体外构建间充质干细胞组织工程化各类组织器官类似物或等同物的研究具有重要的理论研究意义和应用开发价值。
发明内容
[0008]本发明所要解决的技术问题在于提供一种三维复合细胞聚集体模型,该模型充分考虑三维聚集体微环境中细胞间相互接触较强的特点,首次提出以细胞间黏附因子表面改性控释细胞生长因子的微球,通过钙黏素和黏着连接信号分子促进微球与细胞共培养形成微球/干细胞复合微球,是一种实现从聚集体内部调控聚集体细胞生物学活性的干细胞培养技术。
[0009]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法。
[0010]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述三维复合细胞聚集体模型的应用。
[0011]为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
[0012]一种三维复合细胞聚集体模型,是内部含有微球的干细胞聚集体,由所述微球表面固定化基因工程钙黏素蛋白家族的融合蛋白分子,该融合蛋白分子与干细胞通过干细胞自有的钙黏素粘附因子进行构建,进而使所述微球与干细胞共培养而获得。
[0013]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述微球是通过天然或化学合成聚合物制备而成的,其粒径范围在0.5-40μm。
[0014]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述聚合物为天然聚合物,包括胶原、明胶、海藻酸、壳聚糖、透明质酸;或为化学合成聚合物,包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚乙二醇或聚苯乙烯。
[0015]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述微球内部或表面可缓释或固定细胞活性因子。
[0016]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述干细胞为胚胎干细胞或间充质干细胞。
[0017]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述基因工程钙黏素蛋白家族的融合蛋白分子,包括钙黏素蛋白的胞外域和免疫球蛋白的Fc结构域,并通过Fc介导的物理或化学结合,用于各种形态的材料本体或/及材料表面修饰,提高材料的亲水性和钙黏素蛋白介导的细胞特异性粘附,改善材料的生物相容性。
[0018]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述融合蛋白分子的种类是E-钙黏素蛋白。
[0019]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述融合蛋白分子是利用基因工程技术将E-钙黏着蛋白胞外域和免疫球蛋白Fc结构域基因重组,构建含有E-钙黏着蛋白和Fc双功能融合蛋白基因序列,经基因转染、蛋白表达及分离纯化而制得。
[0020]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述融合蛋白分子通过Fc介导固定于微球表面,与干细胞混合均匀后以离心或悬滴法制备含有微球的微球/细胞复合聚集体,随后保持其三维结构进行长期培养,以达成通过组织工程学原理和技术实现三维细胞-基质间的相互作用与细胞-细胞间相互作用的同效替代,有效改善细胞聚集体内部结构及细胞功能调控。
[0021]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述融合蛋白分子是含有目的基因人上皮细胞钙黏素粘附因子hE-cadherin的胞外域hE-cad、人免疫球蛋白IgG1的Fc段结构域Fc基因重组构建的真核细胞表达基因hE-cad-Fc,其碱基序列为序列表<400>1所述序列。
[0022]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述融合蛋白分子是由基因质粒经真核细胞基因转染、蛋白表达及蛋白A亲和层析柱分离纯化而制得的hE-cad-Fc融合蛋白,所得蛋白进行SDS-PAGE和Westernblot分析,其碱基序列为序列表<400>1所述序列。
[0023]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述基因质粒获得的具体步骤为:采用基因重组PCR技术扩增目的基因hE-cad和Fc序列,并分别通过双酶切连接并嵌入真核细胞表达基因质粒载体pcDNA3.1中,得到含有双功能目的基因hE-cad-Fc片段的真核细胞表达基因质粒pcDNA3.1-E-cad-Fc,其碱基序列为序列表<400>2所述序列。
[0024]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型,所述融合蛋白分子的使用浓度范围为0.1-20μg/ml。
