【請求項1】

内部に粒径の範囲が0.5〜40μmであるマイクロスフェアが含まれる幹細胞の凝集体であって、前記マイクロスフェアの表面には、遺伝子工学によって合成されるカドヘリンタンパク質ファミリーの融合タンパク質分子が固定化されており、前記幹細胞のカドヘリン接着分子を通じて、前記融合タンパク質分子と前記幹細胞との組み立てが進行し、前記マイクロスフェアを前記幹細胞と共培養することにより得られる、三次元複合細胞凝集体モデル。

【請求項2】

前記マイクロスフェアはポリマーにより構成され、前記ポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、キトサン若しくはヒアルロン酸を含む天然ポリマー、又はポリ乳酸、ポログリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、ポリエチレングリコール若しくはポリスチレンを含む化学合成ポリマーであり、且つ前記ポリマーの粒径の範囲が0.5〜40μmである、請求項1記載の三次元複合細胞凝集体モデル。

【請求項3】

前記幹細胞は、胚性幹細胞又は間葉系幹細胞である、請求項1記載の三次元複合細胞凝集体モデル。

【請求項4】

前記融合タンパク質分子は、遺伝子工学技術を利用してE-カドヘリンタンパク質の細胞外ドメインを免疫グロブリンのFcドメインの遺伝子を組換え、E-カドヘリンタンパク質及びFcを含む融合タンパク質遺伝子配列を構築し、遺伝子導入、発現及び分離純化を経て製造され、

前記融合タンパク質分子は、Fc媒介によってマイクロスフェアの表面に固定される、請求項1記載の前記三次元複合細胞凝集体モデル。

【請求項5】

前記融合タンパク質分子hE-cad-Fcの塩基配列が配列番号1の配列である、請求項1の前記三次元複合細胞凝集体モデル。

【請求項6】

請求項1〜5のいずれか1項に記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法であって、

(1)天然又は化学合成高分子を用いて、粒径の範囲が0.5〜40μmであるサブミクロンマイクロスフェアを製造し;

(2)真核細胞のタンパク質表現システムによって表現且つ純化されるhE-cad-Fc融合タンパク質を希釈し、マイクロスフェアを浸し、4℃から37℃までにおいて、0.5-24時間インキュベートし;

(3)上澄み液を廃棄し、PBSで1〜3回溶出することにより、安定的に固定されていない融合タンパク質hE-cad-Fcを除去し、hE-cad-Fc基質化のマイクロスフェアを得て;

(4)幹細胞と前記hE-cad-Fc基質化のマイクロスフェアとを均一に混合し、懸滴法、遠心法等の方法によって幹細胞を誘導して三次元凝集体を形成し、又は細胞をヒドロゲル、多孔ブラケット等の三次元培養環境に包み、それを自発に細胞凝集体を形成させる、方法。

【請求項7】

前記hE-cad-Fc融合タンパク質の使用濃度は0.1-20μg/mlである、請求項6記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法。

【請求項8】

前記細胞と前記hE-cad-Fc基質化マイクロスフェアとの混合比例は1:1〜10:1である、請求項6記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法。

【請求項9】

前記細胞凝集体の製造方法は、48時間〜72時間懸滴培養し、又は遠心分離した後12〜24時間培養する、請求項6記載の三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法。

【請求項10】

材料の幹細胞接着、増殖及び大量増幅;幹細胞の分化に対する経時、指向性の調節と誘導;並びに分化した細胞機能の表現と維持を向上させるための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の三次元複合細胞凝集体モデルの使用。

【技術の分野】

【0001】

本発明は細胞の体外培養技術分野に関し、特に三次元複合細胞凝集体モデル並びにその製造方法及び応用である。

【背景技術】

【0002】

体内において、細胞は高度な情報化微小環境に位置し、その中には各種の時間/空間が動的に変化する物理化学シグナルが含まれ、細胞は各種シグナルの刺激により調節され、これによりその特定の生物学的機能を実現する。このような細胞と微小環境との相互作用は、周囲の細胞、細胞外基質と可溶性因子からの各種の複雑な生物化学、生物力学と電気生物学などのシグナル刺激応答を含む。ここにおいて、細胞と細胞との間では直接接触又はパラクリン可溶性因子によって相互に作用する。このような細胞間の通信作用は細胞、組織及び器官の構造と機能を維持する重要な部分であり、同時に体内外の組織修復と再構築を調節する肝心な要素である。いかに体内の微小環境を効果的に模擬するか、細胞と外界微小環境との間の相互作用を調節制御するかは、細胞形態と機能の維持及び体外組織のバイオニック再構築に対する重要な部分である。細胞三次元培養(three-dimensional cell culture、TDCC)は、三次元構造を有する材料キャリアと異なる種類の細胞とを体外で共培養し、細胞がキャリアの三次元空間構造にて移動し、成長することにより、三次元の細胞-キャリアポリマーを構成する。該培養方法はキャリア材料の設計と製造により、最大程度に体内環境を模擬して細胞の機能を安定に表現させることができる以上、また細胞培養の直観性及び条件の制御可能性という優位性を展示することもでき、現在体内外の組織構造及びその機能再構築に最も一般的に使用される手段の一つである。

