1.血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白在制备用于促进细胞向血管内皮样细胞的分化的试剂中的应用，其中所述细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，其中所述胚胎干细胞来源于猪或鼠。

2.权利要求1所述的应用，其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG的Fc。

3.权利要求2所述的应用，其中所述IgG为IgG1。

4.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素由SEQ ID NO:2的序列表示，Fc由SEQ ID NO:3的序列表示。

5.权利要求4所述的应用，其中血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的序列由SEQ ID NO:1表示。

6.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述细胞来源于哺乳动物。

7.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述间充质干细胞或iPS细胞来源于人，猪或鼠。

8.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白连接在基质上。

9.权利要求8所述的应用，其中所述基质为水凝胶或多孔支架。

10.权利要求9所述的应用，其中所述多孔支架为PLGA支架或PCL支架。

11.权利要求9所述的应用，其中所述水凝胶是透明质酸水凝胶。

12.权利要求11所述的应用，其中所述透明质酸水凝胶为丙烯 酰肼化的透明质酸水凝胶，或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

13.权利要求12所述的应用，其中所述丙烯 酰肼化的透明质酸水凝胶是通过己二酸二酰肼和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对透明质酸修饰而制备。

14.权利要求12所述的应用，其中所述PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶是通过PAMAM树枝状大分子与巯基化透明质酸发生迈克尔加成反应而制备。

15.权利要求13-14任一项所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头与丙烯酰肼化透明质酸或PAMAM树枝状大分子连接。

16.权利要求15所述的应用，其中所述接头选自Fc结合肽，所述Fc结合肽选自CHWRGWV（SEQ ID NO:6），HYFKFD（SEQ ID NO:17），HFRRHL（SEQ ID NO:18)，FYWHCLDE(SEQ ID NO:19), SpA（staphylococcal蛋白A）。

17.改性的基质在制备促进间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞向血管内皮样细胞分化的试剂中的应用，其中所述改性基质包含血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白，所述基质为水凝胶或多孔支架，其中所述胚胎干细胞来源于猪或鼠。

18.权利要求17所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG的Fc。

19.权利要求17所述的应用，其中所述多孔支架为PLGA支架或PCL支架。

20.权利要求18所述的应用，其中所述IgG为IgG1。

21.权利要求17-20任一项所述的应用，其中所述细胞来源于哺乳动物。

22.权利要求17-20任一项所述的应用，其中所述间充质干细胞，iPS细胞来源于人，猪或鼠。

23.权利要求17-20任一项所述的应用，其中所述水凝胶是透明质酸水凝胶。

24.权利要求23所述的应用，其中所述透明质酸水凝胶是丙烯 酰肼化的透明质酸水凝胶，或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

25.权利要求24所述的应用，其中所述丙烯 酰肼化的透明质酸水凝胶是通过己二酸二酰肼和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对透明质酸修饰而制备。

26.权利要求24所述的应用，其中所述PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶是通过PAMAM树枝状大分子与巯基化透明质酸发生迈克尔加成反应而制备。

27.权利要求25-26任一项所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头与丙烯酰肼化透明质酸或PAMAM树枝状大分子连接。

28.权利要求27所述的应用，其中所述接头选自Fc结合肽，所述Fc结合肽选自CHWRGWV（SEQ ID NO:6），HYFKFD（SEQ ID NO:17），HFRRHL（SEQ ID NO:18)，FYWHCLDE(SEQ ID NO:19), SpA（staphylococcal蛋白A）。

技术领域

[0001]本发明涉及组织工程支架改性及其促进血管化的生物医学基础与应用开发领域，尤其是研制一种人血管内皮细胞钙粘素融合蛋白改性的支架材料及其在细胞培养和再生医学领域的应用。

背景技术

[0002]在过去的几十年里，组织工程及再生医学取得了长足的进步与发展，已经有多种自体组织替代物如皮肤、骨、软骨等成功试用于临床研究。然而，研究发现，由于细胞通过弥散获取营养和氧气的距离范围在150-200um以内条件限制，一些体积大、功能复杂的工程化组织如心肌、骨骼肌、肝脏等，在体外培养时很难超过1mm3，即使到体内也会由于宿主血管不能及时长入而导致中心部位细胞坏死。所以支架材料的快速而又充分的血管化是组织工程发展和临床应用面临的主要挑战之一。

[0003]生物材料支架作为承担细胞生长的一种空间载体，在组织工程血管化研究中扮演着十分重要的角色。一般用于组织工程的材料从其来源可以分为天然生物材料，如透明质酸、海藻酸、壳聚糖等，人工合成生物材料，如PEG、PLGA、PCL、苯乙烯(PS)等。可注射透明质酸水凝胶正在越来越成为一种理想的生物支架材料由于其良好的生物相容性、无毒性及其机械力学性质，正在越来越成为一种理想的生物支架材料。

[0004]已有研究报道表明，烯醇官能化聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子原位与硫醇化透明质酸(SH-HA)交联形成不同凝胶时间及机械硬度的水凝胶，在细胞培养和生物医学等领域具有广泛的应用。此外，研究表明RGD多肽改性的PAMAM/HA水凝胶显著改善HUVEC或hUC-MSCs的活力，增殖和对水凝胶基质的粘附。

发明内容

[0005]本发明人发现利用生物材料支架(例如丙烯酰肼化透明质酸水凝胶、PAMAM/HA水凝胶体系或PLGA支架)，并且利用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰，将会有利于生物支架材料内的血管化进程。

[0006]例如，利用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶，能够结合融合蛋白与水凝胶的双重优势，对水凝胶血管化起到联动协同的促进作用。

[0007]因此，本发明的一方面涉及血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白用于培养细胞或促进细胞血管化的应用。优选地，所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白连接在基质上。

[0008]另一方面，本发明涉及制备改性基质，包含用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰所述基质，其中所述基质为水凝胶或多孔支架，更优选所述多孔支架选自PLGA支架或PCL支架。

[0009]在本发明的又一方面，涉及制备改性基质的方法，包含用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰所述基质，其中所述基质为水凝胶或多孔支架，更优选所述多孔支架选自PLGA支架或PCL支架。

[0010]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc。

[0011]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素由SEQ IDNO:2的序列表示，Fc由SEQ ID NO:3的序列表示，优选血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的序列由SEQ ID NO:1表示。

[0012]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，所述细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，其中胚胎干细胞来源于猪或鼠，所述间充质干细胞或iPS细胞优选来源于哺乳动物，更优选来源于人，猪或鼠。

[0013]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白促进所述细胞向血管内皮样细胞的分化及血管化进程。

[0014]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，所述水凝胶是透明质酸水凝胶，优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。

[0015]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，其中所述丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶是通过己二酸二酰肼和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对透明质酸修饰而制备。

[0016]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，其中所述PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶是PAMAM树枝状大分子与巯基化透明质酸通过迈克尔加成反应而制备。

[0017]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头与丙烯酰肼化透明质酸或PAMAM树枝状大分子连接，优选地，所述接头选自Fc结合肽，所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQ ID NO:6)，HYFKFD(SEQ ID NO:17，参见参考资料3和4)，HFRRHL(SEQ ID NO:18，参见参考资料3和4)，FYWHCLDE(SEQ ID NO:19，参见参考资料1和2),SpA(staphylococcal蛋白A，参见参考资料1和2)。

[0018]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，包含用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰所述基质，其中所述基质为水凝胶或多孔支架，更优选所述多孔支架选自PLGA支架或PCL支架，优选地，其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc。

[0019]在上述本发明各个方面的具体实施方案中，优选地，所述细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，其中所述胚胎干细胞来源于猪或鼠，优选所述间充质干细胞或iPS细胞来源于哺乳动物，更优选来源于人，猪或鼠。在本发明的另一个方面，涉及所述的改性基质在促进细胞(优选干细胞，优选间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞)分化(优选向血管内皮样细胞分化)及血管化进程中的应用。

[0020]参考资料

[0021]1.Biomimetic design of affinity peptide ligands for human IgG basedon protein A-IgG complex,Biochemical Engineering Journal,88(2014(1-11)

[0022]2.FYWHCLDE-based affinity chromatography of IgG:Effect of liganddensity and purifications of human IgG and monoclonal antibody,Journal ofChromatography A,1355(2014)107-114.