[0025]上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,具体步骤如下:
[0026]第一、使用天然或化学合成聚合物制备缓慢释放生长因子的亚微米级微球;
[0027]第二、将经过真核细胞蛋白表达体系纯化的hE-cad-Fc融合蛋白稀释,浸泡微球,在4℃至37℃,孵育0.5-24小时;
[0028]第三、弃上清,用PBS淋洗1-3遍,除去未稳定固定的融合蛋白hE-cad-Fc,获得hE-cad-Fc基质化的微球;
[0029]第四、将干细胞与上述hE-cad-Fc基质化微球混匀,通过悬滴法、离心法等方法诱导干细胞形成三维聚集体,或将细胞包裹于水凝胶,多孔支架等三维培养环境中,使其自发形成细胞聚集体。
[0030]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,所述天然聚合物为胶原(Collagen)、明胶(Gelatin)、海藻酸(Alginate)、壳聚糖(Chitosan)、透明质酸(Hyaturonic acid)或对以上材料进行化学修饰而成的聚合物。
[0031]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,所述化学合成聚合物为聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、聚乙二醇(PEG)或聚苯乙烯(PS)或对以上材料进行化学修饰而成的聚合物。
[0032]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,所得到的微球的粒径范围在0.5-40μm。
[0033]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,所述hE-cad-Fc融合蛋白使用浓度为0.1-20μg/ml。
[0034]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,所述细胞与hE-cad-Fc基质化微球混合比例为1:1-10:1。
[0035]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型的制备方法,所述细胞聚集体制备方法为悬滴培养48h-72h,或离心后培养12-24h。
[0036]上述三维复合细胞聚集体模型的应用,能够用于提高间充质干细胞黏附、增殖、批量扩增以及经时、定向调控间充质干细胞诱导分化及分化细胞的功能表达。
[0037]优选的,上述三维复合细胞聚集体模型的应用,能够用于研究细胞-细胞、细胞-细胞外基质以及细胞-可溶性因子间的相互作用,以及体外间充质干细胞扩增培养、构建组织工程化各类组织器官类似物或等同物。
[0038]本发明的有益效果是:
[0039]一、本发明利用亚微米级微球缓释细胞因子、并以人E-钙粘素介导生物材料与细胞间相互作用形成可由内而外调控细胞生物学活性的三维复合细胞聚集体模型。该模型可用于干细胞三维状态下增殖、分化的研究,克服了传统干细胞三维培养由外向内调控受传质阻力影响引起细胞非均质生长、以及接触抑制增殖等的不足,为体外构建和优化干细胞三维仿生培养技术,以及组织工程化构建各类组织器官类似物或等同物提供理论和技术支持。
[0040]二、本发明利用基因工程原理和技术,将人上皮细胞E-钙黏素的胞外域与人免疫球蛋白IgG 1 Fc段融合,制备了具有E-钙黏素蛋白和Fc双功能的融合蛋白。
[0041]三、本发明的融合蛋白通过Fc介导在材料表面自组装形成单分子层,实现材料表面改性,提高材料的亲水性,改善材料的生物相容性,加强了细胞与材料的特异性相互作用,并进一步调控细胞内信号通路。
[0042]四、本发明的hE-cad-Fc融合蛋白通过在微球表面基质化固定,在三维聚集体培养条件下有效的促进干细胞增殖和分化功能表达,促进实现组织工程、再生医学相关种子细胞的批量扩增及诱导分化。
[0043]五、本发明的融合蛋白基质化固定方法简单易行,修饰效率高且稳定性好,降低了实验成本。利用本发明构建的三维聚集体模型可更有效实现细胞三维仿生培养,为考察细胞-细胞、细胞-细胞外基质和细胞-可溶性因子间的相互作用、考察特定细胞因子在三维聚集体中对细胞的生长、迁移、增殖与分化等生物学行为的调控规律与机制、揭示干细胞定向分化的分子调控机制等基础与应用研究提供干细胞培养技术。
附图说明
[0044]图1是重组质粒构建示意图;
[0045]图2是重组质粒鉴定;
[0046]图3是纯化融合蛋白鉴定;
[0047]图4是不同浓度hE-cad-Fc融合蛋白对其在PLGA微球表面基质化的蛋白固定量的定量检测;
[0048]图5是在PLGA微球表面基质化固定hE-cad-Fc融合蛋白的免疫荧光检测;
[0049]图6是hE-cad-Fc融合蛋白基质化表面改性PLGA微球对间充质干细胞增殖的影响;
[0050]图7是hE-cad-Fc融合蛋白基质化表面改性PLGA微球对间充质干细胞形态的影响;
[0051]图8是三维复合细胞聚集体模型示意图;
[0052]图9是单纯细胞聚集体以及微球/细胞复合聚集体形态的光镜照片;