【0003】

近年では、幹細胞の体外三次元増幅及び分化の誘導方法を利用し、体内の組織修復を行う策略が、生命科学、再生医学などの分野の研究のホットスポットである。ここにおいて、胚性幹細胞(ESCs)は、体内、体外の多種類のタイプの組織細胞に分化する潜在能力を有するため、広い応用見通しを有する。間葉系幹細胞(MSCs)は幹細胞ファミリーにある重要なメンバーであり、連続的に継代培養及び凍結保存を経た後でも依然として多方向の分化潜在能力を有し、且つ体内又は体外の特定した誘導条件で、脂肪、骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯、神経、肝臓、心筋、内皮など多種類の組織細胞に分化することができ、理想的な種細胞として老化と病理変化による組織器官の損傷修復に応用できる。

【0004】

胚性幹細胞の分化は、まず無血清培地においてそれを誘導して凝集させて細胞凝集体を形成し、即ち、胚様体(EB)で、その後体内で胚の発生する条件を模擬し、順次に胚様体の成長環境を変え、それを誘導して特定の細胞に分化させる。現在のMSCsの増幅及び分化の誘導方法は主に二次元プレートで培養することにより行われる。三次元培養システムにおける細胞の成長方法は更に体内に近似するため、複雑な体内細胞の微小環境をより真実に模擬することができ、幹細胞の体外分化の誘導を促進する。ある学者が胚性幹細胞胚様体(EB)の形態構造を使用して間葉系幹細胞凝集体を製造し、該培養方法が間葉系幹細胞におけるサイトカインの分泌、また細胞の誘導分化の効率を顕著に向上させることができることを発見している。ただし、現在以上の二つの培養及び指向性誘導分化プロセスは全部、長期に培養する際に細胞の活性が低下し、誘導分化の効率が低く、誘導の効果が安定でなく、及び体内の誘導効果が確実でないなど早期に解決すべき問題があるので、その臨床応用への更なる転化が制限される。

【0005】

工学、材料科学など相関する学科の発展の助けを借り、細胞凝集体にマイクロスフェアを加える方法により、凝集体の内部構造を改善し、それにより三次元細胞凝集体における細胞の活性と指向性誘導分化の効率を向上させるという希望に満ちている。現在の学者が使用するマイクロスフェアの材質は主に一般的な天然細胞外部基質又は合成化学材料であり、伝統的な細胞培養でインテグリンファミリーシグナル分子に基づいて材料と細胞の相互作用を改善する設計アイデアから離れない。

【0006】

カドヘリンタンパク質は細胞間の接着に対する重要な成分であり、細胞-細胞間の特異的リンクを媒介する機能を有する。文献に表明されることがあり、E-カドヘリン融合タンパク質は多種類の細胞の増殖を促進し、且つ細胞の活性を向上させることができる。T.AKaikeグループは先頭に立って、マウスE-カドヘリン細胞外ドメインとIgGタンパク質Fc端組換えタンパク質mE-カドヘリン-Fcを構築した。実験の結果は以下を表明し、コラーゲンを対照とし、マウスの初代肝細胞が細胞膜タンパク質E-cadherinの媒介作用において、mE-Cadherin-Fcコーティングのプレート表面により良く粘着することができ、且つ細胞DNAの合成活性が低下しトリプトファン合成酵素の表現は変わらなく、同時に、該グループはまたmE-cadherin-Fcをマウス胚性幹細胞の培養に応用することにより、胚性幹細胞が該プレートの表面にコロニーを形成せず、大量に増幅し、且つ細胞自身の分化を顕著に抑制できることが発見された。現在、ヒトカドヘリンタンパク質に関する研究の報道は稀である。本発明者は以前に、ヒト細胞膜タンパク質E-カドヘリンにコーティングされる培養プレートにヒト骨髄間葉系幹細胞を二次元培養し、細胞間の相互作用を細胞と基質間に転化し、これによりhE-Cad-Fc融合タンパク質の基質が二次元培養された間葉系幹細胞の粘着、増殖及び肝臓指向性誘導分化の効率を顕著に改善することを発見した。

【0007】

この背景において、遺伝子工学技術によってE-カドヘリン機能を有する融合タンパク質を製造し、且つ生物材料マイクロスフェアの表面改質に用い、E-カドヘリン媒介の生物材料マイクロスフェアと幹細胞との複合細胞凝集体を製造し、間葉系肝細胞の増幅及び指向性誘導分化を更に効果的に促進する細胞三次元培養技術を確立し、細胞-細胞、細胞-細胞外基質及び細胞-可溶性因子間の相互作用、並びに体外における間葉系幹細胞組織工学によって各種の組織や器官の類似物又は同等物を構築する研究に対して重要な理論的研究意義と応用開発価値を有する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明が解決しようとする技術問題は、三次元複合細胞凝集体モデルを提供することであり、該モデルは、三次元凝集体の微小環境にある細胞間の相互接触が比較的強い特徴をを有する点を十分に考慮し、初めて細胞間接着因子の表面改質によって細胞成長因子を制御放出するマイクロフェアを提出し、カドヘリンと接着シグナル伝達分子によってマイクロスフェアと細胞との共培養を促進してマイクロスフェア/幹細胞複合マイクロスフェアを形成し、凝集体の内部から凝集体の細胞生物学活性を調節制御する幹細胞培養技術である。

【0009】

本発明が解決しようとするもう一つの技術問題は、上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法を提供することである。

【0010】

本発明が解決しようとするもう一つの技術問題は、上記三次元複合細胞凝集体モデルの応用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記技術問題を解決するために、本発明の技術解決手段は以下の通りである:

