1.上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白在促进干细胞向血管内皮样细胞、肝样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用，其中所述应用为非治疗目的，或者

上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白在制备用于促进细胞向血管内皮样细胞、肝样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞分化的药物中的应用，

其中所述干细胞为间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞。

2.权利要求1的应用，其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的比例为3:1至1:3。

3.权利要求1或2所述的应用，其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的比例1:3，3:1或1:1。

4.权利要求1所述的应用，其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白固定在基质上。

5.权利要求4所述的应用，其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白固定在同一个基质上或不同的基质上。

6.权利要求1所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与VEGF-Fc融合蛋白组合使用。

7.权利要求6所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述VEGF-Fc融合蛋白固定在基质上。

8.权利要求7所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述VEGF-Fc融合蛋白固定在同一个基质上或不同的基质上。

9.权利要求4所述的应用，其中所述基质选自细胞培养板，细胞培养皿，水凝胶，多孔支架，薄膜，或者微球。

10.权利要求9所述的应用，其中所述水凝胶是透明质酸水凝胶。

11.权利要求10所述的应用，其中所述透明质酸水凝胶是丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

12.权利要求9所述的应用，其中所述薄膜是纳米纤维薄膜。

13.权利要求9所述的应用，其中所述微球是PLGA微球或聚苯乙烯球。

14.权利要求9或13所述的应用，其中所述微球的粒径大小为10-50微米。

15.权利要求9或13所述的应用，其中所述微球的粒径大小为15-30微米。

16.权利要求9或13所述的应用，其中所述微球的粒径大小为15-20微米。

17.权利要求9所述的应用，其中所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。

18.权利要求17所述的应用，其中当所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的多孔支架，薄膜或微球时，所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或VEGF-Fc融合蛋白通过接头连接于所述多孔支架、薄膜或微球上。

19.权利要求18所述的应用，其中所述接头为Fc-结合肽。

20.权利要求19所述的应用，其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV（SEQ ID NO:93），HYFKFD（SEQ ID NO:94），HFRRHL（SEQ ID NO:95)，FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA（staphylococcal蛋白A）。

21.制备肝样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞的方法，其特征在于，在存在上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的情况下培养干细胞，其中所述干细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞。

22.权利要求21所述的方法，在另外存在VEGF-Fc融合蛋白的情况下培养干细胞。

23.权利要求21所述的方法，其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白/VEGF-Fc融合蛋白固定在基质上。

24.权利要求21所述的方法，其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白/VEGF-Fc融合蛋白固定在同一个基质上或不同的基质上。

25.权利要求21所述的方法，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白/VEGF-Fc融合蛋白中，所述VEGF-Fc融合蛋白与所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白固定在同一个基质上或不同的基质上。

26.权利要求23所述的方法，其中所述基质选自细胞培养板，细胞培养皿，水凝胶，多孔支架，薄膜，或者微球。

27.权利要求26所述的方法，其中所述水凝胶是透明质酸水凝胶。

28.权利要求27所述的方法，其中所述透明质酸水凝胶是丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

29.权利要求26所述的方法，其中所述薄膜是纳米纤维薄膜。

30.权利要求26所述的方法，其中所述微球是PLGA微球或聚苯乙烯球。

31.权利要求26所述的方法，其中所述微球的粒径大小为10-50微米。

32.权利要求26所述的方法，其中所述微球的粒径大小为15-30微米。

33.权利要求26所述的方法，其中所述微球的粒径大小为15-20微米。

34.权利要求26所述的方法，其中所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。

35.权利要求34所述的方法，其中当所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的多孔支架、薄膜或微球时，所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或VEGF-Fc融合蛋白通过接头连接于所述多孔支架、薄膜或微球。

36.权利要求35所述的方法，其中所述接头是Fc结合肽。

37.权利要求36所述的方法，其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV（SEQ ID NO:93），HYFKFD（SEQ ID NO:94），HFRRHL（SEQ ID NO:95)，FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA（staphylococcal蛋白A）。

38.权利要求1所述的应用或权利要求21-37任一项所述的方法，其中所述干细胞来源于哺乳动物。

39.权利要求1所述的应用或权利要求21-37任一项所述的方法，其中所述干细胞来源于人、鼠、猪。

40.权利要求1-4任一项所述的应用或权利要求21或23任一项所述的方法，其中上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素。

41.权利要求1-4任一项所述的应用或权利要求21或23任一项所述的方法，其中上皮细胞钙粘素为SEQ ID NO:9所示的序列的人上皮细胞钙粘素。

42.权利要求1-7任一项所述的应用或权利要求22-23任一项所述的方法，其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素。

43.权利要求1-7任一项所述的应用或权利要求22-23任一项所述的方法，其中血管内皮细胞钙粘素为SEQ ID NO:5所示的序列的人血管内皮细胞钙粘素。

44.权利要求6或7任一项所述的应用，或权利要求22所述方法，其中血管内皮细胞生长因子为人VEGF165。

45.权利要求6或7任一项所述的应用，或权利要求22所述方法，其中血管内皮细胞生长因子为SEQ ID NO:81的人VEGF165。

46.权利要求1-7任一项所述的应用或权利要求21-37任一项所述的方法，其中Fc为人IgG的Fc。

47.权利要求1-7任一项所述的应用或权利要求21-37任一项所述的方法，其中Fc为人IgG1的Fc。

48.权利要求1-7任一项所述的应用或权利要求21-37任一项所述的方法，其中Fc为SEQID NO:4所示的序列。

49.改性基质用于促进干细胞向血管内皮样细胞、肝样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用，所述干细胞为间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，所述改性基质包含上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白。

50.权利要求49所述的应用，其中所述上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素，所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素。

51.权利要求49所述的应用，其中所述上皮细胞钙粘素为SEQ ID NO:5所示的序列，所述血管内皮细胞钙粘素为SEQ ID NO:9所示的序列。

52.权利要求49所述的应用，其中所述干细胞来源于哺乳动物。

53.权利要求52所述的应用，其中所述哺乳动物为人、鼠、猪。

54.权利要求49所述的应用，当改性基质包含血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白时，还进一步包含VEGF-Fc融合蛋白。

55.权利要求54所述的应用，其中所述VEGF为人VEGF165。

56.权利要求54所述的应用，其中VEGF的序列为SEQ ID NO:81所示的序列。

57.权利要求49所述的应用，其中所述基质选自细胞培养板，细胞培养皿，水凝胶，多孔支架，薄膜，或者微球。

58.权利要求57所述的应用，其中所述水凝胶是透明质酸水凝胶。

59.权利要求58所述的应用，其中所述透明质酸水凝胶是丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