[0023]3.Performance of hexamer peptide ligands for affinity purification ofimmunoglobulin G from commercial cell culture media,Journal of ChromatographyA,1218(2011)1691-1700

[0024]4.Purification of human immunoglobulin G via Fc-specific smallpeptide ligand affinity chromatography,Journal of Chromatography A1216(2009)910-918

附图说明

[0025]图1：丙烯酰肼化透明质酸的核磁共振氢谱检测，其中图1a为HA的核磁共振氢谱；图1b为HA-ADH的核磁共振氢谱；图1c为HA-AC的核磁共振氢谱。

[0026]图2：含有hVE-cad-Fc的pcDNA3.1表达载体的构建。

[0027]图3：纯化hVE-cad-Fc的蛋白质印迹和SDS-PAGE，其中M代表marker；P代表人IgG；R代表还原条件下提纯的hVE-cad-Fc；N代表非还原条件下hVE-cad-Fc。

[0028]图4：融合蛋白hVE-cad-Fc在水凝胶中固定的1周时间内的酶联免疫吸附测定实验。

[0029]图5：水凝胶成胶性、稳定性及降解性理化性质表征，其中图5a是不同交联剂下的成胶图；图5b是不同交联密度水凝胶在PBS溶液中的稳定性分析(图左)及低交联度水凝胶流变性分析(图右)；图5c是hVE-cad-Fc功能化改性水凝胶(DTT交联和MMP响应性多肽交联)前后溶胀性分析研究。

[0030]图6：融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC黏附、增殖及伸展的影响检测，其中图6a为hVE-cad-Fc对hUC-MSC在水凝胶表面(二维培养)的光镜观察及在水凝胶内部(三维培养)光镜观察及死活染色；图6b为hUC-MSC在DTT和MMP响应性多肽不同交联的水凝胶中三维培养3天的细胞死活染色。

[0031]图7：PAMAM树枝状大分子合成路线图及hVE-cad-Fc融合蛋白对水凝胶的功能化改性，其中图7a为PAMAM树枝状大分子合成路线图；图7b为三种不同PAMAM树枝状大分子的核磁共振氢谱图；图7c为hVE-cad-Fc融合蛋白在含有/不含有Fc-bp的水凝胶中14天时间内固定量的百分比；图7d为HUVEC与hUC-MSC在不同方式改性水凝胶上的黏附及增殖。

[0032]图8：水凝胶理化性质表征，其中图8a为hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶分别在培养基、透明质酸酶、hUC-MSC和HUVEC上清液中不同时间点剩余量百分比；图8b为hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶在PBS中的溶胀性检测；图8c为hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶粘弹性质检测；图8d为hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶扫描电子显微镜表面形貌特征检测。

[0033]图9：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC生存影响研究，其中图9a为HUVEC在不同改性水凝胶上培养3天的光镜观察图；图9b为HUVEC在不同改性水凝胶上培养3天的死活染色图；图9c为HUVEC在不同改性水凝胶上培养4,24,48,72小时的CCK-8检测的黏附增殖；图9d为HUVEC在不同改性水凝胶之上培养3天的骨架染色；图9e为HUVEC在不同改性水凝胶三维培养1,3,5,7天中黏附增殖；图9f为HUVEC在不同改性水凝胶中三维培养7天中死活染色。

[0034]图10：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC血管功能化的影响，其中图10a，b分别为HUVEC在不同改性水凝胶上培养24、48、72小时后蛋白质印迹实验检测vWF与eNOS蛋白的表达；图10c为HUVEC在不同改性水凝胶上培养4、24、48、72小时后一氧化氮释放量；图10d为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后激光共聚焦显微镜对低密度脂蛋白的吞噬检测。

[0035]图11：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC中hVE-钙粘素膜蛋白复合物表达的影响，其中图11a为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后细胞免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜检测hVE-钙粘素的表达；图11b为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后蛋白质印迹实验检测hVE-钙粘素、α-连环蛋白、β-连环蛋白、P120-连环蛋白的表达。

[0036]图12：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC中分子机制初步探究，其中图12a为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后蛋白质印迹实验检测FAK/P-FAK蛋白表达；图12b为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后蛋白质印迹实验检测AKT/P-AKT蛋白表达；图12c为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后蛋白质印迹实验检测PI3K蛋白表达；图12d为HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后蛋白质印迹实验检测VEGFR2/P-VEGFR2蛋白表达。

[0037]图13：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶稳定性研究，其中图13a为hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶(“+”代表水凝胶体系中有Fc-bp，“-”代表无Fc-bp)体外28天动物活体成像仪检测融合蛋白稳定性；图13b为hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶体内28天动物活体成像仪检测融合蛋白的稳定性；图13c为标记有Cy7活化脂的融合蛋白的体外荧光密度统计；图13d为标记有Cy7活化脂的融合蛋白的体内荧光密度统计。

[0038]图14：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶体内血管新生影响研究，其中图14a、c分别为2周、4周时间水凝胶取材之后体式显微镜观察不同改性水凝胶内部血管新生情况；图14b、d分别为2周、4周时间水凝胶取材之后石蜡切片H&E染色分析不同改性水凝胶内部血管新生情况。

[0039]图15：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶体内CD31染色，其中图15a、c为不同改性水凝胶于2周、4周时间取材之后石蜡切片细胞免疫荧光染色，高级正置荧光显微镜观察CD31表达；图15b、d为不同改性水凝胶于2周、4周时间取材之后蛋白质印迹法检测CD31蛋白的表达。

[0040]图16：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC生长性能影响，其中图16a为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养72小时死活染色；图16b为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养4、24、48、72小时CCK-8检测细胞黏附增殖；图16c为hUC-MSC在不同改性水凝胶中三维培养7天死活染色；图16d为hUC-MSC在不同改性水凝胶中三维培养1、3、5、7天CCK-8检测细胞增殖。

[0041]图17：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC分化形态学影响，其中图17a为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间光镜形态学观察；图17b为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间骨架形态学观察。

[0042]图18：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC分化血管内皮细胞功能性指标检测，其中图18a、c、e分别为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间实时荧光定量PCR检测CD31、eNOS、VEGFR2在基因水平的表达；图18b、d、f分别为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，蛋白质印迹法检测CD31、eNOS、VEGFR2在蛋白水平的表达；图18g为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，激光共聚焦显微镜观察细胞对低密度脂蛋白的吞噬。

[0043]图19：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC分化过程中hVE-钙粘素膜蛋白复合物表达影响，其中图19a为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，实时荧光定量PCR检测hVE-钙粘素基因的表达；图19b为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，蛋白质印迹法检测细胞中hVE-钙粘素、α-连环蛋白、β-连环蛋白、P120-连环蛋白的表达；图19c为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，激光共聚焦显微镜观察细胞中α-连环蛋白的表达及分布。

[0044]图20：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC分化过程中分子机制的初步探究，其中图20a为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，蛋白质印迹法检测细胞中FAK、P-FAK、PI3K、AKT、P-AKT蛋白的表达；图20b为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，蛋白质印迹法检测细胞中VEGFR2、P-VEGFR2蛋白的表达；图20c为hUC-MSC在不同改性水凝胶上培养2周时间，细胞免疫荧光染色后，激光共聚焦显微镜观察细胞中YAP蛋白的表达及分布。

[0045]图21：载有hUC-MSC的hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶在体内血管新生，其中图21a为不同改性水凝胶分别在2周、4周时间在小鼠体内的观察情况；图21b、c分别为不同改性水凝胶分别在2周、4周时间点原位和取材之后体式显微镜观察水凝胶内部的血管新生；图21d为不同改性水凝胶分别在2周、4周时间点取材切片H&E染色，高级正置显微镜观察水凝胶内部的血管新生。

[0046]图22：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶在体内CD31的表达，其中图22a、b分别为不同改性水凝胶分别在2周、4周时间点取材切片细胞免疫荧光染色，高级正置荧光显微镜观察水凝胶内CD31的表达及分布；图22c为不同改性水凝胶分别在2周、4周时间点取材，蛋白质印迹法检测水凝胶内部中CD31的表达。

[0047]图23：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对体内hUC-MSC生存能力影响，其中图23a为不同改性水凝胶分别在2周、4周时间点取材，蛋白质印迹法检测水凝胶内部中Ku80的表达；图23b分别为不同改性水凝胶分别在2周、4周时间点取材切片细胞免疫荧光染色，高级正置荧光显微镜观察水凝胶内Ku80的表达及分布。

[0048]图24：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA支架血液相容性分析研究。

[0049]图25：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA支架在体内稳定性研究，其中图25a为hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA支架在体内1、5、7、14、21天，动物活体成像仪观察其在小鼠体内的稳定性；图25b为荧光信号统计。

[0050]图26：hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA支架在动物体内的血管新生，其中图26a为不同改性PLGA支架在2周、4周时间点取材切片H&E染色，高级正置显微镜观察支架内部血管新生情况；图26b为不同改性PLGA支架在2周、4周时间点取材切片细胞免疫荧光染色，高级正置荧光显微镜观察小鼠vWF的表达和分布；图26c为不同改性PLGA支架在2周、4周时间点取材切片细胞免疫荧光染色，高级正置荧光显微镜观察人CD31表达和分布。

具体实施方式

[0051]以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例仅仅是为了说明本发明的目的，而非用于限制本发明。

[0052]在实施例中使用的常规化学试剂均购自索莱宝生物科技有限公司；所涉及的肽均由南京金斯瑞生物科技公司合成。

[0053]实施例1.丙烯酰肼化透明质酸的设计与合成

[0054]通过ADH(己二酸二酰肼)、NHS-AC(N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺)对透明质酸链的两步修饰，为透明质酸链修饰上丙烯酰肼基团。具体如下。