【0012】

三次元複合細胞凝集体モデルは、内部にマイクロスフェアが含まれる幹細胞の凝集体であって、前記マイクロスフェアの表面には、遺伝子工学によって合成されるカドヘリンタンパク質ファミリーの融合タンパク質分子が固定化されており、前記幹細胞のカドヘリン接着分子を通じて、前記融合タンパク質分子と前記幹細胞との組み立てが進行し、前記マイクロスフェアを前記幹細胞と共培養することにより得られる。

【0013】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記マイクロスフェアが天然又は化学合成高分子で製造され、その粒径範囲は0.5-40μmにある。

【0014】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記ポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸等を含む天然ポリマーである;又は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-グリコール酸、ポリエチレングリコール又はポリスチレンを含む化学合成高分子である。

【0015】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記マイクロスフェアの内部又は表面に細胞活性因子を徐放又は固定することができる。

【0016】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記幹細胞が胚性幹細胞又は間葉系幹細胞である。

【0017】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記遺伝子工学によりカドヘリンタンパク質ファミリーの融合タンパク質分子が、カドヘリンタンパク質の細胞外ドメインと免疫グロブリンのFc構造ドメインを含み、且つFc媒介の物理又は化学結合により、各種の形態の材料本体及び/又は材料の表面修飾に用い、材料の親水性とカドヘリンタンパク質媒介の細胞特異性粘着を向上させ、材料の生体適合性を改善する。

【0018】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記融合タンパク質分子の種類がE-カドヘリンタンパク質である。

【0019】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記融合タンパク質分子が遺伝子工学技術を利用してE-カドヘリンタンパク質の細胞外ドメインと免疫グロブリンFc構造ドメインの遺伝子を組換え、E-カドヘリンタンパク質とFcの二重機能を含む融合タンパク質の遺伝子配列を構築し、遺伝子導入、タンパク質表現及び分離純化を経て製造される。

【0020】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記融合タンパク質分子がFc媒介によってマイクロスフェアの表面に固定され、幹細胞と均一に混合した後、遠心分離又は懸滴法でマイクロスフェアを含むマイクロスフェア/細胞複合凝集体を製造し、次にその三次元構造を保持して長期に培養し、これにより組織工学原理と技術によって三次元細胞-基質間の相互作用及び細胞-細胞間の相互作用の等効果代替を実現することに達成し、細胞凝集体の内部構造及び細胞の機能調節を効果的に改善する。

【0021】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記融合タンパク質分子が目的遺伝子のヒト上皮細胞カドヘリン粘着因子hE-カドヘリンの細胞外ドメインhE-cad、ヒト免疫グロブリンIgG1のFc段構造ドメインFcを含み、遺伝子組換えで構築される真核細胞表現遺伝子hE-cad-Fcであり、その塩基序列は配列表<400>1の前記配列である。

【0022】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記融合タンパク質分子が遺伝子プラスミドから真核細胞への遺伝子導入、タンパク質表現及びタンパク質A親和性クロマトグラフィー分離純化を経て製造されるhE-cad-Fc融合タンパク質であり、得られるタンパク質にSDS-PAGEとウェスタンブロット分析を行い、その塩基配列は配列表<400>1の前記配列である。

【0023】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記遺伝子プラスミドを得る具体的なステップが以下の通りである:遺伝子組換えPCR技術を用いて目的遺伝子hE-cad及びFc序列を増幅させ、且つそれぞれ二重消化を通じて真核細胞の表現遺伝子プラスミドキャリアpcDNA3.1の中に接続し且つ嵌めこみ、二重機能の目的遺伝子hE-cad-Fc断片を含む真核細胞の表現遺伝子プラスミドpcDNA3.1-E-cad-Fcを得て、その塩基配列は配列表<400>2の前記配列である。

【0024】

上記三次元複合細胞凝集体モデルにおいて好ましくは、前記融合タンパク質分子の使用濃度の範囲が0.1-20μg/mlである。

【0025】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法は、具体的な工程が以下のとおりである:

第一、天然又は化学合成高分子を使用して成長因子を徐々に放出するサブミクロンマイクロスフェアを製造する;

第二、真核細胞のタンパク質表現システムによって純化されるhE-cad-Fc融合タンパク質を希釈し、マイクロスフェアを浸し、4℃から37℃まで、0.5-24時間をインキュベートする;

第三、上澄み液を廃棄し、PBSで1-3回を溶出し、安定に固定されていない融合タンパク質hE-cad-Fcを除去し、hE-cad-Fc基質化のマイクロスフェアを得る;

第四、幹細胞と上記hE-cad-Fc基質化のマイクロスフェアを均一に混合し、懸滴法、遠心法等の方法によって幹細胞を誘導して三次元凝集体を形成させ、又は細胞をヒドロゲル、多孔ブラケット等の三次元培養環境に包み、それを自発に細胞凝集体を形成させる。

【0026】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法において好ましくは、前記天然ポリマーがコラーゲン(Collagen)、ゼラチン(Gelatin)、アルギン酸塩(Alginate)、キトサン(Chitosan)、ヒアルロン酸(Hyaturonic acid)又は上記の材料を化学修飾して得られる高分子である。

【0027】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法において好ましくは、前記化学合成高分子がポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸-グリコール酸(PLGA)、ポリエチレングリコール(PEG)若しくはポリスチレン(PS)又は上記の材料を化学修飾して得られる高分子である。

【0028】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法において好ましくは、得られるマイクロスフェアの粒径範囲が0.5-40μmである。

【0029】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法において好ましくは、前記hE-cad-Fc融合タンパク質の使用濃度が0.1〜20μg/mlである。