60.权利要求57所述的应用，其中所述薄膜是纳米纤维薄膜。

61.权利要求57所述的应用，其中所述微球是PLGA微球或聚苯乙烯球。

62.权利要求57或61所述的应用，其中所述微球的粒径大小为10-50微米。

63.权利要求57或61所述的应用，其中所述微球的粒径大小为15-30微米。

64.权利要求59或61所述的应用，其中所述微球的粒径大小为15-20微米。

65.权利要求57所述的应用，其中所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。

66.权利要求65所述的应用，其中当所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的多孔支架、薄膜或微球时，所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头连接于所述多孔支架、薄膜或微球。

67.权利要求66所述的应用，其中所述接头是Fc-结合肽。

68.权利要求67所述的应用，其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV（SEQ ID NO:93），HYFKFD（SEQ ID NO:94），HFRRHL（SEQ ID NO:95)，FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA（staphylococcal蛋白A）。

69.制备改性基质的方法，包含通过将上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与基质混合来改性所述基质。

70.权利要求69所述的方法，其中所述基质是用于促进间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞向血管内皮样细胞、肝样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞分化的基质。

71.权利要求69所述的方法，其中所述间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞来源于哺乳动物。

72.权利要求71所述的方法，其中所述哺乳动物为人、鼠、猪。

73.权利要求69或70所述的方法，其中当使用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白改性基质时，还进一步混合使用VEGF-Fc融合蛋白。

74.权利要求73所述的方法，其中所述VEGF为人VEGF165。

75.权利要求73所述的方法，其中所述VEGF的序列为SEQ ID NO:81所示的序列。

76.权利要求69-75任一项所述的方法，其中所述基质选自细胞培养板，细胞培养皿，水凝胶，多孔支架，薄膜，或者微球。

77.权利要求76所述的方法，其中所述水凝胶是透明质酸水凝胶。

78.权利要求77所述的方法，其中所述透明质酸水凝胶是丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

79.权利要求76所述的方法，其中所述薄膜是纳米纤维薄膜。

80.权利要求76所述的方法，其中所述微球是PLGA微球或聚苯乙烯球。

81.权利要求76所述的方法，其中所述微球的粒径大小为10-50微米。

82.权利要求76所述的方法，其中所述微球的粒径大小为15-30微米。

83.权利要求76所述的方法，其中所述微球的粒径大小为15-20微米。

84.权利要求76所述的方法，其中所述多孔支架，薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。

85.权利要求84所述的方法，其中当所述多孔支架，薄膜或微球为亲水性的多孔支架，薄膜或微球时，所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头连接于所述多孔支架、薄膜或微球。

86.权利要求85所述的方法，其中所述接头是Fc-结合肽。

87.权利要求85所述的方法，其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV（SEQ ID NO:93），HYFKFD（SEQ ID NO:94），HFRRHL（SEQ ID NO:95)，FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA（staphylococcal蛋白A）。

技术领域

[0001]本发明涉及细胞分化领域。更具体地，涉及上皮细胞钙粘素(E-钙粘素)-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素(VE-钙粘素)-Fc融合蛋白和/或内皮细胞生长因子(VEGF)-Fc融合蛋白的新用途，其促进干细胞向肝样细胞、内皮样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞分化。

背景技术

[0002]哺乳动物的器官发生是一个高度动态变化的过程，其受多种信号分子共同构建的微环境影响。近年来，基于干细胞三维培养的类器官(organoid)技术有望在体外模拟器官发生发育的全过程，逐渐成为了干细胞技术和再生医学的新一代研究热点。具有复杂三维结构和功能的肝脏是人体中最重要的内分泌和外分泌器官之一，其在体内的发育过程受到多种因素的共同调控。肝实质细胞(肝细胞)和肝非实质细胞(如胆管上皮细胞、Kupffer细胞、NK细胞)是构成肝组织结构和功能的基本单位，在这些细胞中，肝细胞和胆管上皮细胞是在肝脏内部承担主要的功能，它们是在不同的细胞因子调控下由肝母细胞分化而成。现已有文献报道，肝脏发育过程中，早期内皮细胞及其分泌的因子TGF β不仅会在肝脏发育后期控制肝母细胞分化命运(向肝细胞和胆管上皮细胞分化)，其还会在肝脏发育早期促进肝内胚层细胞迁移进入横隔间充质并促进肝芽的形成。因而在体外诱导肝类器官(liverorganoid)的形成过程中，如何精确调控干细胞经时向血管内皮细胞和肝细胞/胆管上皮细胞分化并自组装形成具有一定结构和功能的肝细胞聚集体是该技术的主要技术瓶颈。

[0003]细胞分选(cell sorting out)是肝类器官形成的第一步，该过程和细胞表面粘附因子(cell adhesion molecular)有关。钙粘素(cadherin，在本文中缩写为“Cad”)是一种细胞特异性粘附因子，通过同类细胞表面相同亚型钙粘素的同源结合形成细胞间粘附连接(Adhesion Junction)，从而影响细胞分化。另外，钙粘素在胚胎发育中的细胞识别、迁移、组织分化以及成体组织器官构成中起到主要作用。上皮细胞钙粘素(E-cadherin)是哺乳动物发育过程中第一个表达的钙粘素，其对胚胎干细胞分裂球的紧密结合及上皮细胞分化有着重要的影响，而血管内皮细胞钙粘素(VE-cadherin)对干细胞/内皮祖细胞向内皮细胞分化及其功能实现具有重要作用。

[0004]已有多种基于Fc段的钙粘素融合蛋白应用于组织工程及再生医学的研究当中，例如E-Cadherin-Fc、N-Cadherin-Fc等作为细胞外基质的改性成分之一用于研究对细胞行为调控的影响。研究表明血管内皮细胞钙粘素蛋白(VE-Cadherin)作为内皮细胞之间粘附连接的重要组成成分，在血管的新生过程中起着十分重要的作用。

[0005]南开大学的杜凤仪、许可博士生物合成了由人内皮细胞钙粘素蛋白的胞外域与免疫球蛋白IgG的Fc结构域组成的融合蛋白(hVE-cad-Fc)，考察并优化了其在聚苯乙烯培养板表面的固定及其调控血管内皮细胞粘附、增殖、迁移及分化功能表达的生物活性(杜凤仪、许可，博士学位论文，2011、2016年，南开大学)。