[0053]图10是hE-cad-Fc融合蛋白基质化表面改性PLGA微球对三维复合间充质干细胞聚集体细胞增殖的影响;
[0054]图11是hE-cad-Fc融合蛋白基质化表面改性PLGA微球对三维复合间充质干细胞聚集体细胞活性的影响。
[0055]图12是hE-cad-Fc融合蛋白基质化表面改性PLGA微球对三维复合间充质干细胞聚集体中细胞膜信号通路的影响。
具体实施方式
[0056]下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0057]实施例1获得pcDNA3.1-hE-cad-Fc基因质粒
[0058]利用基因重组技术将人上皮细胞黏附因子(hE-cadherin)胞外域(hE-cad)和人免疫球蛋白(IgG 1)Fc段(Fc)进行融合,得到含有目的基因hE-cad和Fc的质粒pcDNA3.1-hE-cad-Fc。即:以人E-cadherin mRNA(Gene bank:NM 004360.3)全长为模版,利用合成的引物特异性扩增hE-cadherin胞外域片段。引物序列为:
[0059]5’-CGCAAGCTTATGGGCCCTTG-GAGCCGCAGC-3’;
[0060]5’-TTGCGGCCGCAGGCAGGAATTTGCAATCCTGC-3’。
[0061]如图1所示,1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,将胶回收PCR产物经Hind III和Not I双酶切后,插入pcDNA3.1-Fc的Hind III和Not I位点之间。质粒pcDNA3.1-Fc由东京工业大学赤池敏宏教授惠赠。
[0062]如图2所示,重组表达质粒经Hind III和Not I双酶切电泳鉴定,显示切出与目的基因大小一致的DNA片段,将此质粒载体命名为pcDNA3.1-hE-cad-Fc。
[0063]测序检测表明pcDNA3.1-hE-cad-Fc全长序列共计3020个碱基,该基因质粒的碱基序列为序列表中<400>2所示序列。
[0064]实施例2获得hE-cad-Fc融合蛋白
[0065]将实施例1构建的含有目的基因的质粒pcDNA3.1-hE-cad-Fc转染293F细胞,悬浮培养72h,收集细胞培养上清液,利用rProtein AFF柱对hE-cad-Fc融合蛋白进行纯化。纯化的融合蛋白利用抗E-cadherin抗体通过免疫印迹检测,如图3所示,图中没有其他非特异性曝光条带出现,分子量大小约为120KD的条带为还原态E-cadherin(图3中1),240KD处条带为非还原E-cadherin(图3中2)。此结果说明,本发明制备得到了hE-cad-Fc融合蛋白,其碱基序列为序列表中<400>1所示序列,该融合蛋白非还原态能够形成稳定二聚体结构。
[0066]实施例3 hE-cad-Fc融合蛋白基质化表面改性PLGA微球的制备
[0067]首先通过化学合成聚合物PLGA制备获得粒径范围在15±5μm的微球置于EP管中;随后将上述hE-cad-Fc融合蛋白溶液稀释至10μg/ml,浸泡微球,37℃孵育2小时;离心弃上清,用PBS淋洗3遍除去未被固定的融合蛋白hE-cad-Fc,获得hE-cad-Fc基质化表面改性PLGA微球,并将其命名为hE-cad-Fc-PLGA。
[0068]本发明通过Elisa法检测hE-cad-Fc溶液的蛋白浓度对PLGA微球基质化表面改性的影响。hE-cad-Fc基质化方法同上。即:获得hE-cad-Fc-PLGA后,加入1%BSA室温封闭1h,加入抗E-cadherin抗体37℃孵育1h,PBST清洗3次后加入生物素标记二抗37℃孵育30min,PBS清洗3次,而后加入TBA显色液于37℃避光孵育10min,加入终止液,离心取上清100μl加入96孔板中,于10min内使用酶标仪在450nm波长下读板取得结果。如图4所示,随着hE-cad-Fc溶液浓度的提高,PLGA微球表面基质化hE-cad-Fc蛋白量逐渐升高。
[0069]如图5所示,通过对PLGA和hE-cad-Fc-PLGA进行E-cadherin免疫荧光染色观察检测hE-cad-Fc融合蛋白在微球表面的分布。在融合蛋白固定后,以1%BSA室温封闭1h,加入抗E-cadherin抗体4℃孵育过夜,PBST清洗3次后加入荧光标记二抗37℃孵育1h,PBS清洗3次,吸取微球滴加至载玻片上,封片后在激光共聚焦显微镜下观察。实验结果表明,hE-cad-Fc-PLGA表面均匀覆盖有hE-cad-Fc融合蛋白。
[0070]实施例4 hE-cad-Fc-PLGA对间充质干细胞增殖及形态的影响
[0071]本发明采用CCK-8法检测PLGA微球、hE-cad-Fc-PLGA对脐带间充质干细胞增殖的影响。首先将hE-cad-Fc-PLGA、未固定蛋白的PLGA微球(对照组)与间充质干细胞以1:1的数量比混匀,取每孔5000个间充质细胞、每孔5000个间充质细胞+5000个PLGA微球、及每孔5000个间充质细胞+5000h个hE-cad-Fc-PLGA微球加入96孔板,37℃5%CO2恒温细胞培养箱中培养5天,每天测定细胞活力,具体方法为:每孔加入10ulCCK-8,孵育4h后,酶联免疫监测仪检测OD450nm,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标做图,见图6。