[0055]准确称取1g分子量为91KD的透明质酸(HA，山东福瑞达生物科技有限公司)粉末，核磁共振氢谱如图1-a所示。加入200ml ddH2O，搅拌充分溶解。向溶液中加入18g的ADH粉末搅拌至充分溶解，再向其中加入2g的EDAC(催化剂)粉末搅拌至充分溶解，调pH至4.75，分别在反应10分钟，30分钟，1小时，2小时后调溶液pH至4.75，反应过夜。第二天，调溶液pH至7后，开始透析步骤：透析液分别为100mM氯化钠溶液(48小时)，1/5的乙醇溶液(48小时)，ddH2O(48小时)。透析完成后，冻干粉末，称取粉末质量，并进行核磁共振氢谱检测ADH的取代度，如图1-b中的a,b所示。获得HA-ADH产物。

[0056]称取0.5g的HA-ADH产物，加入100ml ddH2O溶解，向其中加入质量比：mHA-ADH:mNHS-AC＝4:3的NHS-AC至充分溶解，调pH至7.20，反应开始进行，分别在反应10分钟，30分钟，1小时，2小时各个时间点调整溶液pH至4.75，反应过夜。第二天，开始透析步骤：透析液为100mM氯化钠溶液透析48小时，ddH2O透析48小时。透析完成后，冻干，称取粉末质量，并进行核磁共振氢谱检测Ac基团(图1c中c、d两峰)的取代度。此步骤中各反应步骤温度均控制在室温环境。获得HA-AC。

[0057]实施例2.丙烯酰肼化透明质酸的hVE-cad-Fc融合蛋白改性修饰

[0058]准确称取一定量的HA-AC粉末，配置成5％的溶液。

[0059]hVE-cad-Fc融合蛋白的序列为SEQ ID NO:1所示，其中SEQ ID NO:2的序列表示hVE-cad的序列；SEQ ID NO:3的序列表示Fc的序列。

[0060]2.1构建和表达人hVE-cad-Fc融合蛋白

[0061]参见杜凤仪博士论文，南开大学，2011年11月。主要如下。

[0062]2.1.1血管内皮细胞钙粘素胞外区基因VE-钙粘素的克隆和序列分析

[0063]根据UniProt数据库收录人VE钙粘素蛋白序列和功能分区，结合GenBank收录的基因(NCBI Reference Sequence:NM_001795.3)序列设计特异性PCR引物,扩增hVE钙粘素蛋白胞外区(EC1-EC5)。上游引物(P1)；5′-CCGGATATCATGCAGAGGCTCATGATGCTCC-3′(SEQ IDNO:4),引入EcoRⅤ酶切位点(下划线),下游引物:(P2)5′-AAGCGGCCGCTCTGGGCGGCCATATC-3′(SEQ ID NO:5)，引入NotⅠ酶切位点(下划线)。引物合成及测序均由Invitrogen有限公司完成。

[0064]HUVEC细胞(ScienCell)总mRNA提取：按照《分子克隆实验指南》(第三版)的常规方法提取mRNA。测O.D值定量RNA纯度和浓度。

[0065]反转录按照购买的BD公司试剂盒MicroRNA Assays中操作反转录体系如下：

[0066]

[0067]反转录程序如下：

[0068]

[0069]

[0070]以HUVEC提取的mRNA为模板，扩增出VE-钙粘素基因片段，PCR反应体系如下：

[0071]

[0072]扩增条件如下：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。向反应液中补加380μL ddH2O，再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH 5.0)，2倍体积的无水乙醇，-20℃中放置1h；4℃，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，真空干燥，将沉淀溶于适量TE中。

[0073]2.1.2 pcDNA3.1-hVE-cad-Fc真核表达载体的构建

[0074](1)EcoRⅤ、NotⅠ双酶切纯化后的PCR产物

[0075]酶切体系如下：

[0076]

[0077]37℃过夜反应，65℃灭活酶15min，向反应液中补加350μL ddH2O，再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH5.0)，2倍体积的无水乙醇，-20℃中放置1h。4℃，12000rpm离心10min，DNA沉淀用70％乙醇洗涤两次，真空干燥，将沉淀溶于10μLTE中。

[0078](2)pcDNA/3.1的EcoRⅤ和NotⅠ酶切；

[0079]pcDNA/3.1(ThermoFisher)的双酶切体系(3×50μL)如下：

[0080]

[0081]37℃过夜反应。将酶切产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳分离，紫外灯下切下目的片段，使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TaKaRa)进行回收，回收片段溶于25μL ddH2O中。

[0082](3)载体与目的片段的连接反应及转化反应

[0083]反应体系如下：

[0084]

[0085]16℃反应16小时。然后CaCl2转化感受态细胞BL21(DE3)37℃过夜培养16～18h。挑取转化子，小量提取质粒检测。

[0086]将回收的目的基因hVE钙粘素胞外区和带有Fc片段载体pcDNA3.1，在37℃恒温下分别进行双酶切(EcoRⅤ和NotⅠ)。电泳胶回收后,将回收产物混合，在T4 DNA连接酶的催化下，于16℃过夜连接。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后,用氨苄青霉素(Amp+)进行抗性筛选。提取质粒后双酶切鉴定，初步鉴定为正确的重组质粒进行DNA序列分析。将构建的重组质粒命名为pcDNA3.1/hVE-cad-Fc(见图2)。经测序验证序列正确。

[0087]2.1.3细胞转染与蛋白纯化

[0088]将pcDNA3.1/hVE-cad-Fc转染293F细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。

[0089]利用免疫球蛋白Fc段与rProtein A的特异性结合，通过GE Healthcare公司的Hitrap rProtein A FF柱子进行目的蛋白纯化。

[0090]2.1.4 Western blotting分析

[0091]纯化的hVE-cad-Fc融合蛋白质以10％SDS-PAGE胶电泳后转移至PVDF膜，5％脱脂奶封闭2小时，一抗兔抗人VE钙粘素胞外域的单克隆抗体(RD，1∶400稀释)孵育4℃过夜，HRP标记的羊抗兔二抗(abcam，1∶10 000稀释)室温孵育1小时，TBST洗膜，DAB试剂曝光显影定影分析。检测Fc形成二聚体时上样缓冲液中不加β巯基乙醇。在非还原态情况下可以在～240KD处看到一条条带和在还原态情况下在～120KD处可以看到一条条带，这些结果暗示了hVE-cad-Fc融合蛋白以二聚体的形式。(图3)

[0092]hVE-cad/Fc-结合(-)前液配置：每100uL 5％溶液添加5uL的10mg/mL hVE-cad-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:1)，充分混匀，37℃反应30min。

[0093]hVE-cad/Fc-结合(+)前液配置：每100uL 5％溶液添加2uL的浓度为4mg/mL Fc-结合多肽(序列：CHWRGWV，SEQ ID NO:6，Fc-结合多肽在本文中也缩写为Fc-bp)、5uL的10mg/mL hVE-cad-Fc融合蛋白，充分混匀，37℃反应30分钟。用ELISA的方法检测hVE-cad-Fc融合蛋白的固定量。具体方法如下：分别取50ul前液并加入交联剂二硫苏糖醇(DTT)(购自索莱宝生物科技有限公司)充分混匀，置于96孔板中成胶。成胶完成后，利用hVE-钙粘素ELISA检测试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)来完成，分别向hVE-cad-Fc修饰丙烯酰肼化透明质酸水凝胶、hVE-cad-Fc联合Fc-bp修饰丙烯酰肼化透明质酸水凝胶中加入200ul PBS溶液孵育，在不同的时间点1,3,5,7天以及不同溶液里收集上清，用试剂盒确定上清中残存的hVE-cad-Fc融合蛋白，检测其长期稳定性。如图4所示，相较于未添加Fc-bp水凝胶组，hVE-cad-Fc联合Fc-bp修饰水凝胶组中hVE-cad-Fc在第7天时仍有90％存留，而未添加Fc-bp水凝胶组中hVE-cad-Fc在第7天时存留量降至50％，说明Fc-bp的加入可以明显提升hVE-cad-Fc在水凝胶中的长期负载稳定性。

[0094]实施例3.丙烯酰肼化透明质酸水凝胶理化性质表征

[0095]设计含有MMPs响应性断裂多肽的双端巯基化的交联剂，考察水凝胶浓度、交联密度、修饰因子对水凝胶理化性质影响。

[0096]将MMP-2响应性多肽(CRGDPQGIWGQDRC，SEQ ID NO:7)及DTT两种交联剂分别用无氧无菌PBS稀释至所需浓度(最终浓度分别为160mM以及292mM)。

[0097]每100uL实施例1制备的丙烯酰肼化透明质酸溶液分别加入0.45g/ml DTT溶液3uL和6uL，交联度分别达到50％和100％，充分混匀，置于37度反应30分钟，制成不同交联度水凝胶。

[0098]对DDT和MMP-2交联的水凝胶成胶前后的凝胶状态进行宏观拍照观察，其中图5-a左为DTT交联下的水凝胶；图5-a右为MMP-2响应性多肽交联下的水凝胶。