[0006]但目前为止，现有技术中并没有任何关于人内皮细胞钙粘素蛋白-Fc融合蛋白促进干细胞向肝细胞分化的报道。

发明内容

[0007]本发明在于发现了将上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白(例如，人上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白，缩写为hE-cad-Fc)、血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白(例如，人血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白，缩写为hVE-cad-Fc)和内皮细胞生长因子融合蛋白(例如人VEGF165-Fc融合蛋白，缩写为hVEGF-Fc)固定在基质上，在二维水平将干细胞培养在固定于基质表面的融合蛋白上或者在三维水平将表面固定有融合蛋白的基质引入到干细胞聚集体内部，通过细胞表面钙粘素与基质表面同种类型钙粘素-Fc的结合调控基质表面干细胞的粘附、迁移和分选，进一步调控干细胞的分泌功能并协同外源细胞分化因子，仿生构建细胞外微环境，调控干细胞的分化。通过将E-cad-Fc、VE-cad-Fc和VEGF-Fc固定在同一个基质上或固定在不同的基质上，提高了干细胞向肝样细胞、内皮样细胞、胰岛样细胞、胆管上皮样细胞的分化效率。

[0008]在整个诱导分化过程中，融合蛋白主要起到以下作用：

[0009]1.利用基质材料表面固定不同亚型钙粘素融合蛋白介导干细胞组装多细胞聚集体，实现钙粘素亚型依赖性细胞粘附并促进干细胞构建组织特异性细胞外微环境；

[0010]2.再协同相应外源细胞因子定向诱导干细胞向内皮及上皮分化。VE-cad-Fc与内外源VEGF协同作用，促进干细胞向内皮样细胞快速分化，同时，通过其分泌的细胞外基质、细胞因子及内皮壁龛的形成，进一步协同E-cad-Fc调控干细胞向上皮样细胞的分化。在E-cad-Fc、外源添加细胞因子和内皮壁龛及其内源性TGFβ的作用下，调控干细胞分别向肝样细胞或者胆管上皮样细胞分化。该过程主要通过融合蛋白种类及浓度等的调控，更好地在体外仿生模拟了肝脏发育过程；

[0011]3.在分化过程中，E-cad-Fc持续性激活干细胞的EGF受体磷酸化，进而替代外源EGF的使用；VE-cad-Fc不仅持续性上调干细胞VEGF的表达，同时能有效激活干细胞的VEGF受体磷酸化，进而减少干细胞向内皮细胞定向分化对外援添加VEGF的依赖性；

[0012]4.E-cad-Fc上调干细胞表达HNF4α，促进干细胞发生MET转化，有利于干细胞向肝样细胞分化；

[0013]5.E-cad-Fc不仅下调干细胞表达β-连环蛋白并使其更多的定位于胞浆中，从而有利于干细胞向肝样细胞的分化；

[0014]6.E-cad-Fc和VE-cad-Fc通过调控YAP蛋白的表达及其胞内分布，促进干细胞向内皮及上皮定向分化；

[0015]7.E-cad-Fc和VE-cad-Fc改善干细胞聚集体结构与功能的稳定性，模拟体内细胞微环境，促进干细胞体外定向分化；

[0016]8.E-cad-Fc和VE-cad-Fc介导干细胞聚集组装多细胞聚集体，可有效调控干细胞定向分化并提高分化效率，为肝、胆、胰类器官的构建及其在再生医学、药物研发等领域的应用提供了新的思路和技术。

[0017]具体地，本发明涉及E-cad-Fc、VE-cad-Fc和VFGF-Fc在肝样细胞、内皮样细胞、胆管上皮样细胞、胰岛样细胞分化中的应用。

[0018]在本发明的一个方面，涉及E-cad-Fc在激活细胞中存在的EGFR中的应用。

[0019]在本发明的一个方面，涉及E-cad-Fc在促进干细胞向肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。

[0020]在本发明的一个实施方案中，所述E-cad-Fc用于替代EGF。

[0021]在本发明的一个实施方案中，所述E-cad-Fc固定在基质上。

[0022]在本发明的一个方面，涉及VE-cad-Fc在促进干细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。

[0023]在本发明的一个实施方案中，所述VE-cad-Fc固定在基质上。

[0024]在本发明的一个实施方案中，所述VE-cad-Fc与VEGF-Fc组合使用。

[0025]在本发明的一个实施方案中，所述VE-cad-Fc和所述VEGF-Fc固定在基质上，优选固定在同一个基质上或不同的基质上。

[0026]在本发明的一个方面，涉及E-cad-Fc和VE-cad-Fc在促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。

[0027]在本发明的一个实施方案中，所述E-cad-Fc与所述VE-cad-Fc的比例为3∶1至1∶3，优选1∶3，3∶1或1∶1。

[0028]在本发明的一个实施方案中，所述VE-cad-Fc与VEGF-Fc融合蛋白组合使用。

[0029]在本发明的一个实施方案中，所述VE-cad-Fc和所述VEGF-Fc融合蛋白固定在基质上，优选固定在同一个基质上或不同的基质上。

[0030]在本发明的一个方面，涉及制备肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞的方法，其特征在于，在存在E-cad-Fc和/或VE-cad-Fc的情况下培养干细胞。

[0031]在本发明的一个方面，涉及制备内皮样细胞的方法，其特征在于，在存在VE-cad-Fc的情况下培养干细胞。

[0032]在本发明的一个实施方案中，在另外存在VEGF-Fc融合蛋白的情况下培养干细胞。

[0033]在本发明的一个实施方案中，所述E-cad-Fc和所述VE-cad-Fc固定在基质上，优选固定在同一个基质上或不同的基质上。

[0034]在本发明的一个实施方案中，所述干细胞为间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞。

[0035]在本发明的一个实施方案中，所述干细胞来源于哺乳动物，优选人、鼠、猪。

[0036]在本发明的一个实施方案中，所述上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素，优选为SEQ ID NO：9所示的序列。

[0037]在本发明的一个实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素，优选序列为SEQ ID NO：5所示的序列。

[0038]在本发明的一个实施方案中，所述Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc，优选为SEQ ID NO：4所示的序列。

[0039]在本发明的一个实施方案中，所述血管内皮细胞生长因子为人VEGF165，优选VEGF的序列为SEQ ID NO：81。

[0040]在本发明的一个方面，涉及用于培养细胞的改性基质，其包含上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白，其中优选地，所述上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素，优选为SEQ ID NO：9所示的序列，所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素，优选序列为SEQ ID NO：5所示的序列。

[0041]在本发明的实施方案中，所述基质用于促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化，优选地，所述干细胞为间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，更优选地，所述干细胞来源于哺乳动物，优选人、鼠、猪。

[0042]在本发明的实施方案中，当改性基质包含血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白时，还进一步包含VEGF-Fc融合蛋白，优选地，所述VEGF为人VEGF165，更优选VEGF的序列为SEQ IDNO：81。