[0072]利用细胞骨架免疫荧光染色方法观察细胞的形态,实验分组处理同上。以每孔2*104个间充质细胞,细胞与微球1:1的比例铺种于24孔板,37℃5%CO2恒温细胞培养箱中培养5天,4%的多聚甲醛溶液进行细胞固定5min,用0.1%Tritonx-100进行细胞透膜处理10min。细胞用1%牛血清白蛋(BSA)室温封闭1h。用FITC-鬼笔环肽标记细胞骨架微丝(绿),PI标记细胞核(红),荧光共聚焦显微镜下观察,见图7。
[0073]以上结果显示,hE-cad-Fc基质化微球能够募集间充质干细胞粘附,并促进细胞增殖。
[0074]实施例5三维复合细胞聚集体模型构建
[0075]如图8所示,通过将人上皮细胞粘附因子hE-cad-Fc融合蛋白基质化固定于PLGA的微球(hE-cad-Fc-PLGA)表面,制备由间充质干细胞以及融合蛋白微球混合形成细胞聚集体,形成复合细胞三维培养模型。该模型的具体构建方法如下:
[0076]第一、化学合成聚合物PLGA制备而成的微球,粒径范围在15±5μm;
[0077]第二、将经过真核细胞蛋白表达体系纯化的hE-cad-Fc融合蛋白稀释至10μg/ml,浸泡微球,37℃孵育2小时;
[0078]第三、弃上清,用PBS淋洗3遍,除去未稳定固定的融合蛋白hE-cad-Fc;
[0079]第四、将细胞与hE-cad-Fc基质化微球以1:1的数量比混匀,6*105cells/well培养于Stem Cell AggrewellTM,1000rpm离心5min后静置培养16h,诱导微球/细胞形成复合三维聚集体。
[0080]以相差显微镜经时观察细胞形态,如图9所示,结果表明:与MSC细胞聚集体和MSC细胞与PLGA微球复合聚集体相比,MSC细胞与hE-cad-Fc-PLGA微球复合聚集体大小均一、形状完整、边缘有光滑致密的细胞层包裹,形态稳定性较高。
[0081]实施例6三维复合细胞聚集体中间充质干细胞的增殖活性检测
[0082]利用本发明构建间充质干细胞与hE-cad-Fc-PLGA三维复合细胞聚集体模型,对照组为MSC细胞聚集体、MSC细胞与PLGA微球复合聚集体(制备方法同实施例5)。将以上细胞聚集体移入超低粘附细胞培养平板中,并于day1,day2,day3,day4,day5以CCK-8法测定细胞活力,检测方法同实施例4。在培养day1及day5对细胞聚集体进行死活细胞染色(FDA/PI),以表征聚集体内部细胞存活情况。具体步骤为:在培养基中分别加入FDA(用PBS 1:1000稀释)和PI(用PBS 1:100稀释),孵育10min,荧光显微镜下观察。
[0083]如图10所示,相较于对照组(纯间充质干细胞聚集体,间充质干细胞与微球复合聚集体),该hE-cad-Fc-PLGA微球复合细胞三维培养模型中,间充质干细胞表现出更良好的增殖特性。
[0084]如图11所示,死活细胞染色(FDA/PI)结果表明,在培养5天后,相较于对照组,该hE-cad-Fc-PLGA微球复合细胞聚集体三维培养模型中,细胞活性得到了显著提高(绿色光点为活细胞)。
[0085]实施例7三维复合细胞聚集体中间充质细胞E-cadherin相关通路检测
[0086]本发明通过western blotting法检测细胞内信号通路变化。选取细胞内E-cadherin,β-catenin,p120-catenin,α-catenin膜蛋白复合物,以及AKT-t308及ERK磷酸化表达,初步揭示hE-cad-Fc融合蛋白表面改性微球对细胞膜通路的影响。
[0087]如图12所示,对MSC细胞聚集体、MSC细胞与PLGA微球复合聚集体以及MSC细胞与hE-cad-Fc-PLGA微球复合聚集体中相关MSC细胞膜蛋白通路进行检测,聚集体构建方法同实施例3。细胞聚集体形成后RAPI裂解细胞并收取总蛋白。配置10%SDS-PAGE凝胶,电泳转膜,5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入抗E-cadherin抗体4℃孵育过夜,PBST清洗3次后加入HRP标记二抗37℃孵育1min,PBS清洗3次,加入ECL发光液曝光,暗室拍摄。与对照相比,添加有hE-cad-Fc-PLGA的复合聚集体中膜蛋白β-catenin上调,且AKT-t308及ERK磷酸化水平显著提高。
[0088]因此,可以得出结论:hE-cad-Fc融合蛋白基质化能够将细胞与细胞间的黏附因子相互作用转化到细胞与基质之间,且其通过激活相关膜蛋白分子通路调控细胞生物学特性,进而有效且持久地促进间充质干细胞增殖。
[0089]上述参照实施例对该一种三维复合细胞聚集体模型及其制备方法与应用进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
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