[0099]取MMP-2响应性多肽交联剂(每100uL丙烯酰肼化透明质酸溶液加入浓度0.25g/ml溶液5ul)以及DTT交联剂(每100uL丙烯酰肼化透明质酸加入0.45g/ml溶液6uL)，加入水凝胶前液(含有Fc-bp)中37℃反应30分钟，生成DTT，DTT+hVE-cad-Fc，MMP，MMP+hVE-cad-Fc四种水凝胶，分别向水凝胶加入1mL PBS溶液至凝胶充分溶胀，在凝胶溶胀过程中取不同时间点进行凝胶质量称量进行溶胀性实验。同时按照以上实验步骤进行低、高两种交联密度(分别是50％和100％交联度)水凝胶溶胀性实验，观察交联密度对凝胶稳定性的影响。分别合成了DTT交联及MMP-2响应性多肽交联水凝胶体系，两种水凝胶均可以在PBS溶液中长期稳定存在(图5-b左)；并且丙烯酰肼化透明质酸溶液在添加DTT或MMP交联剂后均可以在30分钟成胶(图5-b右)。DTT与MMP响应性多肽两种交联的水凝胶均具有良好的溶胀性，且hVE-cad-Fc的添加并不会影响水凝胶本身的溶胀性(图5-c)。

[0100]实施例4.hVE-cad-Fc融合蛋白改性丙烯酰肼化透明质酸水凝胶对hUC-MSC粘附与增殖影响的研究

[0101]以功能化水凝胶为基质三维包埋培养间充质干细胞，研究水凝胶中RGD、hVE-钙粘素-Fc对细胞粘附、增殖、分化、迁移、管型形态形成及分化功能表达的影响。

[0102]使用常用方法(胰酶37度处理1分钟，DMEM/F12培养基终止消化)处理脐带间充质干细胞hUC-MSC(广州赛业生物科技有限公司)，取上清置于15ml离心管中，1000rpm速率5分钟离心，弃除上清。200ul稀释细胞制成高密度细胞悬液。96孔板每孔加入50ul，每孔保持在5000-8000细胞量进行二维培养，三维培养时，每孔板加入50ul实施例1制备的hVE-cad-Fc修饰的透明质酸水凝胶，细胞密度50万/100ul。每孔添加DMEM/F12培养基(DMEM:F12＝1:1，Hyclone)200ul，2天更换一次培养基。进行二维以及三维的死活、形态以及MMP2分泌的研究，细胞光镜拍照以及死活染色。

[0103]死活染色步骤如下：死活染色液组成为20ul 2mM EthD-III原液(Sigma)+5ul 4mMCalcein Am原液(Sigma)+10ml PBS。每孔加入200ul死活染色液，放置于37℃培养箱(二维10分钟，三维30分钟)，至染色结束，用PBS冲洗3遍(二维每次1-2min，三维每次5-10分钟)。清洗结束后，置于荧光显微镜下拍照观察。如图hVE-cad-Fc改性水凝胶能够显著促进hUC-MSC的黏附及增殖(图6-a).相较于DTT交联水凝胶，MMP-2响应性多肽交联剂交联形成的具有基质金属蛋白酶响应性降解特性的水凝胶可以明显促进hUC-MSC在水凝胶中的伸展(图6-b)。

[0104]实施例5 PAMAM/透明质酸水凝胶的功能化改性

[0105]G5-Ac-DVS，G5-Ac-DVS-RGD,G5-Ac-DVS-Fc-bp的合成，具体如下：第5代PAMAM(PAMAM G5)树枝状大分子(502mg，0.0197mmol，购自Dendritech Inc.Midland,MI,USA)溶解于甲醇(60mL)，加入三乙胺(259ul，1.846mmol)，室温搅拌10分钟。向反应混合液中滴加溶液乙酸酐(140ul，1.477mmol)的甲醇(40ml)溶液中。反应过夜，通过截留分子量为10000的膜透析，PBS(10ml×3)和去离子水(10ml×3)清洗。冻干得到G5-Ac产物。

[0106]G5-Ac(333mg，0.0116mmol)溶解于去离子水(20ml)。加入2-亚氨氢氯化硫醇(80.05mg，0.582mmol)。氮气保护室温反应24小时。通过截留分子量为10000的膜透析，PBS(10ml×3)和去离子水(10ml×3)清洗。冻干得到G5-Ac-SH产物。

[0107]G5-Ac-SH(213.4mg，0.00661mmol)溶解于去离子水(15ml)。加入二乙烯砜(DVS，132.5ul，1.321mmol)。氮气保护室温反应2天。通过截留分子量为10000的膜透析，PBS(10ml×3)和去离子水(10ml×3)清洗。冻干得到G5-Ac-DVS。

[0108]G5-Ac-DVS(58.5mg，0.00166mmol)溶解于去离子水(5ml)。RGD多肽CGRGDS(SEQ IDNO:8，6.9mg，0.0116mmol)溶解于去离子水(1ml)，两种溶液混合。室温反应1小时。通过截留分子量为10000的膜透析，PBS(10ml×3)和去离子水(10ml×3)清洗。冻干得到G5-Ac-DVS-RGD。

[0109]G5-Ac-DVS(164mg，0.00513mmole)，Fc结合多肽(4.83mg,0.00513mmol)各溶解于无氧水5ml与1ml中。然后多肽溶液慢慢加入到树枝状分子溶液中并不断搅拌。混合溶液室温搅拌反应1小时。反应混合液通过截留分子量为10000的膜过滤。剩余物分别用PBS(15ml×3次)和水(15ml×3次)清洗。最后冻干得到产率为95.9％的G5-Ac-DVS-Fc-bp产物。合成路线图如图7-a所示。核磁共振氢谱如图7-b所示。

[0110]透明质酸水凝胶功能化改性，具体如下。

[0111]首先，G5-Ac-DVS-Fc-bp树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液加入10ul初始浓度200ug/ml的hVE-cad-Fc融合蛋白，37℃孵育1小时，之后加入50ul巯基化透明质酸(Bio Time Inc)，加入96孔板；对照组为G5-Ac-DVS树枝状大分子，其余操作步骤相同。待形成稳定水凝胶之后，每孔加入100ul PBS浸没水凝胶，分别在1、3、5、7、10、14日取上清液，ELISA试剂盒(R&D)方法检测hVE-cad-Fc融合蛋白释放量。按照试剂盒的说明具体方法如下：标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50ul，零孔加入标准品/样品稀释液50ul，然后加入酶标试剂50ul。样品孔：加入样品50ul，然后加入酶标试剂50ul。轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃孵育60分钟。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干。每孔先加显色剂A 50ul，再加入显色剂B 50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。每孔加终止液50ul，终止反应。于452nm下测定吸光度。结果表明hVE-cad-Fc通过Fc-bp的连接2周时间内在水凝胶固定率达到了85％左右，而没有通过Fc-bp连接的hVE-cad-Fc在水凝胶中固定率只达到了40％左右(图7-c)。分别将上述两种不同方式改性的水凝胶前液均匀加入到48孔板中，待形成稳定水凝胶之后，每孔分别接种2×104个HUVEC(美国ScienCell公司)和hUC-MSC(广州赛业有限公司)，24小时之后相差显微镜分别观察两种细胞的黏附及形态特征，结果表明hVE-cad-Fc通过Fc-bp固定方式改性的水凝胶相比于无Fc-bp水凝胶体系，能够显著促进细胞的黏附(图7-d)。

[0112]实施例6融合蛋白功能化改性的透明质酸水凝胶理化性质表征

[0113]制备两种不同水凝胶。

[0114]一种为hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶：

[0115]G5-Ac-DVS-Fc-bp树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液加入10ul初始浓度200ug/ml的hVE-cad-Fc融合蛋白，室温孵育1小时，之后加入50ul巯基化透明质酸，形成hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶；

[0116]一种为没有改性的水凝胶，G5-Ac-DVS树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液，之后加入50ul巯基化透明质酸，形成没有改性水凝胶。

[0117]水凝胶降解实验，具体如下：两种不同水凝胶分别在PBS、透明质酸酶(生工)、HUVEC培养基(ScienCell公司，成分包含500ml基础培养基，25mlFBS,5ml内皮细胞生长因子，5ml青霉素/链霉素)上清液、hUC-MSC培养基(HyClone，包含DMEM培养基和F12培养基的1:1混合物)上清液中浸泡2周时间，初始水凝胶重量记为M0，分别在1、3、5、7、10、14日时间点用吸水纸吸掉多余PBS，称重剩余水凝胶重量记为Mt，代入公式M％＝(M0-Mt)/M0。结果表明，水凝胶在PBS中基本没有发生降解，在透明质酸酶溶液中24小时内基本降解完全，在细胞培养基上清液中，降解到70％左右。hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶的降解性没有发生改变(图8-a)。

[0118]水凝胶溶胀性实验，具体如下：两组不同水凝胶分别在PBS中浸没时间2周，初始水凝胶重量记为M0，分别在1、3、5、7、10、14日时间点用吸水纸轻轻的吸掉多余的PBS，称重剩余水凝胶重量记为Mt，计算方法同上。水凝胶在PBS溶液中基本没有发生溶胀，hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶的溶胀性没有发生改变(图8-b)。