[0043]在本发明的另一个方面，涉及所述的改性基质在促进细胞(优选干细胞，更优选间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞)分化(优选促进向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化)中的应用。本发明的另一个方面，涉及制备改性基质的方法，包含通过将上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与基质混合来改性所述基质。

[0044]在本发明的实施方案中，所述基质是用于促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化的基质，优选地，所述干细胞为间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，更优选地，所述干细胞来源于哺乳动物，优选人、鼠、猪。

[0045]本本发明的实施方案中，其中当使用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白改性基质时，还进一步使用VEGF-Fc融合蛋白改性基质，优选地，所述VEGF为人VEGF165，更优选VEGF的序列为SEQ ID NO：81。

[0046]在本发明上述各个方面的实施方案中，所述基质选自细胞培养板、细胞培养皿、水凝胶，多孔支架(优选PLGA支架或PGL支架)或者微球，优选所述微球粒径大小为10-50微米(优选15-30，15-20微米)，优选疏水性微球或亲水性微球，更优选所述微球是PLGA微球，更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30，15-20微米)的PLGA微球；或者所述微球为聚苯乙烯球，更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30，15-20微米)的聚苯乙烯微球。

[0047]在本发明上述各个方面的的实施方案中，所述多孔支架，薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。在一个实施方案中，当所述多孔支架，薄膜或微球为亲水性的多孔支架，薄膜或微球时，所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头(优选Fc-结合肽)连接于所述多孔支架、，薄膜或微球。优选地，所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQ ID NO：93)，HYFKFD(SEQ ID NO：94，参见参考资料3和4)，HFRRHL(SEQ ID NO：95，参见参考资料3和4)，FYWHCLDE(SEQ ID NO：96，参见参考资料1和2)或SpA(staphylococcal蛋白A，参见参考资料1和2)。

[0048]在本发明的上述各个方面的实施方案中，所述水凝胶优选是透明质酸水凝胶，更优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

[0049]在本发明的实施方案中，所述丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶是通过己二酸二酰肼和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对透明质酸修饰而制备。

[0050]在本发明的实施方案中，其中所述PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶是通过PAMAM树枝状大分子与巯基化透明质酸发生迈克尔加成反应而制备。

[0051]参考资料

[0052]1.Biomimetic design of affinity peptide ligands for human IgG basedon protein A-IgG complex，Biochemical Engineering Journal，88(2014(1-11)

[0053]2.FYWHCLDE-based affinity chromatography of IgG：Effect of liganddensity and purifications of human IgG and monoclonal antibody，Journal ofChromatography A，1355(2014)107-114.

[0054]3.Performance of hexamer peptide ligands for affinity purification ofimmunoglobulin G from commercial cell culture media，Journal of ChromatographyA，1218(2011)1691-1700

[0055]4.Purification of human immunoglobulin G via Fc-specific smallpeptide ligand affinity chromatography，Journal of Chromatography A 1216(2009)910-918

附图说明

[0056]图1：hVE-cad-Fc构建的示意图及鉴定。其中图1A表示pcDNA3.1-hVE-cad-Fc的结构示意图；图1B表示纯化的hVE-cad-Fc的SDS-PAGE和Western blot分析，其中M：蛋白标准；P：人IgG(阳性对照，Sigma目录编号No.M15154)；R：还原态下纯化的hVE-cad-Fc融合蛋白；N：非还原态下纯化的hVE-cad-Fc融合蛋白。

[0057]图2：hE-cad-Fc构建的示意图及鉴定。其中图2A表示hE-cad-Fc融合蛋白表达载体的酶切鉴定，M：蛋白标准；1：酶切hE-cad-Fc融合蛋白基因片段；2：酶切hE-cad胞外域基因片段；3：酶切Fc基因片段；4：未酶切的质粒载体；图2B表示hE-cad-Fc融合蛋白的Westernblotting鉴定，M：marker；1：还原态人E-钙粘素融合蛋白；2：非还原态人E-钙粘素融合蛋白。

[0058]图3：胶原溶液、hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液分别处理基质及TCPS基质表面培养细胞24小时相关因子基因表达。

[0059]图4：胶原溶液、hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液分别处理基质及TCPS基质表面培养细胞48小时相关因子基因表达。

[0060]图5：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hVE-cad-Fc溶液分别处理基质不同时间培养细胞总EGF受体和EGF受体磷酸化蛋白表达。

[0061]图6：hE-cad-Fc溶液处理基质在不同浓度EGF的作用下培养细胞总EGF受体、EGF受体磷酸化、Oct4、CK18、CK19及β-肌动蛋白表达。

[0062]图7：hVE-cad-Fc溶液与不同浓度hVEGF-Fc溶液共同处理基质培养细胞总VEGFR2受体、VEGFR2受体磷酸化、Oct4、CD31、VE-钙粘素及β-肌动蛋白表达。

[0063]图8：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞的形态。

[0064]图9：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞Oct4、FoxA2及Sox17基因表达。

[0065]图10：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞CK18、AFP及ALB基因表达。

[0066]图11：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞OATP及MRP2基因表达。

[0067]图12：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞G6Pase及α1-AT基因表达。

[0068]图13：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞CD31、VE-钙粘素及VEGFR2基因表达。

[0069]图14：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞ALB分泌及Urea合成。

[0070]图15：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化4周时细胞表达ALB免疫荧光染色。

[0071]图16：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞相关蛋白表达。

[0072]图17：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞分泌相关因子基因表达。

[0073]图18：胶原溶液、hE-cad-Fc、hVE-cad-Fc混合溶液分别处理基质及TCPS基质表面培养细胞48小时细胞表达YAP蛋白免疫荧光染色结果。

[0074]图19：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞MET转化相关基因表达。

[0075]图20：hE-cad-Fc溶液、hVE-cad-Fc溶液和hVEGF-Fc混合溶液的固定量、稳定性及在微球表面分布。

[0076]图21：不同比例细胞与微球制备的细胞聚集体形态。

[0077]图22：不同比例细胞与微球制备的细胞聚集体定向诱导分化1周时相关基因表达。

[0078]图23：胶原溶液、不同比例hE-cad-Fc与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球与细胞的聚集体分化1周时相关基因表达。

[0079]图24：胶原溶液、不同比例hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球与干细胞的聚集体分化1周时相关基因表达。

[0080]图25：不含有微球的细胞聚集体、含胶原溶液修饰微球的细胞聚集体、含hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的细胞聚集体及含hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液修饰微球的干细胞聚集体诱导分化4周期间相关基因表达。

[0081]图26：不含有微球的细胞聚集体、含胶原溶液修饰微球的细胞聚集体、含hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的细胞聚集体及含hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液修饰微球的干细胞聚集体诱导分化2周时细胞ALB和CD31的免疫荧光染色。