【0030】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法において好ましくは、前記細胞とhE-cad-Fc基質化マイクロスフェアとの混合比例が1:1〜10:1である。

【0031】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの製造方法において好ましくは、前記細胞凝集体の製造方法において48-72時間懸滴培養し、又は遠心分離した後12-24時間培養する。

【0032】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの使用は、間葉系幹細胞の粘着、増殖、大量増幅及び間葉系幹細胞の誘導分化に対する経時、指向性の調節制御及び分化細胞の機能表現を向上させるのに使用できる。

【0033】

上記三次元複合細胞凝集体モデルの使用は、好ましくは、細胞-細胞、細胞-細胞外基質及び細胞-可溶性因子間の相互作用に対する研究、並びに体外間葉系幹細胞の増幅培養、組織工学による各種の組織や器官の類似物又は同等物の構築に使用できる。

【発明の効果】

【0034】

本発明の有益な効果は以下のとおりである。

【0035】

一、本発明は、サブミクロンマイクロスフェアを利用して細胞因子を徐々に放出し、且つヒトE-カドヘリン媒介の生物材料と細胞間との相互作用により内から外まで細胞の生物学活性を調節制御できる三次元複合細胞凝集体モデルを形成する。該モデルは幹細胞の三次元状態における増殖、分化の研究に使用でき、伝統的な幹細胞の三次元培養において外から内までの調節制御が物質移動抵抗の影響によって引き起こす細胞の不均質成長、及び接触が増殖を影響する等の不足を克服し、体外で幹細胞三次元バイオニック培養技術を構築し最適化させ、及び組織工学により各種の組織や器官の類似物又は同等物の構築のために理論的及び技術的なサポートを提供する。

【0036】

二、本発明は遺伝子工学原理と技術を利用し、ヒト上皮細胞E-カドヘリンの細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンIgG1Fc断片とを融合し、E-カドヘリンとFcの二重機能を有する融合タンパク質を製造する。

【0037】

三、本発明の融合タンパク質は、Fc媒介によって材料の表面に自己組織化して単分子層を形成し、材料表面の改質を実現し、材料の親水性を向上させ、材料の生体適合性を改善し、細胞と材料の特異性の相互作用を強化し、且つ更に細胞内のシグナル伝達経路を調節制御する。

【0038】

四、本発明のhE-cad-Fc融合タンパク質は、マイクロスフェア表面における基質化固定によって、三次元凝集体培養条件において幹細胞の増殖と分化機能の表現を効果的に促進し、組織工学、再生医学に相関する種細胞の大量増幅及び誘導分化を促進する。

【0039】

五、本発明の融合タンパク質基質化の固定方法はシンプルで実行しやすく、修飾の効率が高く且つ安定性がよく、実験コストを低下させる。本発明を利用して構築する三次元凝集体モデルは、細胞の三次元バイオニック培養を更に効果的に実現することができ、細胞-細胞、細胞-細胞外基質及び細胞-可溶性因子間の相互作用を考察し、三次元凝集体における細胞の成長、遷移、増殖と分化等の生物学行動に対する特定のサイトカインの調節規律とメカニズムを考察し、幹細胞の指向性分化の分子調節メカニズムを掲示する等の基礎と応用研究のために幹細胞の培養技術を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】

組換えプラスミドの構築案内図である。

【図2】

組換えプラスミドの鑑定である。

【図3】

純化した融合タンパク質の鑑定である。

【図4】

異なる濃度のhE-cad-Fc融合タンパク質に対するPLGAマイクロスフェア表面基質化のタンパク質の固定量の定量検出である。

【図5】

PLGAマイクロスフェア表面に基質化固定されたhE-cad-Fc融合タンパク質の免疫蛍光検出である。

【図6】

hE-cad-Fc融合タンパク質により基質化表面改質されたPLGAマイクロスフェアの間葉系幹細胞の増殖に対する影響である。

【図7】

hE-cad-Fc融合タンパク質により基質化表面改質されたPLGAマイクロスフェアが間葉系幹細胞の形状に対する影響である。

【図8】

三次元複合細胞凝集体モデルの案内図である。

【図9】

単純な細胞凝集体及びマイクロスフェア/細胞複合凝集体形態の光学マイクロ写真である。

【図10】

hE-cad-Fc融合タンパク質により基質化表面改質されたPLGAマイクロスフェアの三次元複合間葉系幹細胞凝集体細胞の増殖に対する影響である。

【図11】

hE-cad-Fc融合タンパク質により基質化表面改質されたPLGAマイクロスフェアの三次元複合間葉系幹細胞凝集体細胞の活性に対する影響である。

【図12】

hE-cad-Fc融合タンパク質により基質化表面改質されたPLGAマイクロスフェアの三次元複合間葉系幹細胞凝集体における細胞膜のシグナル伝達経路に対する影響である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

本発明の実施態様は、薬物送達のための各種の高分子-炭化水素共役体の文脈においてここに記述される。この技術分野の当業者は、以下の本発明の詳細な説明は、単なる説明的なものに過ぎず、如何なる制限を意図するものではないと認識するだろう。本発明の他の実施態様は、この開示から利益を受ける当業者にとって自明である。本発明の詳細な実施形態は、あくまでも参考として使用される。