[0119]水凝胶流变性实验，准备上述两种水凝胶前液样品(融合蛋白改性水凝胶，未改性水凝胶)各500ul，利用流变仪(AR 2000ex)检测水凝胶粘弹性。首先打开空压机，气罐压力自动上升到0.5MP时顺时针调节输出压力到0.45MP，检查流变仪压力调节阀，使之在30Pis处稳定5分钟；其次，打开循环水，测试站空气轴承保护锁，安装平行夹板；然后，打开流变仪主机，电脑测试流变程序，仪器校准；最后，根据不同的实验需求设置一定的参数，配制样品开始测试。具体参数设置：平行夹板4cm，间隙设定500um，温度25℃。动态时间扫描：时间7200秒，每隔20秒取一个点，频率是1rad/s，应力是1％；应变扫描范围0.1-10％，频率1rad/s；动态频率扫描范围0.1-100rad/s，应力1％。在测试样品时，取500ul待测试样品加入到托盘中，降低平行板夹具间隙为500um，进而开始测试样品。结果表明，透明质酸溶液能够形成水凝胶，粘弹性良好，且具有一定的机械应力强度，hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶的流变性质没有发生改变(图8-c)。

[0120]水凝胶表面形貌表征，准备两组水凝胶样品各200ul，冷冻真空干燥处理，将干燥的多孔水凝胶切割成立方体结构，用双面胶将样品观察面向上黏贴在扫描电镜铜板之上。SEM(QUANTA 200,FEI)扫描结果表明，水凝胶内部具有比较均匀的孔隙率结构，hVE-cad-Fc融合蛋白改性前后水凝胶的形貌特征没有发生明显变化(图8-d)，其中左1为对照组水凝胶，左2为其局部放大图，左3为hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶，左4为其局部放大图。

[0121]实施例7融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC生存影响研究

[0122]实验样品制备，具体如下：实验分为3个组，(1)对照(Control)组，G5-Ac-DVS树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液，之后加入50ul巯基化透明质酸，形成单独水凝胶体系；(2)RGD组，G5-Ac-DVS-RGD树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液,之后加入50ul巯基化透明质酸，形成RGD改性水凝胶体系；(3)hVE-cad-Fc组，G5-Ac-DVS-Fc-bp树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液,加入10ul初始浓度200ug/ml的hVE-cad-Fc融合蛋白，室温孵育1小时之后，加入50ul巯基化透明质酸，形成hVE-cad-Fc改性水凝胶体系；

[0123]细胞光镜观察实验：将事先准备好的3组不同水凝胶前液样品100ul均匀加入到96孔板中，37℃孵育10分钟，待形成稳定的水凝胶。每孔种植细胞1×104，细胞培养箱(37℃，5％CO2)培养，待细胞培养72小时，倒置相差显微镜(奥林巴斯，CKX41)观察细胞形貌特征，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶组中，HUVECs形貌出现了类似毛细血管样结构。(图9-a)

[0124]细胞死活染色实验，具体如下：待细胞培养72小时，吸出细胞培养基，PBS清洗干净，配置细胞死活染色液：2ul 2mM EthD-III原液+0.5ul4mM Calcein Am原液+1mlPBS。每孔加入100ul死活染色液，放置于细胞培养箱30分钟，PBS清洗3遍。荧光显微镜之下进行观察。结果表明融合蛋白改性水凝胶相较于对照组显著增强细胞存活能力。(如图9-b)

[0125]细胞增殖实验。将事先准备好的3组不同水凝胶前液样品100ul均匀加入到96孔板中，37℃孵育10分钟，待形成稳定的水凝胶。每孔种植细胞1×104，细胞培养箱(37℃，5％CO2)培养，分别在4、24、48、72小时CCK-8实验检测细胞活力，具体如下：首先吸出细胞培养基，PBS清洗干净，加入事先配置好的CCK-8溶液(每100ul含10ul CCK-8原液(CA1210,Solarbio)与90ul ECM培养基(ScienCell公司))，每孔100ul，37℃孵育4小时，将上述孵育之后的CCK-8溶液转移至新的96孔板，酶标仪测定在450nm处的吸光值。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶能够促进细胞的黏附及增殖(图9-c)。

[0126]细胞骨架染色实验，具体如下：将3种不同的水凝胶前液均匀加入到激光共聚焦小皿中，待形成稳定的水凝胶。每皿种植HUVEC 3×104个，细胞培养72小时。轻轻吸掉细胞培养基上清液，370C预热的PBS清洗细胞，4％多聚甲醛固定细胞10min，0.1％Triton x-100细胞透膜处理10分钟，1％牛血清白蛋白室温封闭40分钟，FITC-鬼笔环肽(Sigma)染色细胞骨架微丝，最后DAPI(Sigma)染色细胞核。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶能够显著促进细胞骨架的伸展(图9-d)。

[0127]水凝胶对HUVEC三维生长影响研究。取3种不同分组的水凝胶前液各100ul，每组各加入HUVECs 1×105个，轻轻吹打混匀，加入到96孔板，等待形成水凝胶之后，加入ECM培养基，分别在1、3、5、7天CCK-8检测细胞活力，实验方法同上，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶相较于对照组能够显著促进细胞增殖(图9-e)。此外，在第7天，对细胞进行死活染色实验，实验方法同上。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶相较于对照组显著增强HUVECs的存活能力(图9-f)。

[0128]实施例8融合蛋白功能化改性的水凝胶对HUVEC血管功能化的影响

[0129]准备实施例7中所述的3种不同改性水凝胶前液各200ul，均匀加入到6孔板中待形成稳定水凝胶，每孔种植HUVECs 1×105，分别在24、48、72小时提取细胞蛋白。具体如下：倒掉培养基，PBS清洗细胞。RIPA(Sigma)冰上裂解细胞，收集裂解液13000rpm，离心10分钟，收集上清液之加入上样缓冲液煮沸5分钟，-20℃储存备用。用8％-10％凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，加入抗vWF，抗eNOS一抗(Abcam)，4℃过夜，PBST清洗膜，加入IgG-HRP二抗(Santacruz)，室温孵育2小时，PBST清洗膜，ECL发光检测蛋白表达。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性的水凝胶能够显著促进HUVECs中vWF及eNOS蛋白的表达，相较于对照组及RGD组而言(图10-a，b)。

[0130]将不同改性水凝胶前液均匀加入到96孔板中，待形成稳定水凝胶，每孔种植HUVECs细胞1×104，分别在4h、24h、48h、72小时检测细胞NO释放量。具体如下：收集HUVECs培养基上清液，按照NO试剂盒(碧云天中国)指导说明进行检测，OD540测吸光度值。结果表明hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶能够显著促进NO的释放，相较于对照组与RGD组水凝胶而言(图10-c)。

[0131]不同改性水凝胶前液各100ul均匀加入到共聚焦小皿中，待形成稳定水凝胶，每皿种植HUVECs 2×104，72小时检测细胞对低密度脂蛋白(Ac-LDL)的吞噬情况。具体如下：待细胞培养至72小时，去除原来细胞培养基，PBS清洗，然后加入带有荧光标签的低密度脂蛋白(Invirogen,USA)至新的细胞培养基中，培养5小时左右，去除培养基，PBS清洗干净，预热4％多聚甲醛固定细胞10分钟，PBS清洗，DAPI染色细胞核10分钟，PBS清洗，激光共聚焦显微镜观察。结果表明hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶显著增强了HUVECs对Ac-LDL的吞噬能力，相较于对照组与RGD组水凝胶而言(图10-d)。

[0132]实施例9融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC的hVE-钙粘素膜蛋白复合物表达的影响

[0133]实施例7制备的不同改性水凝胶前液各100ul均匀加入到共聚焦小皿中，待形成稳定水凝胶，每皿种植HUVECs 2×104，72小时细胞免疫荧光染色实验检测HUVECs hVE-钙粘素的表达。具体如下：细胞培养72小时之后，去除培养基，PBS清洗，预热4％多聚甲醛室温固定10分钟，PBS清洗3次，1％BSA室温封闭1小时，加入抗-hVE-钙粘素一抗(Abcam)，4℃过夜，PBS清洗3次，每次5分钟，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(Sigma)室温封闭1小时，PBS清洗3次，DAPI染色细胞核10分钟，激光共聚焦显微镜检测，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶能够提高HUVECs中hVE-钙粘素的表达(图11-a)。

[0134]不同改性水凝胶前液各200ul均匀加入到6孔板中，待形成稳定水凝胶，每孔种植HUVECs 1×105，细胞培养至72小时，提取细胞蛋白。具体如下：倒掉培养基，PBS清洗细胞。RIPA(Sigma)冰上裂解细胞，收集裂解液13000rpm，离心10分钟，收集上清液，加入SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀后煮沸5分钟。-20℃储存备用。用8％-10％凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，分别加入抗-hVE-钙粘素，抗-α-连环蛋白，抗-β-连环蛋白，抗-p120-连环蛋白，P-FAK，P-AKT，PI3K，P-VEGFR2一抗(Abcam)，4℃过夜，PBST清洗膜，加入辣根过氧化酶标记的特异性二抗(Santacruz)，室温孵育2小时，PBST清洗膜，ECL发光检测蛋白表达。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性的水凝胶能够显著促进HUVECs中VE-钙粘素等膜蛋白复合物的表达，相较于对照组及RGD组水凝胶(图11-b)。此外，hVE-cad-Fc融合蛋白改性的水凝胶能够提高HUVECs内P-FAK，PI3K，P-AKT及P-VEGFR2蛋白的表达(图12a-d)。