[0082]图27：含人脐静脉内皮细胞与hMSC的细胞聚集体、含hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的干细胞聚集体及含hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液修饰微球的干细胞聚集体诱导分化4周期间相关基因表达情况及ALB分泌。

[0083]图28：胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞Oct4、PDX-1、INS、MAFA、CPA1及β-肌动蛋白基因表达。

[0084]图29：不含微球的细胞聚集体、含PLGA微球的细胞聚集体和含hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的细胞聚集体分别诱导分化1周时相关基因及蛋白表达。其中图29A表示分化1周时内皮细胞相关标志物基因及蛋白的表达；图29B表示分化1周内相关因子及基质基因的表达。

[0085]图30：PAMAM树枝状大分子合成路线图及hVE-cad-Fc融合蛋白对水凝胶的功能化改性，其中图30A为PAMAM树枝状大分子合成路线图；图30B为三种不同PAMAM树枝状大分子的核磁共振氢谱图；图30C为hVE-cad-Fc融合蛋白在含有/不含有Fc-bp的水凝胶中的14天时间内固定量的百分比；图30D为HUVEC与hMSC在不同方式改性水凝胶上的黏附及增殖。

[0086]图31：水凝胶理化性质表征，其中图31A为hVE-cad-Fc改性前后水凝胶分别在培养基、透明质酸酶、hMSC和HUVEC上清液中不同时间点剩余量百分比；图31B为hVE-cad-Fc改性前后水凝胶在PBS中的溶胀性检测；图31C为hVE-cad-Fc改性前后水凝胶流变仪性质检测；图31D为hVE-cad-Fc改性前后水凝胶形貌特征检测。

[0087]图32：hVE-cad-Fc功能化改性水凝胶对HUVEC生存影响研究，其中图32A为HUVEC在不同改性水凝胶上二维培养3天的光镜观察图；图32B为HUVEC在不同改性水凝胶上二维培养3天的死活染色图；图32C为HUVEC在不同改性水凝胶上二维培养4、24、48和72小时的CCK-8检测的黏附增殖；图32D为HUVEC在不同改性水凝胶之上二维培养3天的骨架染色；图32E为HUVEC在不同改性水凝胶三维培养1、3、5和7天黏附增殖；图32F为HUVEC在不同改性水凝胶中三维培养7天死活染色。

[0088]图33：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC血管功能化的影响，其中图33A，33B分别为HUVEC在不同改性水凝胶上培养24、48、72小时后蛋白质印迹实验检测vWF与eNOS蛋白的表达；图33C为HUVEC在不同改性水凝胶上培养4、24、48、72小时后一氧化氮释放量；图33D为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后激光共聚焦显微镜对低密度脂蛋白的吞噬检测。

[0089]图34：丙烯酰肼化透明质酸的核磁共振氢谱检测，其中图34A为HA的核磁共振氢谱；图34B为HA-ADH的核磁共振氢谱；图34C为HA-AC的核磁共振氢谱。

[0090]图35：融合蛋白hVE-cad-Fc在水凝胶中固定的1周时间内的酶联免疫吸附测定实验。

[0091]图36：水凝胶成胶性、稳定性及降解性理化性质表征，其中图36A是不同交联剂下的成胶图；图36B是不同交联密度水凝胶在PBS溶液中的稳定性分析及低交联度水凝胶流变性分析；图36C是hVE-cad-Fc功能化改性水凝胶(DTT交联和MMP交联)前后溶胀性分析研究。

具体实施方式

[0092]下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。

[0093]实施例1：构建和表达人hVE-cad-Fc融合蛋白

[0094]参见杜凤仪，博士论文，南开大学，2011年11月。主要如下：

[0095]1.1血管内皮细胞钙粘素胞外区基因VE-cad的克隆和序列分析

[0096]根据UniProt数据库收录人VE钙粘素蛋白序列和功能分区，结合GenBank收录的基因(NCBI Reference Sequence：NM_001795.3)序列设计特异性PCR引物，扩增hVE钙粘素蛋白胞外区(EC1-EC5)。上游引物(P1)；5′-CCGGATATCATGCAGAGGCTCATGATGCTCC-3′(SEQ IDNO：1)，引入EcoR V酶切位点(下划线)，下游引物：(P2)5′-AAGCGGCCGCTCTGGGCGGCCATATC-3′(SEQ ID NO：2)，引入Not I酶切位点(下划线)。引物合成及测序均由Invitrogen有限公司完成。

[0097]人脐静脉内皮细胞(HUVEC，ScienCell公司，美国)总mRNA提取：按照《分子克隆实验指南》(第三版)的常规方法提取mRNA。测O.D值定量RNA纯度和浓度。反转录按照购买的BD公司试剂盒MicroRNAAssays中操作，反转录体系如下：

[0098]

[0099]反转录程序如下：

[0100]

[0101]以HUVEC mRNA反转录形成的cDNA为模板，扩增出VE-cad基因片段，PCR反应体系如下：

[0102]

[0103]

[0104]扩增条件如下：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。向反应液中补加380μL ddH2O，再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH 5.0)，2倍体积的无水乙醇，-20℃中放置1h；4℃，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，真空干燥，将沉淀溶于适量TE中。

[0105]1.2pcDNA3.1-hVE-cad-Fc真核表达载体的构建

[0106](1)EcoRV、Not I双酶切纯化后的PCR产物

[0107]酶切体系如下：

[0108]

[0109]37℃过夜反应，65℃灭活酶15min，向反应液中补加350μL ddH2O，再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH5.0)，2倍体积的无水乙醇，-20℃中放置1h。4℃，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，真空干燥，将沉淀溶于10μLTE中。

[0110](2)pcDNA/3.1的EcoRV和Not I酶切；

[0111]pcDNA/3.1(Thermo Fisher Scientific，美国，货号V79020)的双酶切体系(3×50μL)如下：

[0112]

[0113]37℃过夜反应。将酶切产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外灯下切下目的片段，使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TaKaRa，日本，货号9762)进行回收，回收片段溶于25μLddH2O中。

[0114](3)载体与目的片段的连接反应及转化反应

[0115]反应体系如下：

[0116]

[0117]16反应16h。然后CaCl2转化感受态细胞BL21(DE3)37℃过夜培养16～18h。挑取转化子，小量提取质粒检测。

[0118]将回收的目的基因hVE-钙粘素胞外区和带有Fc片段载体pcDNA3.1，在37℃恒温下分别进行双酶切(EcoR V和Not I)。电泳胶回收后，将回收产物混合，在T4DNA连接酶的催化下，于16℃过夜连接。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后，用氨苄青霉素(Amp+)进行抗性筛选。提取质粒后双酶切鉴定，初步鉴定为正确的重组质粒进行DNA序列分析。将构建的重组质粒命名为pcDNA3.1/hVE-cad-Fc(见图1A)。经测序验证序列正确。hVE-cad-Fc融合蛋白序列为SEQ ID NO：3所示，其中Fc的序列如SEQ ID NO：4所示，