【実施例】

【0042】

具体的な実施方法

以下の具体的な実施例を結合して、本発明の前記技術的解決手段を更に説明する。

【0043】

実施例1;pcDNA3.1-hE-cad-Fc遺伝子プラスミドの調製

遺伝子組換え技術を利用して、ヒト上皮細胞カドヘリン(hE-cadherin)細胞外ドメイン(hE-cad)及びヒト免疫グロブリン(IgG1)のFc断片(Fc)を融合することにより、目的遺伝子hE-cad及びFcを含むプラスミドpcDNA3.1-hE-cad-Fcを得た。即ち:ヒトE-cadherin mRNA(Gene bank:NM004360.3)全長を鋳型とし、合成プライマーを利用してhE-cadherinの細胞外ドメイン断片を特異性に増幅した。プライマーの配列は以下のとおりである:

5’-CGCAAGCTTATGGGCCCTTG-GAGCCGCAGC-3’;

5’-TTGCGGCCGCAGGCAGGAATTTGCAATCCTGC-3’

【0044】

図1に示すように、1%のアガロースゲルでPCR産物を電気泳動して分析し、ゲル回収PCR産物をHind IIIとNot Iで二重消化した後、pcDNA3.1-FcのHind III部位とNot I部位との間に挿入した。プラスミドpcDNA3.1-Fcは、東京工業大学の赤池敏教授の恵贈である。

【0045】

図2に示すように、組換えプラスミドはHindIIIとNotIの二重消化電気泳動による鑑定を経て、目的遺伝子のサイズと一致するDNA断片が切り出されたことが表示され、このプラスミドキャリアをpcDNA3.1-hE-cad-Fcと名付けた。

【0046】

配列検出は、pcDNA3.1-hE-cad-Fcの全長配列に共に3020個の塩基があることを表明し、該遺伝子プラスミドの塩基配列は、配列表中の<400>2に示される配列である。

【0047】

実施例2 hE-cad-Fc融合タンパク質の調製

実施例1で構築された目的遺伝子を含むプラスミドpcDNA3.1-hE-cad-Fcを293F細胞に導入し、72時間懸濁培養し、細胞培養の上澄み液を収集し、rProteinAFFカラムを利用してhE-cad-Fc融合タンパク質を純化した。純化された融合タンパク質を抗E-カドヘリン抗体を利用して免疫ブロット法で検出した。図3に示すように、図中には他の非特異性露出ストリップが現れず、分子量のサイズが約120KDであるストリップは還元状態E-カドヘリンであり(図3における1)、240KDであるストリップは非還元E-カドヘリン(図3における2)である。この結果は、本発明によりhE-cad-Fc融合タンパク質が製造され、その塩基配列は配列番号1の配列表<400>1に示す配列であり、該融合タンパク質の非還元状態が安定な二量体構造を形成することができることを説明している。

【0048】

実施例3 hE-cad-Fc融合タンパク質により基質化表面改質されるPLGAマイクロスフェアの製造

まず、化学合成ポリマーPLGAによって粒径範囲が15±5μmにあるマイクロスフェアを製造してEPパイプに置いた;次に上記hE-cad-Fc融合タンパク質溶液を10μg/mlまで希釈し、マイクロスフェアを浸し、37℃で2時間インキュベートした;遠心分離して上澄み液を廃棄し、PBSで3回溶出して、固定されない融合タンパク質hE-cad-Fcを除去し、hE-cad-Fcにより基質化表面改質されたPLGAマイクロスフェアを得て、且つそれをhE-cad-Fc-PLGAと名付けた。

【0049】

本発明において、Elisa方法により、PLGAマイクロスフェアの基質化表面改質に対するhE-cad-Fc溶液のタンパク質濃度の影響を検出した。hE-cad-Fcの基質化方法は上記と同様である。即ち:hE-cad-Fc-PLGAを得た後、1%のBSAを加えて室温で1時間密封し、抗E-カドヘリン抗体を加えて37℃で1時間インキュベートし、PBSTで3回洗浄した後、ビオチンを加えて標識された二次抗体を37℃で30分間インキュベートし、PBSで3回を洗浄し、その後TBA現像液を加えて37℃で10分間、暗所でインキュベートし、停止液を加え、遠心分離して100μlの上澄み液を取って96マイクロプレートに加え、10分以内にエライザを使用して450nmの波長でマイクロプレートを読み取って結果を得た。図4に示すように、hE-cad-Fc溶液濃度が向上するにつれて、PLGAマイクロスフェアの表面基質化hE-cad-Fcタンパク質の量は次第に向上した。

【0050】

図5に示すように、PLGAとhE-cad-Fc-PLGAに対するE-カドヘリン免疫蛍光染色観察により、hE-cad-Fc融合タンパク質のマイクロスフェアの表面における分布を検出した。融合タンパク質が固定された後、1%のBSAを用いて室温で1時間密封し、抗E-カドヘリン抗体を加えて4℃でインキュベートして一夜を過ごし、PBSTで3回洗浄し、蛍光標識された二次抗体を加えて37℃で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、マイクロスフェアを吸い取ってスライドに滴下し、切片を密封した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。実験の結果、hE-cad-Fc-PLGAの表面に均一にhE-cad-Fc融合タンパク質が被覆されていることが表明された。