[0135]实施例10 hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶稳定性研究

[0136]制备载有cy7的hVE-cad-Fc融合蛋白改性的水凝胶，具体如下：hVE-cad-Fc与cy7活化脂(Sigma)等摩尔比例充分混匀，37℃反应过夜，超滤离心除去未结合的cy7活化脂，将制备得到载有cy7的融合蛋白分别加入到G5-Ac-DVS，G5-Ac-DVS-Fc-bp中，反应1小时，加入巯基化透明质酸(SH-HA)。

[0137]体外稳定性：将两种不同水凝胶前液(一种含有Fc-bp，一种不含有Fc-bp)各100ul体外形成水凝胶，浸泡于PBS中；于不同时间点0、1、7、14、21、28天通过动物活体成像仪观察，结果表明hVE-cad-Fc通过Fc-bp改性到水凝胶中，能够在1个月时间内比较稳定存在，相较于不含Fc-bp组(图13-a)，荧光信号强度统计如图13-c；

[0138]体内稳定性：两种不同水凝胶前液(一种含有Fc-bp，一种不含有Fc-bp)各100ul小鼠皮下注射，原位形成水凝胶；于不同时间点0、1、7、14、21、28天通过动物活体成像仪观察,结果表明hVE-cad-Fc融合蛋白通过Fc-bp改性到水凝胶中，1月时间内能够比较稳定存在于小鼠体内(图13-b)，荧光信号强度统计如图13-d。

[0139]实施例11融合蛋白功能化改性水凝胶体内对血管新生的影响

[0140]准备实施例7制备的对照组，RGD以及hVE-cad-Fc不同改性水凝胶前液各100ul，小鼠皮下注射，原位形成水凝胶，分别于2周、4周取材，体式显微镜观察水凝胶内部的血管新生，其中图14-a为2周时间水凝胶血管新生；图14-c为4周时间水凝胶内部血管新生。切片染色观察水凝胶在体内的血管新生情况，具体如下：将取出的材料在4％多聚甲醛溶液中固定处理4小时，70％、80％、90％、100％酒精各脱水处理1小时，二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ透明处理各1小时，在60℃恒温箱中先在石蜡I中处理1小时、然后在石蜡Ⅱ中处理1小时，样品包埋，石蜡切片机切片。H&E染色实验，60℃拷片直至石蜡融化完全，之后，石蜡切片经二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ脱蜡各5分钟，然后放入100％、95％、90％、80％、70％浓度酒精溶液中各5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。切片放入苏木精中染色3分钟，流水冲洗3分钟，将切片放入1％盐酸乙醇液中分化处理2秒，流水漂洗3分钟，伊红染色3分钟，流水漂洗3分钟，染色后，用浓度递增的酒精脱水各5秒，浓度梯度为70％、80％、90％、95％、100％。之后用二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ透明处理各5分钟。之后中性树脂封片，正置荧光显微镜观察，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶能够显著促进血管的新生；其中图14-b为2周时间H&E染色分析结果；图14-d为4周时间H&E染色分析结果。

[0141]CD31免疫荧光染色：60℃拷片直至石蜡融化完全，之后，石蜡切片经二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ脱蜡各5分钟，然后放入100％、95％、90％、80％、70％浓度酒精溶液中各5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。0.1％Triton-100室温破膜10分钟，之后抗原修复。PBS清洗3次，羊血清室温封闭45分钟，加入抗CD31一抗(Abcam)，4℃湿盒过夜，湿盒复温1小时，PBS清洗5次，每次5分钟；加入IgG-FITC二抗(Sigma)，室温避光孵育2小时，PBS清洗5次，每次5分钟，DAPI细胞核染色；高级正置荧光显微镜观察。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶能够显著促进血管新生，相比较于对照组和RGD改性水凝组，其中图15-a为2周时间CD31免疫荧光染色分析结果；图15-c为4周时间CD31免疫荧光染色分析结果。

[0142]提取回收体内蛋白，Western bolt实验检测体内血管内皮细胞CD31蛋白的表达情况，具体如下：将回收体内的水凝胶加入组织裂解液(Sigma)，研磨充分，收集裂解液13000rpm，离心10分钟，收集上清液加入SDS-PAGE上样缓冲液(索莱宝)煮沸5分钟，-20℃储存备用。用8％-10％凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，根据检测的蛋白加入一抗：抗-CD31抗体(Abcam)，4℃过夜，PBST清洗膜，加入IgG-HRP二抗(Santacruz)，室温孵育2小时，PBST清洗膜，ECL发光检测蛋白表达。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性的水凝胶能够显著上调CD31表达，相较于对照组及RGD组水凝胶，其中图15-b为2周时间蛋白印迹实验分析结果；图15-d为4周时间蛋白印迹实验分析结果。

[0143]实施例12 hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶对hUC-MSC生长性能影响的研究

[0144]实验样品制备，具体如下：实验分为3个组，(1)对照组，G5-Ac-DVS树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液，之后加入50ul巯基化透明质酸，形成单独水凝胶体系；(2)RGD组，G5-Ac-DVS-RGD树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液,之后加入50ul巯基化透明质酸，形成RGD改性水凝胶体系；(3)hVE-cad-Fc组，G5-Ac-DVS-Fc-bp树枝状大分子25mg于500ul无氧PBS中完全溶解待用，取50ul上述溶液,加入10ul初始浓度200ug/ml的hVE-cad-Fc融合蛋白，室温孵育1h之后，加入50ul巯基化透明质酸，形成hVE-cad-Fc改性水凝胶体系；

[0145]hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC二维生长影响研究。具体如下：将事先准备好的3组不同水凝胶前液样品100ul均匀加入到96孔板中，37℃孵育10分钟，待形成稳定的水凝胶。每孔种植hUC-MSC1×104，细胞培养箱(37℃，5％CO2)培养，分别在4、24、48、72小时CCK-8实验检测细胞活力。

[0146]CCK-8实验具体如下：首先吸出细胞培养基，PBS清洗干净，加入事先配置好的CCK-8溶液(每100ul含10ul CCK-8原液(CA1210,Solarbio)与90ul DF-12培养基，Hyclone)，每孔100ul，37℃孵育4小时，将上述孵育之后的CCK-8溶液转移至新的96孔板，酶标仪OD450检测吸光值。

[0147]结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶能够促进hUC-MSC的黏附及增殖，相比较于对照组水凝胶而言(如图16-b)。

[0148]细胞死活染色实验，具体如下：待细胞培养72小时，吸出细胞培养基，PBS清洗干净，配置细胞死活染色液2ul 2mM EthD-III原液+0.5ul 4mM Calcein Am原液+1ml PBS。每孔加入100ul死活染色液，放置于细胞培养箱30分钟，PBS清洗洗3遍。荧光显微镜之下进行观察。结果表明hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶相较于对照组显著增强细胞存活能力(图16-a)。

[0149]hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对hUC-MSC三维生长影响研究。取不同改性分组的水凝胶前液各100ul，每组各加入hUC-MSC 1×105个，轻轻吹打混匀，加入到96孔板，等待形成水凝胶之后，加入DF-12培养基，分别在1、3、5、7天CCK-8检测细胞活力，实验方法同上，结果表明，融合蛋白改性水凝胶相较于对照组能够显著促进细胞增殖(图16-d)。此外，在第7天，对细胞进行死活染色实验，实验方法同上。结果表明，在三维培养中，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶相较于对照组显著增强hUC-MSC的存活能力(如图16-c)

[0150]实施例13 hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶对hUC-MSC分化形态学影响

[0151]实施例12制备的3种不同改性水凝胶前液各200ul，均匀加入到6孔板中待形成稳定水凝胶，每孔种植hUC-MSC 1×105，EBM-2培养基(Hyclone)中分化2周时间，相差显微镜形态学观察，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶中hUC-MSC形态出现了毛细血管样结构(图17-a)。

[0152]细胞骨架染色实验，具体如下：将3组不同改性水凝胶前液各100ul均匀加入到激光共聚焦皿中，37℃孵育10分钟，待形成稳定的水凝胶。每个皿种植hUC-MSC细胞3×104，细胞培养分化2周。轻轻吸掉细胞培养基上清液，37℃预热的PBS清洗细胞，4％多聚甲醛固定细胞10分钟，0.1％Triton x-100细胞透膜处理10分钟，1％牛血清白蛋白室温封闭40分钟，FITC-鬼笔环肽染色细胞骨架微丝，最后DAPI染色细胞核。激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶中hUC-MSC骨架形态发生了明显变化，出现了类似于毛细血管样结构，相比较于对照组与RGD改性水凝胶组而言(图17-b)。

[0153]实施例14 hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对间充质干细胞向内皮样细胞分化影响研究

[0154]准备实施例12制备的3种不同改性水凝胶前液各200ul，均匀加入到6孔板中待形成稳定水凝胶，每孔种植hUC-MSC 1×105，EBM-2培养基中分化2周时间。实时荧光定量PCR检测基因表达，具体如下：吸掉细胞培养基，预热PBS清洗细胞，每孔加入Trizol 1ml，吹打混匀，室温孵育5分钟，细胞收集到Ep管中；每1ml Trizol加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒至均匀，室温孵育3分钟；离心，10000rpm，4℃，10分钟，离心至分层；吸取无色水箱于新Ep管中，每使用1ml Trizol加入500ul异丙醇，颠倒混匀，室温孵育5分钟；离心，10000rpm，4℃，10分钟，管内出现胶状沉淀。弃掉上清，加入1ml 75％酒精(0.75ml酒精+0.25ml DEPC水)，勿吹沉淀；离心，7500rpm，4℃，5分钟；弃上清，室温晾干沉淀，吸尽残液；沉淀溶于20ul RNA溶解液中；60℃孵育10分钟，-80℃保存样品。反转录PCR:具体如下，按照反转录试剂盒(罗氏)进行实验。反转录酶Buffer 4ul，水4ul，RNase抑制剂0.5ul，dNTPs 2ul,Random Primer1ul，反转录酶0.5ul，RNA样品8ul。之后进行实时荧光定量PCR检测hUC-MSC分化过程中CD31，VEGFR2，eNOS基因的表达，具体步骤如下：95℃5分钟；95℃30秒，各引物退火温度1分钟，72℃1分钟，42个循环；72℃5分钟；4℃。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶能够显著上调hUC-MSC中CD31，VEGFR2，eNOS基因的表达(图18-a、c、e)。荧光定量PCR引物序列如下：CD31(上游引物5′-GTGAGGGTCAACTGTTCTGT-3′，SEQ ID NO：9；下游引物5′-GTGACCAGTTCACTCTTGGT-3′，SEQ ID NO：10)，VEGFR2(上游引物5′-ATTACCCCAGGATATGGAG-3′，SEQ ID NO:11；下游引物5′-CCGTCAAGGGAAAGACTACG-3′，SEQ ID NO:12)，eNOS(上游引物，5′-GACCCACTGGTGTCCTCTTG-3′SEQ ID NO：13；下游引物，5′-CTCCGTTTGGGGCTGAAGAT-3′SEQ ID NO:14)。

[0155]准备实施例12制备的3种不同改性水凝胶前液各200ul，均匀加入到6孔板中待形成稳定水凝胶，每孔种植hUC-MSC 1×105，EBM-2培养基中分化2周时间。蛋白印迹实验检测细胞中蛋白的表达，具体如下：倒掉培养基，PBS清洗细胞。RIPA冰上裂解细胞，收集裂解液13000rpm，离心10分钟，收集上清液，加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸5分钟，-20℃储存备用。用8％-10％凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，根据检测的蛋白分别加入对应的一抗：抗-CD31抗体(Abcam)，抗-VEGFR2抗体(Abcam)，抗-eNOS抗体(Abcam)，4℃过夜，PBST清洗膜，加入IgG-HPR二抗(Santacruz)，室温孵育2小时，PBST清洗膜，ECL发光检测蛋白表达。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶能够显著上调进hUC-MSC的CD31、VEGFR2及eNOS蛋白的表达(如图18-b，d，f)。

[0156]细胞吞噬低密度脂蛋白(LDL)实验，具体如下：将3组不同改性水凝胶前液各100ul均匀加入到激光共聚焦皿中，37℃孵育10分钟，待形成稳定的水凝胶。每个皿种植hUC-MSC细胞3×104，细胞培养分化2周。吸掉培养基，PBS清洗，将带有荧光标签的低密度脂蛋白(Invitrogen，USA)加入细胞培养基中，细胞培养5小时左右，吸掉培养基，4％多聚甲醛固定细胞10分钟，PBS清洗，DAPI染色细胞核10分钟，PBS清洗，激光共聚焦显微镜下观察，结果表明,hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶显著增强了hUC-MSC对Ac-LDL的吞噬能力(如图18-g)。

[0157]实施例15 hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶对hUC-MSC的hVE-钙粘素膜蛋白复合物表达的影响

[0158]准备实施例12制备的3种不同改性水凝胶前液各200ul，均匀加入到6孔板中待形成稳定水凝胶，每孔种植hUC-MSC 1×105，EBM-2培养基中分化2周时间。实时荧光定量PCR检测基因表达，具体如下：吸掉细胞培养基，预热PBS清洗细胞，每孔加入Trizol 1ml，吹打混匀，室温孵育5分钟，细胞收集到Ep管中；每1ml Trizol加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒至均匀，室温孵育3分钟；离心，10000转/分钟，4℃，10分钟，离心至分层；吸取无色水箱于新Ep管中，每使用1ml Trizol加入500ul异丙醇，颠倒混匀，室温孵育5分钟；离心，10000rpm，4℃，10分钟，管内出现胶状沉淀。弃掉上清，加入1ml 75％酒精(0.75ml酒精+0.25ml DEPC水)，勿用力吹沉淀；离心，7500rpm，4℃，5分钟；弃上清，室温晾干沉淀，吸尽残液；沉淀溶于20ul RNA溶解液中；60℃孵育10分钟，-80℃保存样品。反转录PCR:具体如下，按照反转录试剂盒(罗氏)进行实验。反转录酶Buffer 4ul，水4ul，RNase抑制剂0.5ul，dNTPs 2ul,RandomPrimer1ul，反转录酶0.5ul，RNA样品8ul。之后进行实时荧光定量PCR检测hUC-MSC分化过程中hVE-钙粘素基因的表达，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶能够显著上调hUC-MSC中hVE-钙粘素基因的表达(图19-a)。荧光定量PCR反应中引物序列如下：hVE-钙粘素(上游引物5′-CTGGGCACCGACTCATCCGACTCT-3′，SEQ ID NO:15，下游引物5′-GGCCCCTTCCTCCCTCTTGAAG-3′，SEQ ID NO:16)。反应条件如下：95℃5分钟；95℃30秒，各引物退火温度1分钟，72℃1分钟，42个循环；72℃5分钟；4℃终止。蛋白印迹实验检测hUC-MSC细胞内蛋白表达，具体如下：准备实施例12制备的3种不同改性水凝胶前液各200ul，均匀加入到6孔板中待形成稳定水凝胶，每孔种植hUC-MSC 1×105，EBM-2培养基中分化2周时间。RIPA冰上裂解细胞30分钟，13000转/分钟离心10分钟，8％-10％分离胶对蛋白进行分离，然后湿转到PVDF膜，脱脂牛奶封闭1h，分别加入一抗：抗-hVE-钙粘素(1:2000,CST)，抗-α-连环蛋白(1:2000,CST)，抗-β-连环蛋白(1:2000,CST)，p120-连环蛋白(1:2000,CST)，4℃过夜，IgG-HRP二抗(Santacruz)室温孵育2小时，PBST清洗2遍，PBS清洗1遍，ECL发光检测，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶能够显著上调VE-钙粘素膜蛋白复合物蛋白的表达(如图19-b)；

[0159]细胞免疫荧光染色实验。具体如下：将3组不同改性水凝胶前液各100ul均匀加入到激光共聚焦皿中，37℃孵育10分钟，待形成稳定的水凝胶。每个皿种植hUC-MSC细胞3×104，细胞培养分化2周。吸掉培养基，PBS清洗，预热4％多聚甲醛室温固定10分钟，PBS清洗3次，1％BSA室温封闭1小时，加入一抗hVE-钙粘素(1:200，CST)及α-连环蛋白(1:200，CST)，4℃过夜，PBS清洗3次，每次5分钟，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(Sigma)室温封闭1小时，PBS清洗3次，DAPI染色细胞核10分钟，激光共聚焦显微镜检测，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶能够提高VE-钙粘素的表达，α-连环蛋白主要分布在细胞膜周围，相比较于对照及RGD改性水凝胶组(如图19-c)。

[0160]实施例16 hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶对hUC-MSC分化过程中分子机制探究

[0161]YAP蛋白免疫荧光染色实验，具体如下：将实施例12制备的3组不同改性水凝胶前液各100ul均匀加入到激光共聚焦皿中，37℃孵育10分钟，待形成稳定的水凝胶。每个皿种植hUC-MSC细胞3×104，细胞培养分化2周。吸掉培养基，PBS清洗，预热4％多聚甲醛室温固定10分钟，PBS清洗3次，1％BSA室温封闭1小时，加入一抗YAP(1:200，CST)，4℃过夜，PBS清洗3次，每次5分钟，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(Sigma)室温封闭1小时，PBS清洗3次，DAPI染色细胞核10分钟，激光共聚焦显微镜检测，结果表明，在hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶中，YAP蛋白主要分布于细胞质当中，而在对照组及RGD改性水凝胶组，YAP蛋白主要分布在细胞核中(图20-c)。蛋白印迹实验检测hUC-MSC细胞内通路蛋白表达，具体如下：准备实施例12制备的3种不同改性水凝胶前液各200ul，均匀加入到6孔板中待形成稳定水凝胶，每孔种植hUC-MSC 1×105，EBM-2培养基中分化2周时间。RIPA冰上裂解细胞30分钟，13000转/分钟离心10分钟，8％-10％分离胶对蛋白进行分离，然后湿转到PVDF膜，脱脂牛奶封闭1小时，分别加入一抗：抗-P-VEGFR2(1:2000,CST)，抗-P-YAP(1:2000,CST)，抗-P-AKT(1:2000,CST)，PI3K(1:2000,CST)，P-FAK(1:2000,CST)。4℃过夜，IgG-FITC二抗(Sigma)室温孵育2小时，PBST清洗2遍，PBS清洗1遍，ECL发光检测，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶能够显著上调P-VEGFR2，P-YAP，P-AKT，PI3K，P-FAK等蛋白的表达(图20-a，b)。

[0162]实施例17载有hUC-MSC的hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶体内血管新生

[0163]准备实施例12制备的对照、RGD、hVE-cad-Fc不同改性水凝胶前液各100ul，各组水凝胶样品中分别加入2×105hUC-MSC并与之混匀。然后皮下注射小鼠体内，原位形成水凝胶，分别于2周、4周取材，体式显微镜观察水凝胶在小鼠原位及取出之后的血管新生情况(图21-a，b，c)。切片染色观察水凝胶在体内的血管新生情况，具体如下：将取出的材料在4％多聚甲醛溶液中固定处理4小时，70％、80％、90％、100％酒精各脱水处理1小时，二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ透明处理各1小时，在60℃恒温箱中石蜡Ι、石蜡Ⅱ各透蜡处理1小时，样品包埋，石蜡切片机切片。H&E染色实验，60℃拷片直至石蜡融化完全，之后，石蜡切片经二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ脱蜡各5分钟，然后放入100％、95％、90％、80％、70％浓度酒精溶液中各5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。切片放入苏木精中染色3分钟，流水冲洗3分钟，将切片放入1％盐酸乙醇液中分化处理2秒，流水漂洗3分钟，伊红染色3分钟，流水漂洗3分钟，染色后，用浓度递增的酒精脱水各5秒，浓度梯度为70％、80％、90％、95％、100％。之后用二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ透明处理各5分钟。之后中性树脂封片，正置荧光显微镜观察，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶能够显著促进血管的新生(如图21-d)。

[0164]免疫荧光染色实验，60℃拷片直至石蜡融化完全，之后，石蜡切片经二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ脱蜡各5分钟，然后放入100％、95％、90％、80％、70％浓度酒精溶液中各5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。0.1％Triton-100室温破膜10分钟，之后抗原修复。PBS清洗3次，羊血清室温封闭45分钟，加入一抗：抗-CD31抗体，4℃湿盒过夜，湿盒复温1小时，PBS清洗5次，每次5分钟；加入IgG-FITC二抗(Sigma)，室温避光孵育2小时，PBS清洗5次，每次5分钟，DAPI细胞核染色；高级正置荧光显微镜观察。结果表明，在hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶中CD31蛋白大量表达，相比较于对照及RGD改性水凝胶组(图22-a，b)。

[0165]蛋白印迹实验检测体内CD31蛋白的表达情况，具体如下：将回收体内的水凝胶加入组织裂解液(索莱宝)，研磨充分，收集裂解液13000转/分钟，离心10分钟，收集上清液加入上样缓冲液煮沸5分钟，-20℃储存备用。用8％-10％凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，根据检测的蛋白加入一抗：抗-CD31，4℃过夜，PBST清洗膜，加入IgG-HRP二抗(Santacruz)，室温孵育2小时，PBST清洗膜，ECL发光检测蛋白表达。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白改性的水凝胶能够显著上调CD31蛋白表达，相较于对照及RGD组水凝胶(如图22-c)。

[0166]实施例18 hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对体内hUC-MSC存活能力影响研究

[0167]体内水凝胶中的hUC-MSC存活情况分析，对人细胞特异性表达蛋白Ku80进行了蛋白印迹实验及细胞免疫荧光染色实验。

[0168]具体如下：首先回收实施例17体内的水凝胶加入组织裂解液(索莱宝)，研磨充分，收集裂解液13000转/分钟，离心10分钟，收集上清液加入上样缓冲液煮沸5分钟，-20℃储存备用，8％-10％分离胶对蛋白进行分离，然后湿转到PVDF膜，脱脂牛奶封闭1小时，抗-Ku80(Abcam)一抗4℃过夜，IgG-HRP二抗(Santacruz)室温孵育2小时，PBST清洗2遍，PBS清洗1遍，ECL发光检测；结果表明hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶显著提高Ku80蛋白的表达(如图23-a)。

[0169]细胞免疫荧光染色，60℃拷片直至石蜡融化完全，之后，石蜡切片经二甲苯Ι、二甲苯Ⅱ脱蜡各5分钟，然后放入100％、95％、90％、80％、70％浓度酒精溶液中各5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。0.1％Triton-100室温破膜10分钟，之后抗原修复。PBS清洗3次，羊血清室温封闭45分钟，加入抗-Ku80一抗，4℃湿盒过夜，湿盒复温1小时，PBS清洗5次，每次5分钟；加入IgG-FITC二抗(Sigma)，室温避光孵育2小时，PBS清洗5次，每次5分钟，DAPI细胞核染色；高级正置荧光显微镜观察。结果表明，融合蛋白及联合功能化改性水凝胶能够显著促进hUC-MSC在体内的存活(如图23-b)。

[0170]实施例19 hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA血液相容性研究

[0171]PLGA支架(长春圣博玛生物材料有限公司)被剪成6*6*2mm立方体小块，浓缩血小板购于天津血液中心。首先，PLGA正方体小块分别浸泡在hVE-cad-Fc融合蛋白溶液(10ug/ml)及胶原溶液(5ug/ml)中，37℃孵育2小时后，每个PLGA小块表面分别均匀覆盖50ul浓缩血小板，室温孵育1小时。生理盐水洗去未结合的血小板，3.5％戊二醛4℃固定过夜，次日，用生理盐水清洗3次，接着分别用50％，60％，70％，80％，90％，100％的酒精脱水5分钟，晾干数小时后，表面喷金，扫描电子显微镜观察。结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA能够显著改善血液相容性(如图24)。

[0172]实施例20 hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA体内稳定性研究

[0173]PLGA支架被剪成6*6*2mm立方体小块，紫外灯下浸泡75％酒精数小时，PBS清洗。Cy7-NHS(Sigma)与hVE-cad-Fc融合蛋白以1:1摩尔比例配制成相应的溶液，透析2天，PLGA正方体小块浸泡在Cy7标记的hVE-cad-Fc溶液内，37℃孵育2小时，PBS清洗5次，Cy7标记的hVE-cad-Fc/PLGA支架皮下移植小鼠体内，不同时间点活体成像仪拍照观察，结果表明，hVE-cad-Fc融合蛋白能够较长时间内存在于体内。图25-a为水凝胶在小鼠体内的荧光成像图；图25-b为荧光信号强度统计图。

[0174]实施例21 hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性PLGA在体内血管新生研究PLGA支架被剪成6*6*2mm立方体小块，紫外灯下浸泡75％酒精数小时，PBS清洗。按照实施例19的方法，分别制备对照，胶原蛋白，hVE-钙粘素-Fc功能化改性PLGA，每组支架种植hUC-MSC细胞1×105，小鼠皮下埋植，分别在2周、4周时间取材。4％多聚甲醛溶液固定6小时，30％的蔗糖溶液4℃脱水过夜，OCT包埋，冷冻切片。H&E染色实验，流水冲洗样品5分钟除去包埋的OCT，苏木素染液染色3分钟30秒流水冲洗5分钟，盐酸乙醇溶液分化处理2秒，除去非特异性结合的苏木素染液，流水冲洗5分钟，伊红染液染色约90秒后流水冲洗5分钟，70％，80％，90％，95％，100％梯度酒精脱水后晾干，二甲苯透明两次，每次5分钟，封片保存，高级正置显微镜观察。结果表明，hVE-钙粘素-Fc功能化改性PLGA支架能够促进体内血管新生(如图26-a)。

[0175]CD31及vWF免疫荧光染色实验，-20℃冷丙酮固定对照组，胶原蛋白改性PLGA，hVE-钙粘素-Fc改性PLGA样品10分钟。PBS冲洗样品2次，山羊血清室温封闭40分钟，抗人CD31，抗鼠vWF(Abcam)一抗4℃孵育过夜，PBS清洗5次。加入IgG-FITC标记二抗(Sigma)，室温孵育2小时，PBS清洗5次，含DAPI甘油封片，高级正置荧光显微镜观察。结果表明，hVE-钙粘素-Fc功能化改性PLGA能够显著促进小鼠vWF的表达(如图26-b)。同时能够显著促进hUC-MSC中CD-31蛋白的表达(如图26-c)。

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