[0119]hVE-cad的序列如SEQ ID NO：5所示。

[0120]1.3细胞转染与蛋白纯化

[0121]将pcDNA3.1/hVE-cad-Fc转染293F细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。

[0122]利用免疫球蛋白Fc段与rProtein A的特异性结合，通过GE Healthcare公司的Hitrap rProtein A FF柱子进行目的蛋白纯化。

[0123]1.4Western blotting分析

[0124]纯化的hVE-cad-Fc融合蛋白质以10％SDS-PAGE胶电泳后转移至PVDF膜，5％脱脂奶封闭2小时，一抗兔抗人VE-钙粘素胞外域的单克隆抗体(RD，美国，1∶400稀释)孵育4℃过夜，HRP标记的羊抗兔二抗(abcam，美国，1∶10000稀释)室温孵育1h，TBST洗膜，DAB试剂曝光显影定影分析。检测Fc形成二聚体时上样缓冲液中不加β巯基乙醇。结果参见图1B。

[0125]从图1B可以看出在非还原态情况下可以在～240KD处看到一条条带和在还原态情况下在～120KD可以看到一条条带，这些结果暗示了hVE-cad-Fc融合蛋白以二聚体的形式。

[0126]实施例2：构建和表达人hE-cad-Fc融合蛋白

[0127]参见徐建斌，博士论文，南开大学，2013年12月。主要如下。

[0128]2.1上皮细胞钙粘素胞外区基因E-cad的克隆和序列分析

[0129]根据UniProt数据库收录人E钙粘素蛋白序列和功能分区，结合GenBank收录的基因(NCBI Reference Sequence：NM 004360.3)序列设计特异性PCR引物，扩增E钙粘素蛋白胞外区。上游引物(P1)：5’-CGCAAGCTTATGGGCCCTTG-GAGCCGCAGC-3’，SEQ ID NO：6；下游引物：(P2)5’-TTGCGGCCGCAGGCAGGAATTTGCAATCCTGC-3’，SEQ ID NO：7。引物合成及测序均由Invitrogen有限公司完成。

[0130]L-02(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞总mRNA提取：按照《分子克隆实验指南》(第三版)的常规方法提取mRNA。测O.D值定量RNA纯度和浓度。反转录按照购买的BD公司试剂盒MicroRNA Assays中操作。反转录体系如下

[0131]

[0132]反转录程序如下：

[0133]

[0134]以L-02mRNA反转录形成cDNA为模板，扩增出E-cad基因片段，PCR反应体系如下：

[0135]

[0136]扩增条件如下：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。向反应液中补加380μL ddH2O，再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH 5.0)，2倍体积的无水乙醇，-20℃中放置1h；4℃，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，真空干燥，将沉淀溶于适量TE中。

[0137]2.2pcDNA3.1-hE-cad-Fc真核表达载体的构建

[0138](1)Hind III、Not I双酶切纯化后的PCR产物

[0139]酶切体系如下：

[0140]

[0141]37℃过夜反应，65℃灭活酶15min，向反应液中补加350μL ddH2O，再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH5.0)，2倍体积的无水乙醇，-20℃中放置1h。4℃，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，真空干燥，将沉淀溶于10μLTE中。

[0142](2)pcDNA/3.1的Hind III和Not I酶切；

[0143]

[0144]37℃过夜反应。将酶切产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外灯下切下目的片段，使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TaKaRa)进行回收，回收片段溶于25μL ddH2O中。

[0145](3)载体与目的片段的连接反应及转化反应

[0146]反应体系如下：

[0147]

[0148]16℃反应16h。然后CaCl2转化感受态细胞BL21(DE3)37℃过夜培养16～18h。挑取转化子，小量提取质粒检测。

[0149]将回收的目的基因E-钙粘素胞外区和带有Fc片段载体pcDNA3.1，在37℃恒温下分别进行双酶切(Hind III和Not I)。电泳胶回收后，将回收产物混合，在T4DNA连接酶的催化下，于16℃过夜连接。将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞后，用氨苄青霉素(Amp+)进行抗性筛选。提取质粒后双酶切鉴定，初步鉴定为正确的重组质粒进行DNA序列分析(图2A所示)。将构建的重组质粒命名为pcDNA3.1/hE-cad-Fc。经测序验证序列正确。hE-cad-Fc融合蛋白序列为SEQ ID NO：8所示，其中hE-cad的序列如SEQ ID NO：9所示，Fc的序列如SEQ IDNO：4所示。

[0150]2.3细胞转染与蛋白纯化

[0151]将pcDNA3.1/hE-cad-Fc转染293F细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。

[0152]利用免疫球蛋白Fc段与rProtein A的特异性结合，通过GE Healthcare公司的Hitrap rProtein A FF柱子进行目的蛋白纯化。

[0153]2.4Western blotting分析

[0154]纯化的hE-cad-Fc融合蛋白质以10％SDS-PAGE胶电泳后转移至PVDF膜，5％脱脂奶封闭2h，一抗兔抗人E-钙粘素胞外域的单克隆抗体(RD，美国，1∶400稀释)孵育4℃过夜，HRP标记的羊抗兔二抗(abcam，美国，1∶10 000稀释)室温孵育1h，TBST洗膜，DAB试剂曝光显影定影分析。检测Fc形成二聚体时上样缓冲液中不加β巯基乙醇。结果参见图2B。

[0155]从图2B可以看出在非还原态情况下可以在～240KD处看到一条条带和在还原态情况下在～120KD处可以看到一条条带，这些结果暗示了hE-cad-Fc融合蛋白以二聚体的形式。

[0156]在以下实施例中，除非另外说明，所涉及的PCR反应如下：

[0157]利用TransGen Biotech提供的PCR试剂盒按照下表向无RNase/DNase的PCR管中加入如下各组分：

[0158]

[0159]PCR仪的程序设定：95℃5min 1个循环，95℃5min退火温度1min 72℃45s35个循环，72℃10min 1个循环，4℃保温，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的表达情况

[0160]实施例3.hMSC在不同修饰的基质表面细胞因子及细胞外基质分泌的检测

[0161]用0.01M PBS(pH＝7.2)将I型胶原(collagen，BD，美国，货号354249)、hE-cad-Fc、hVE-cad-Fc及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液(两种融合蛋白比例为1∶1)分别稀释至终浓度为10μg/mL，向6孔细胞培养板中分别加入1.5mL稀释后的胶原溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液，置于细胞培养箱中37℃孵育2h，取出后弃上清，并用0.01M PBS(pH＝7.2)清洗3遍。

[0162]随后按照细胞密度105细胞/孔将hMSC(赛业生物，中国)接种于TCPS培养板和上述溶液孵育后的培养板中，用含有10％胎牛血清(FBS，BI，美国)的DMEM/Ham′s F12 1∶1(DF12，BI，美国)培养基在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)进行培养。分别培养24h和48h后，弃培养基，用0.01M PBS(pH＝7.2)清洗细胞3次后，每孔加入1mL Trizol(Invitrogen，美国，货号15596026)，按照产品说明书提取RNA。利用Biodrop测定RNA样品浓度，取2μg RNA按照Roche反转录试剂盒(货号4655877001)说明书利用试剂盒中的随机引物进行反转录获得cDNA(PCR仪的程序设定：55℃30min 1个循环，85℃5min 1个循环，4℃保温)。利用Roche荧光定量PCR试剂盒(货号4914058001)进行基因表达量分析，所用的引物序列及退火温度见下表1(PCR仪的程序设定：95℃5min 1个循环，95℃5min退火温度1min 72℃45s 35个循环，72℃10min 1个循环，4℃保温)，将上述样品混匀后置于荧光定量PCR仪(Biorad)中进行检测，获得的数据以TCPS组为对照组，利用2-ΔΔCt法进行处理。其中培养24h的检测结果见图3；培养48h的检测结果见图4。

[0163]从PCR结果可以看出，hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc两种融合蛋白联合使用可以显著提高hMSC自分泌细胞外基质蛋白和细胞因子的能力，有利于hMSC在外源细胞因子的作用下发生定向诱导分化。

[0164]

[0165]实施例4.不同修饰的基质表面EGF受体激活时间的评价

[0166]按照实施例3的方法处理6孔细胞培养板，按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC分别接种于I型胶原、hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc修饰的培养板表面，用维持培养基在细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养4h。I型胶原修饰的基质表面的细胞用含有10ng/mL EGF(Peprotech，美国，货号AF-100-15)的维持培养基培养，hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc分别修饰的基质表面的细胞用维持培养基(不含EGF)培养，培养0min、10min、30min、60min、90min和120min时用100μL细胞强裂解液(碧云天)裂解细胞并如下提取蛋白，通过western blotting检测不同样品不同时间总EGF受体(total EGF receptor，CST，美国，1∶1000稀释)和EGF磷酸化受体(phospho-EGF receptor Tyr 1068，1068位进行磷酸化，CST，美国，1∶1000稀释)表达情况。结果见图5。

[0167]蛋白提取：

[0168]①按照每2×106细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，利用细胞刮进一步裂解细胞释放细胞中的总蛋白质，4℃13000rpm离心10min，取上清；

[0169]②按照BCA试剂盒(碧云天，货号P0010)测试上清中蛋白质的含量；

[0170]③按照1∶5的比例向上清中加入5×上样缓冲液(碧云天，货号P0015)，煮沸5min，按照每孔20μg蛋白的上样量分装煮沸后的蛋白质，置于-80℃冰箱保存及完成细胞总蛋白的提取。

[0171]从图5可以看出，在胶原蛋白修饰的基质上hMSC的EGF受体磷酸化受到培养基中添加的EGF刺激在60min之内保持激活状态，在60min之后EGF受体磷酸化开始失活；而在hE-cad-Fc修饰的基质表面的hMSC EGF受体磷酸化在2h内一直维持激活状态；hVE-cad-Fc修饰的基质表面的hMSC的EGF受体磷酸化不会被激活，这就说明hE-cad-Fc可以特异性地、持续性的激活EGF受体及其磷酸化。

[0172]实施例5.hE-cad-Fc修饰的基质表面不同浓度EGF对于hMSC定向分化的影响

[0173]按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC接种在如实施例3所述制备的hE-cad-Fc修饰的的6孔板表面，利用维持培养基培养过夜后向不同的孔中加入1.5mL含有不同浓度EGF(0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL和25ng/mL)的肝定向分化培养基(DF12+2％FBS+10ng/mL FGF4+20ng/mLHGF+1*ITS，其中FGF4来自于Peprotech，美国，货号为100-31；HGF来自于Peprotech，美国，货号为100-39H；ITS来自于Sigma，美国，货号为I3146)，每两天换液，培养7天后提取蛋白利用western blotting检测不同样品Oct4(abcam，美国，1∶1000稀释)、总EGF受体(CST，美国，1∶1000稀释)、磷酸化-EGF受体Tyr 1068(CST，美国，1∶1000稀释)、CK18(abcam，美国，1∶1000稀释)及CK19(abcam，美国，1∶1000稀释)的表达情况。结果见图6。

[0174]从图6中可以看出，在加入分化培养基1周后，不含有EGF的分化培养基的实验组向肝细胞定向诱导分化的效率最高，说明hE-cad-Fc基质在hMSC向肝细胞定向分化过程中可以替代EGF的相关功能，持续刺激EGF受体磷酸化，提高hMSC向肝细胞诱导分化的效率。

[0175]实施例6.hVE-cad-Fc修饰的基质表面固定不同浓度hVEGF-Fc对于hMSC定向分化的影响

[0176]制备配置含有不同终浓度hVEGF-Fc(SEQ ID NO：26，由金斯瑞公司合成)0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL，其中hVEGF的序列为SEQ ID NO：81)的hVE-cad-Fc溶液(终浓度为10μg/mL)，按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC接种培养板上，利用维持培养基培养过夜后更换成内皮细胞分化培养基(DF12+2％FBS+10ng/mL FGF2，FGF2来自于Peprotech，美国，货号100-18B)进行培养，每两天换液。培养7天后利用westernblotting检测不同样品Oct4(abcam，MA，美国，1∶1000稀释)、总VEGF受体(CST，美国，1∶1000稀释)、磷酸化-VEGF受体Tyr 1175(CST，美国，1∶1000稀释)、CD31(CST，美国，1∶1000稀释)及hVE-cadherin(abcam，美国，1∶1000稀释)的表达情况。结果见图7。从图7中可以看出，在加入分化培养基1周后，当hVEGF-Fc的固定量为2μg/mL时，hMSC向血管内皮样细胞分化的效率是最高的，说明一定浓度的hVE-cad-Fc基质和hVEGF-Fc融合蛋白在hMSC向血管内皮样细胞分化的过程中起到了协同调控分化的作用，其可持续刺激VEGF受体磷酸化，提高hMSC向血管内皮样细胞分化的效率。

[0177]用于不同修饰的基质表面分化培养基的最优组分为：

[0178](1)胶原：DF12+2％FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mL FGF-2+20ng/mLHGF+1*ITS+20ng/mL EGF+40ng/mL hVEGF

[0179](2)hE-cad-Fc：DF12+2％FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mL FGF-2+20ng/mLHGF+1*ITS+40ng/mL hVEGF

[0180](3)hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc：DF12+2％FBS+10ng/mLFGF-4+10ng/mLFGF-2+20ng/mL HGF+1*ITS

[0181]实施例7.不同修饰的基质表面hMSC向肝细胞诱导分化的检测

[0182]按照实施例3的方法制备胶原溶液和hE-cad-Fc分别修饰的6孔细胞培养板。制备hE-cad-Fc终浓度为10μg/mL、hVE-cad-Fc终浓度为10μg/mL及hVEGF-Fc终浓度为2μg/mL的混合溶液修饰的6孔细胞培养板。按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC接种在培养板表面，利用维持培养基培养过夜后更换为特定的分化培养基(培养基组分见实施例6的培养基(1)-(3))，每两天换液，连续培养28天，在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天时观察细胞形态，从图8中可以看出，加入分化培养基后，在不同基质表面的hMSC均开始发生形态变化，分化1周时细胞出现收缩，分化4周时细胞呈现卵圆形，在分化的全过程中，融合蛋白基质表面的细胞数量要明显多于胶原组且更早的发生形态变化，说明融合蛋白可以促进hMSC的定向分化，提高分化效率。同时，在上述时间点提取各组细胞RNA，进行反转录，PCR检测相关转胚层基因、肝细胞基因、肝极性蛋白基因、代谢酶基因和内皮细胞基因的表达情况。相关基因的引物序列、退火温度见下表。

[0183]Oct4，FoxA2，Sox17和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图9(如无特殊说明，以下实施例中C表示培养于胶原表面的细胞，E表示培养在hE-cad-Fc表面的细胞，E+V表示培养在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc表面的细胞)。

[0184]CK18，CK19，AFP，ALB和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图10。

[0185]OATP，MRP2和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图11。

[0186]G6Pase，α1-AT和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图12。

[0187]CD31，VE-钙粘素，VEGFR2和β-actin(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图13。

[0188]从PCR结果可以看出将hMSC培养在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc共修饰的基质表面及hE-cad-Fc修饰的基质表面可以显著提高hMSC表达肝样细胞标志物AFP、ALB和血管内皮样细胞标志物CD31，可以促进细胞极性蛋白OATP和MRP2的表达和维持，促进细胞表达与肝功能相关的某些代谢酶G6Pase和α1-AT的表达，且在共修饰的基质表面的诱导分化效率最佳。同时从图13也可以看出，血管内皮样细胞的标记物CD31在1周时即开始表达，其表达时间要早于肝样细胞标记物ALB和AFP的表达时间(图10)，与肝脏在体内发育过程类似(即先发育形成内皮细胞随后发育形成上皮细胞)。这就说明了hMSC在这种融合蛋白基质表面可以通过融合蛋白调控hMSC自分泌、旁分泌等功能，仿生构建细胞外微环境，实现肝细胞在体内的发育过程的模拟，提高分化效率，缩短分化时间，所获得的细胞可更好地维持和表达肝样细胞和血管样内皮细胞的功能。

[0189]在上述时间点，取细胞上清液进行ELISA检测ALB和Urea的表达量。ELISA结果见图14。从图14中可以看出，通过Elisa对分化后细胞的白蛋白分泌及尿素合成进行检测，发现分化第14天起其表达量逐步提高，且hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc组始终表达量高于hE-cad-Fc及胶原组。

[0190]

[0191]

[0192]实施例8.不同修饰的基质表面hMSC向肝细胞定向诱导分化的检测——免疫荧光染色

[0193]按照实施例7的方法处理激光共聚焦培养皿并利用不同的诱导分化培养基对hMSC进行诱导分化培养，连续培养28天后进行免疫荧光染色。细胞经过固定、打孔和封闭后，按照1∶500的稀释比例加入稀释后的100μL ALB抗体(abcam，美国)，4℃孵育过夜后按照1∶1000的稀释比例加入100μLFITC标记的山羊抗兔IgG抗体(Thermo Fisher Scientific，美国，货号A27034)，37℃室温孵育2h后加入含有DAPI的抗荧光淬灭剂(SouthernBiotech，美国，货号0100-20)，4℃避光保存，利用激光共聚焦显微镜(Leica)进行取像。结果见图15。

[0194]从图15可知，hMSC在不同基质表面连续分化4周之后通过免疫荧光染色可以看出，在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc共修饰的基质表面细胞更多的表达了肝样细胞的标记物ALB(箭头所示)，说明在这种基质表面hMSC向肝样细胞定向分化效率最高，且其肝功能表达最强。

[0195]免疫荧光染色步骤如下：

[0196]①弃培养基后利用冷0.01M PBS清洗细胞3次，弃PBS后加入新鲜配制的4％多聚甲醛，室温孵育10min；

[0197]②弃多聚甲醛后用冷0.01M PBS清洗细胞3次，若目标蛋白位于细胞质中，则需要用含有0.1％Triton X-100的PBS溶液室温孵育10min，冷0.01MPBS清洗细胞3次，若目标蛋白位于细胞膜上，则无需此步；

[0198]③用10％山羊血清室温孵育30min，弃上清后将一抗(ALB抗体)按照1∶500比例用0.01M PBS溶液稀释后加入到培养皿中，4℃过夜；

[0199]④弃上清并用0.01M PBS清洗细胞3次，每次5min；

[0200]⑤将二抗(山羊抗兔IgG抗体)按照1∶500比例用0.01M PBS溶液稀释后加入到培养皿中，避光37℃孵育2h；

[0201]⑥弃上清并用0.01M PBS避光清洗细胞3次，每次5min；

[0202]⑦弃上清，加入含有DAPI的抗荧光淬灭剂，4℃避光保存，利用激光共聚焦显微镜(Leica)进行取像。

[0203]实施例9.不同修饰的基质表面细胞定向诱导分化机制的研究——细胞因子、基质蛋白的分泌及调控分化相关蛋白的表达

[0204]按照实施例7的方法培养细胞、诱导分化并在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天提取RNA和蛋白。提取的RNA进行反转录后通过利用荧光定量PCR检测相关细胞因子和基质蛋白的表达情况(引物序列及退火温度见实施例3)，获得的数据以胶原组为对照组，利用2-ΔΔCt法进行处理；提取的蛋白利用west