【0051】

実施例4 hE-cad-Fc-PLGAの間葉系幹細胞の増殖及び形態に対する影響

本発明において、CCK-8法を用いてPLGAマイクロスフェア、hE-cad-Fc-PLGAの臍帯間葉系幹細胞の増殖に対する影響を検出した。まず、hE-cad-Fc-PLGA及びタンパク質が固定されていないPLGAマイクロスフェア(対照グループ)を間葉系幹細胞と1:1の数量比例で均一に混合し、各孔5000個の間葉系細胞、各孔5000個の間葉系細胞+5000個のPLGAマイクロスフェア、及び各孔5000個の間葉系細胞+5000h個のhE-cad-Fc-PLGAマイクロスフェアを取って96マイクロプレートに加え、37℃で5%のCO2インキュベータで5日間培養し、毎日細胞の活性を測定した。具体的な方法は以下のとおりである:各孔に10μlのCCK-8を加え、4時間インキュベートした後、酵素結合免疫測定装置でOD450nmを検出し、結果を記録し、時間を横軸とし、吸光度を縦軸として製図した。図6参照。

【0052】

細胞骨格免疫蛍光染色方法を利用して細胞の形態を観察した。実験の組分け処理は上記と同様である。各孔2*104個の間葉系細胞で、細胞とマイクロスフェアを1:1の比率で24マイクロプレートに接種し、37℃で5%のCO2インキュベータで5日培養し、4%のデルリン溶液で5分間、細胞固定を行い、0.1%のTritonx-100で細胞半透膜を10分間処理した。1%の牛血清アルブミン(BSA)を用いて室温で1時間細胞を密封した。FITC-ファロイジンで細胞骨格マイクロフイラメント(緑)を標識し、PIで細胞核(赤)を標識し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図7参照。

【0053】

以上の結果は、hE-cad-Fc基質化マイクロスフェアが間葉系幹細胞を集めて粘着させ、且つ細胞の増殖を促進できることを表示した。

【0054】

実施例5 三次元複合細胞凝集体モデルの構築

図8に示すように、ヒト上皮細胞接着因子hE-cad-Fc融合タンパク質をPLGAマイクロスフェア(hE-cad-Fc-PLGA)の表面に基質化固定し、間葉系幹細胞及び融合タンパク質マイクロスフェアを混合して形成される細胞凝集体を製造することにより、複合細胞三次元培養モデルを製造した。該モデルの具体的な構築方法は以下の通りである:

第一、化学合成高分子PLGAで製造されるマイクロスフェアは、粒径範囲が15±5μmにあった;

第二、真核細胞タンパク質表現システムを経て純化されたhE-cad-Fc融合タンパク質を10μg/mlに希釈し、マイクロスフェアを浸し、37℃で2時間インキュベートした;

第三、上澄み液を廃棄し、PBSで3回を溶出し、安定に固定されていない融合タンパク質hE-cad-Fcを除去した;

第四、細胞とhE-cad-Fc基質化マイクロスフェアを1:1の数量比例で均一に混合し、6*105cells/wellをStem Cell AggrewellTMで培養し、1000rpmで5分間遠心分離した後、16時間静置培養し、マイクロスフェア/細胞を誘導して複合三次元凝集体を形成した。

【0055】

相差顕微鏡により経時的に細胞の形態を観察したところ、図9に示すように、以下の結果を表明した:MSC細胞凝集体及びMSC細胞とPLGAマイクロスフェアとの複合凝集体と比べ、MSC細胞とhE-cad-Fc-PLGAマイクロスフェアとの複合凝集体のサイズは均一で、形状が完全で、縁は円滑で精密な細胞層で包まれ、形態の安定性が比較的高い。

【0056】

実施例6 三次元複合細胞凝集体における間葉系幹細胞の増殖活性の検出

本発明を利用して、間葉系幹細胞とhE-cad-Fc-PLGA三次元複合細胞凝集体モデルを構築した。対照グループはMSC細胞凝集体及びMSC細胞とPLGAマイクロフェアとの複合凝集体である(製造方法は実施例5と同様である)。以上の細胞凝集体を超低粘着細胞培養プレートに移転し、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目にCCK-8法で細胞の活性を測定した。検出方法は実施例4と同様である。培養1日目及び5日目に細胞凝集体について生存細胞染色(FDA/PI)を行い、これにより凝集体内部細胞の生存状況を表示した。具体的な工程は以下のとおりである:培地にそれぞれFDA(PBSで1:1000希釈する)とPI(PBSで1:100希釈する)を加え、10分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。

【0057】

図10に示すように、対照グループ(純間葉系幹細胞凝集体、間葉系幹細胞とマイクロスフェアとの複合凝集体)と比較して、該hE-cad-Fc-PLGAマイクロスフェア複合細胞三次元培養モデルにおいて、間葉系幹細胞は更に良い増殖特性を表現する。

【0058】

図11に示すように、生存細胞染色(FDA/PI)の結果が以下を表明した。5日間培養した後、対照グループと比較し、該hE-cad-Fc-PLGAマイクロスフェア複合細胞凝集体三次元培養モデルにおいて、細胞の活性は顕著に向上した(緑の光点は生細胞である)。

【0059】

実施例7 三次元複合細胞凝集体における間葉系細胞E-カドヘリンに相関する経路の検出

本発明は、ウェスタンブロッティング法により、細胞内におけるシグナル伝達経路の変化を検出した。細胞内のE-カドヘリン、β-カテニン、p120-カテニン、α-カテニン膜タンパク質高分子、及びAKT-t308とERKを選択してリン酸化表現し、初期にhE-cad-Fc融合タンパク質により表面改質されるマイクロスフェアの細胞膜経路に対する影響を掲示した。

【0060】

図12に示すように、MSC細胞凝集体、MSC細胞とPLGAマイクロスフェアとの複合凝集体、及びMSC細胞とhE-cad-Fc-PLGAマイクロスフェアとの複合凝集体に相関するMSC細胞膜タンパク質経路を検出した。凝集体の構築方法は実施例3と同様である。細胞凝集体が形成された後、RAPIで細胞を溶解して総タンパク質を収集した。10%のSDS-PAGEゲルを調製し、電気泳動し変動し、5%の脱脂牛乳で室温において1時間密封し、抗E-カドヘリン抗体を加えて4℃で一晩インキュベートし、PBSTで3回洗浄した後、HRPでマークされた二次抗体を加えて37℃で1分間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、ECL発光液を加えて露光し、暗所で撮影した。対照と比較し、hE-cad-Fc-PLGAが添加された複合凝集体中で膜タンパク質β-カテニンは向上し、且つAKT-t308及びERKのリン酸化レベルは顕著に向上した。

【0061】

このため、以下の結論を下すことができる:hE-cad-Fc融合タンパク質の基質化は細胞と細胞間のカドヘリン相互作用を細胞と基質間に転化でき、且つそれは相関する膜タンパク質分子の経路を活性化することによって細胞の生物学的特性を調節制御し、これにより間葉系幹細胞の増殖を効果的で持続的に促進することができる。

【0062】

上記参照実施例は、三次元複合細胞凝集体モデル及びその製造方法と応用を詳細に記載した説明であって、当該説明は限定的な記載ではなく、限定される範囲に従って複数の実施例を列挙でき、このため本発明の構想全体から離れない変化と修正は、本発明の保護範囲以内に属するべきである。

【0063】

各注:遺伝子配列

融合タンパク質分子hE-cad-Fcの塩基配列は、配列表<400>1の前記配列である:

ATGGGCCCTTGGAGCCGCAGCCTCTCGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCAGGTCTCCTCTTGGCTCTGCCAGGAGCCGGAGCCCTGCCACCCTGGCTTTGACGCCGAGAGCTACACGTTCACGGTGCCCCGGCGCCACCTGGAGAGAGGCCGCGTCCTGGGCAGAGTGAATTTTGAAGATTGCACCGGTCGACAAAGGACAGCCTATTTTTCCCTCGACACCCGATTCAAAGTGGGCACAGATGGTGTGATTACAGTCAAAAGGCCTCTACGGTTTCATAACCCACAGATCCATTTCTTGGTCTACGCCTGGGACTCCACCTACAGAAAGTTTTCCACCAAAGTCACGCTGAATACAGTGGGGCACCACCACCGCCCCCCGCCCCATCAGGCCTCCGTTTCTGGAATCCAAGCAGAATTGCTCACATTTCCCAACTCCTCTCCTGGCCTCAGAAGACAGAAGAGAGACTGGGTTATTCCTCCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAAAAAGGCCCATTTCCTAAAAACCTGGTTCAGATCAAATCCAACAAAGACAAAGAAGGCAAGGTTTTCTACAGCATCACTGGCCAAGGAGCTGACACACCCCCTGTTGGTGTCTTTATTATTGAAAGAGAAACAGGATGGCTGAAGGTGACAGAGCCTCTGGATAGAGAACGCATTGCCACATACACTCTCTTCTCTCACGCTGTGTCATCCAACGGGAATGCAGTTGAGGATCCAATGGAGATTTTGATCACGGTAACCGATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGGTCTTTAAGGGGTCTGTCATGGAAGGTGCTCTTCCAGGAACCTCTGTGATGGAGGTCACAGCCACAGACGCGGACGATGATGTGAACACCTACAATGCCGCCATCGCTTACACCATCCTCAGCCAAGATCCTGAGCTCCCTGACAAAAATATGTTCACCATTAACAGGAACACAGGAGTCATCAGTGTGGTCACCACTGGGCTGGACCGAGAGAGTTTCCCTACGTATACCCTGGTGGTTCAAGCTGCTGACCTTCAAGGTGAGGGGTTAAGCACAACAGCAACAGCTGTGATCACAGTCACTGACACCAACGATAATCCTCCGATCTTCAATCCCACCACGTACAAGGGTCAGGTGCCTGAGAACGAGGCTAACGTCGTAATCACCACACTGAAAGTGACTGATGCTGATGCCCCCAATACCCCAGCGTGGGAGGCTGTATACACCATATTGAATGATGATGGTGGACAATTTGTCGTCACCACAAATCCAGTGAACAACGATGGCATTTTGAAAACAGCAAAGGGCTTGGATTTTGAGGCCAAGCAGCAGTACATTCTACACGTAGCAGTGACGAATGTGGTACCTTTTGAGGTCTCTCTCACCACCTCCACAGCCACCGTCACCGTGGATGTGCTGGATGTGAATGAAGCCCCCATCTTTGTGCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAGTGTCCGCTGGATGTGAATGAAGCCCCCATCTTTGTGCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAGTGTCCGAGGACTTTGGCGTGGGCCAGGAAATCACATCCTACACTGCCCAGGAGCCAGACACATTTATGGAACAGAAAATAACATATCGGATTTGGAGAGACACTGCCAACTGGCTGGAGATTAATCCGGACACTGGTGCCATTTCCACTCGGGCTGAGCTGGACAGGGAGGATTTTGAGCACGTGAAGAACAGCACGTACACAGCCCTAATCATAGCTACAGACAATGGTTCTCCAGTTGCTACTGGAACAGGGACACTTCTGCTGATCCTGTCTGATGTGAATGACAACGCCCCCATACCAGAACCTCGAACTATATTCTTCTGTGAGAGGAATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACATCATTGATGCAGACCTTCCTCCCAATACATCTCCCTTCACAGCAGAACTAACACACGGGGCGAGTGCCAACTGGACCATTCAGTACAACGACCCAACCCAAGAATCTATCATTTTGAAGCCAAAGATGGCCTTAGAGGTGGGTGACTACAAAATCAATCTCAAGCTCATGGATAACCAGAATAAAGACCAAGTGACCACCTTAGAGGTCAGCGTGTGTGACTGTGAAGGGGCCGCCGGCGTCTGTAGGAAGGCACAGCCTGTCGAAGCAGGATTGCAAATTCCTGCCTGCGGCCGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTAC

【0064】

配列測定により明らかにされたpcDNA3.1-E-cadherin-Fc全長の配列は、共に3020個の塩基がある:(該遺伝子プラスミドの塩基配列は、配列番号2中に示される配列である。)

TACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCGCCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAGCCTCTCGGCGCTGCTGCTGCTGCTGCAGGTCTCCTCTTGGCTCTGCCAGGAGCCGGAGCCCTGCCACCCTGGCTTTGACGCCGAGAGCTACACGTTCACGGTGCCCCGGCGCCACCTGGAGAGAGGCCGCGTCCTGGGCAGAGTGAATTTTGAAGATTGCACCGGTCGACAAAGGACAGCCTATTTTTCCCTCGACACCCGATTCAAAGTGGGCACAGATGGTGTGATTACAGTCAAAAGGCCTCTACGGTTTCATAACCCACAGATCCATTTCTTGGTCTACGCCTGGGACTCCACCTACAGAAAGTTTTCCACCAAAGTCACGCTGAATACAGTGGGGCACCACCACCGCCCCCCGCCCCATCAGGCCTCCGTTTCTGGAATCCAAGCAGAATTGCTCACATTTCCCAACTCCTCTCCTGGCCTCAGAAGACAGAAGAGAGACTGGGTTATTCCTCCCATCAGCTGCCCAGAAAATGAAAAAGGCCCATTTCCTAAAAACCTGGTTCAGATCAAATCCAACAAAGACAAAGAAGGCAAGGTTTTCTACAGCATCACTGGCCAAGGAGCTGACACACCCCCTGTTGGTGTCTTTATTATTGAAAGAGAAACAGGATGGCTGAAGGTGACAGAGCCTCTGGATAGAGAACGCATTGCCACATACACTCTCTTCTCTCACGCTGTGTCATCCAACGGGAATGCAGTTGAGGATCCAATGGAGATTTTGATCACGGTAACCGATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGGTCTTTAAGGGGTCTGTCATGGAAGGTGCTCTTCCAGGAACCTCTGTGATGGAGGTCACAGCCACAGACGCGGACGATGATGTGAACACCTACAATGCCGCCATCGCTTACACCATCCTCAGCCAAGATCCTGAGCTCCCTGACAAAAATATGTTCACCATTAACAGGAACACAGGAGTCATCAGTGTGGTCACCACTGGGCTGGACCGAGAGAGTTTCCCTACGTATACCCTGGTGGTTCAAGCTGCTGACCTTCAAGGTGAGGGGTTAAGCACAACAGCAACAGCTGTGATCACAGTCACTGACACCAACGATAATCCTCCGATCTTCAATCCCACCACGTACAAGGGTCAGGTGCCTGAGAACGAGGCTAACGTCGTAATCACCACACTGAAAGTGACTGATGCTGATGCCCCCAATACCCCAGCGTGGGAGGCTGTATACACCATATTGAATGATGATGGTGGACAATTTGTCGTCACCACAAATCCAGTGAACAACGATGGCATTTTGAAAACAGCAAAGGGCTTGGATTTTGAGGCCAAGCAGCAGTACATTCTACACGTAGCAGTGACGAATGTGGTACCTTTTGAGGTCTCTCTCACCACCTCCACAGCCACCGTCACCGTGGATGTGCTGGATGTGAATGAAGCCCCCATCTTTGTGCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAGTGTCCGAGGACTTTGGCGTGGGCCAGGAAATCACATCCTACACTGCCCAGGAGCCAGACACATTTATGGAACAGAAAATAACATATCGGATTTGGAGAGACACTGCCAACTGGCTGGAGATTAATCCGGACACTGGTGCCATTTCCACTCGGGCTGAGCTGGACAGGGAGGATTTTGAGCACGTGAAGAACAGCACGTACACAGCCCTAATCATAGCTACAGACAATGGTTCTCCAGTTGCTACTGGAACAGGGACACTTCTGCTGATCCTGTCTGATGTGAATGACAACGCCCCCATACCAGAACCTCGAACTATATTCTTCTGTGAGAGGAATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACATCATTGATGCAGACCTTCCTCCCAATACATCTCCCTTCACAGCAGAACTAACACACGGGGCGAGTGCCAACTGGACCATTCAGTACAACGACCCAACCCAAGAATCTATCATTTTGAAGCCAAAGATGGCCTTAGAGGTGGGTGACTACAAAATCAATCTCAAGCTCATGGATAACCAGAATAAAGACCAAGTGACCACCTTAGAGGTCAGCGTGTGTGACTGTGAAGGGGCCGCCGGCGTCTGTAGGAAGGCACAGCCTGTCGAAGCAGGATTGCAAATTCCTGCCTGCGGCCGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTG