1.一种溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，其特征在于：是以碲化镉量子点为载体，溶菌酶(N-乙酰胞壁质聚糖水解酶)为模板分子，结合分子印迹技术的选择性和量子点的荧光特性合成的纳米荧光探针，包括如下步骤：

1)将碲粉(Te)、NaBH4与蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应制得NaHTe溶液，将制得的NaHTe溶液快速加入到巯基丙酸(MPA)的CdCl2溶液中，用NaOH水溶液调节溶液的pH为9.0，然后沸水浴加热所述溶液2h，即可制得碲化镉量子点溶液；

2)将牛血清白蛋白溶于蒸馏水中，加入硼氢化钠，搅拌1小时，然后在70℃水浴中加热30分钟，得到变性牛血清白蛋白(dBSA)溶液，将dBSA溶液加入到碲化镉量子点溶液中，磁力搅拌24小时，得到dBSA包覆的量子点溶液；

3)在dBSA包覆的量子点溶液中依次加入模板分子溶菌酶、功能单体3-氨丙基三乙氧基丙烷、交联剂正硅酸乙酯和氨水，室温下磁力搅拌12小时，通过溶胶凝胶水解聚合反应在量子点形成分子印迹层，即为探针；

4)用十二烷基硫酸钠水溶液与探针混合，振荡20-60分钟，离心去除上清液，重新用上述十二烷基硫酸钠溶液洗涤，重复此过程，直到用紫外分光光度计检测模板分子洗净为止，即可制得溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针。

2.根据权利要求1所述溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，其特征在于：所述NaBH4与蒸馏水的用量比为45.5mg/mL，Te与NaBH4的摩尔比为1∶19；所述MPA的CdCl2溶液中MPA与CdCl2的用量摩尔比为2.4∶1，Te2-与MPA的摩尔比为1∶4.8。

3.根据权利要求1所述溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，其特征在于：所述调节溶液pH的NaOH水溶液的浓度为1.0mol/L。

4.根据权利要求1所述溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，其特征在于：所述牛血清白蛋白与蒸馏水的用量比为20-40mg/mL；牛血清白蛋白与硼氢化钠的质量比为100∶2-4，变性的牛血清白蛋白溶液与碲化镉量子点溶液的体积比为1∶10。

5.根据权利要求1所述溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，其特征在于：所述氨水质量百分比浓度为25％，dBSA包覆的量子点溶液、溶菌酶、3-氨丙基三乙氧基丙烷、正硅酸乙酯与氨水的用量比为5mL∶10mg∶60μL∶100μL∶100μL。

6.根据权利要求1所述溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，其特征在于：所述十二烷基硫酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.5％，十二烷基硫酸钠水溶液与探针混合的用量比为1ml/1mg。

技术领域

[0001]本发明涉及量子点荧光探针的制备技术，特别是一种溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法。

背景技术

[0002]量子点（quantum dots，QD）是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的、能够接受激发光产生荧光的半导体纳米晶粒。量子点具有激发光谱宽且连续、发射光谱窄且对称、发射波长可调、荧光量子产率高、光化学稳定性好等优越的荧光特性。近年来，量子点（半导体纳米粒子）在生物、医学领域的应用，极大的拓展了量子点研究的深度和广度，成为生物、医学领域最有生命力的发展方向之一。而且，量子点作为荧光探针在生物、医学方面的研究中发挥巨大作用（M.Bruchez Jr.,M.Moronne,P.Gin,S.Weiss,A.P.Alivisatos,Science,1998,281(5385):2013-2016;W.C.W.Chan,S.Nie,Science,1998,281(5385):2016-2018）。由于理想的荧光探针必须能够与相应的目标分析物发生特异性的结合。因此发展对目标分析物具有特异性识别能力的荧光探针是主要研究内容之一。选择合适的天然抗体对量子点进行标记，可以实现对目标物的分析。但由于天然抗体价格昂贵、提取过程繁琐，而且稳定差，因此发展人工抗体技术（分子印迹技术）是解决这一问题的途径之一。

[0003]分子印迹（又称分子模板或分子烙印）技术是指制备对目标分子具有特异性识别能力的聚合物的技术（G.Valtakis,L.I.Andersson,R.Muller,K.Mosbach,Nature,1993,361(6413):645-647;G.Wulff,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34(17):1812-1832）。由于印迹聚合物中空腔的空间结构以及空穴中功能基团的种类、数量和位点均与目标分子高度互补，因而它对目标分子的立体结构具有记忆功能。

[0004]基于分子印迹技术的量子点荧光探针的制备技术，则将分子印迹技术应用于量子点荧光探针的制备，目前，已被成功地应用于小分子的识别分析（C.I.Lin,A.K.Joseph,C.K.Chang,Y.D.Lee,J.Chromatogr.A,2004,1027(1-2):259-262;C.I.Lin,A.K.Joseph,C.K.Chang,Y.D.Lee,Biosens.Bioelectron.,2004,20(1):127-131;H.-F.Wang,Y.He,T.-R.Ji,X.-P.Yan,Anal.Chem.,2009,81(4):1615-1621）。将量子点和蛋白质分子印迹联合，结合分子印迹技术的高选择性与量子点荧光检测技术的高灵敏性，制备蛋白质分子印迹-量子点荧光探针可以应用于目标蛋白的选择性识别及测定。

发明内容

[0005]本发明的目的在于针对上述技术分析，提供一种溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，该量子点纳米荧光探针，对模板分子的识别具有有较高的选择性和灵敏性；且合成方法过程简单，不同批次间重现性较好，在实际样品中溶菌酶的选择性识别和检测中有着良好的应用前景。

[0006]本发明的技术方案：

[0007]一种溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，是以碲化镉量子点为载体，溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）为模板分子，结合分子印迹技术的选择性和量子点的荧光特性合成的纳米荧光探针，包括如下步骤：

[0008]1）将碲粉（Te）、NaBH4与蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应制得NaHTe溶液，将制得的NaHTe溶液快速加入到巯基丙酸（MPA）的CdCl2溶液中，用NaOH水溶液调节溶液的pH为9.0，然后沸水浴加热所述溶液2h，即可制得碲化镉量子点溶液；

[0009]2）将牛血清白蛋白溶于蒸馏水中，加入硼氢化钠，搅拌一个小时，然后在70℃水浴中加热30分钟，得到变性的牛血清白蛋白（dBSA）溶液，将变性的牛血清白蛋白溶液加入到碲化镉量子点溶液中，磁力搅拌24小时，得到dBSA包覆的量子点溶液；

[0010]3）在dBSA包覆的量子点溶液中依次加入模板分子溶菌酶、功能单体3-氨丙基三乙氧基丙烷、交联剂正硅酸乙酯和氨水，室温下磁力搅拌12小时，通过溶胶凝胶水解聚合反应在量子点形成分子印迹层，即为探针；

[0011]4）用十二烷基硫酸钠水溶液与探针混合，振荡20-60分钟，离心去除上清液，重新用上述十二烷基硫酸钠溶液洗涤，重复此过程，直到用紫外分光光度计检测模板分子洗净为止，即可制得溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针。

[0012]所述NaBH4与蒸馏水的用量比为45.5mg/mL，Te与NaBH4的摩尔比为1:19；所述MPA的CdCl2溶液中MPA与CdCl2的用量摩尔比为2.4:1，Te2-与MPA的摩尔比为1:4.8。

[0013]所述调节溶液pH的NaOH水溶液的浓度为1.0mol/L。

[0014]所述牛血清白蛋白与蒸馏水的用量比为20-40mg/mL；牛血清白蛋白与硼氢化钠的质量比为100：2-4，变性的牛血清白蛋白溶液与碲化镉量子点溶液的体积比为1：10。

[0015]所述氨水质量百分比浓度为25%，dBSA包覆的量子点溶液、溶菌酶、3-氨丙基三乙氧基丙烷、正硅酸乙酯与氨水的用量比为5mL：10mg：60μL：100μL：100μL。

[0016]所述十二烷基硫酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.5%，十二烷基硫酸钠水溶液与探针混合的用量比为1ml/1mg。

[0017]本发明的优点和积极效果：本发明制备的溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针，与传统合成分子印迹聚合物的方法相比，有以下优点：

[0018]1）以量子点为载体，在其表面修饰分子印迹层，结合了分子印迹的高选择性和量子点荧光检测的高灵敏性；

[0019]2）采用表面印迹的方式合成的纳米粒子比表面积大，识别位点接近表面，易于选择性识别模板分子；

[0020]3）不但可以用于目标蛋白的选择性识别、富集，而且可以用于实际样品中目标蛋白的测定，其性能优于传统的分子印迹聚合物。

附图说明

[0021]图1是该溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的透射电镜图。

[0022]图2是该溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针对模板分子溶菌酶的识别性能的荧光表征。

[0023]图3是非印迹纳米粒子（参比）对模板分子溶菌酶的识别性能的荧光表征。

具体实施方式

[0024]实施例：

[0025]一种溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的制备方法，是以碲化镉量子点为载体，溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）为模板分子（本专利用的溶菌酶是购买于Sigma-Aldrich公司），结合分子印迹技术的选择性和量子点的荧光特性合成的纳米荧光探针，包括如下步骤：

[0026]1）将0.064g碲粉（Te）、0.36g NaBH4与8mL蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应制得NaHTe溶液，将制得的NaHTe溶液快速加入到巯基丙酸（MPA）的CdCl2溶液中，该CdCl2溶液的制备用料是12.5mL氯化镉、53μL巯基丙酸和180mL蒸馏水，然后用浓度为1.0mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH为9.0，然后沸水浴加热所述溶液2小时，即可制得碲化镉量子点溶液；

[0027]2）将260mg牛血清白蛋白溶于10mL蒸馏水中，加入6.8mg硼氢化钠，搅拌一个小时，然后在70℃的水浴中加热30min，得到变性的牛血清白蛋白（dBSA）溶液，将1mL变性的牛血清白蛋白加入到10mL碲化镉量子点溶液中，磁力搅拌24小时，得到dBSA包覆的量子点溶液；

[0028]3）在5mL dBSA包覆的量子点溶液中依次加入10mg模板分子溶菌酶、60μL功能单体3-氨丙基三乙氧基丙烷、100μL交联剂正硅酸乙酯和100μL质量百分比浓度为25%的氨水，室温下磁力搅拌12小时，通过溶胶凝胶水解聚合反应在量子点形成分子印迹层，即为探针；

[0029]4）用质量百分比浓度为0.5%的十二烷基硫酸钠水溶液与上述探针混合，十二烷基硫酸钠水溶液与探针混合的用量比为1ml/1mg，振荡20-60分钟，离心去除上清液，重新用上述十二烷基硫酸钠溶液洗涤，重复此过程，直到用紫外分光光度计检测模板分子洗净为止，即可制得溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针。

[0030]溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针对模板分子溶菌酶的识别性能：

[0031]称取溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针和参照物各2份，每份20mg，分别置于2个离心管中，然后分别加入20mL缓冲溶液，超声10min，使纳米粒子均匀分散在缓冲溶液中，分别移取一定体积的探针和参照物溶液于不同的离心管中，然后加入不同浓度的蛋白质溶液，用荧光分光光度计来测定探针及参照物与模板分子的响应（荧光分光光度计：日立，日本，F-4500型；激发和发射都是5nm，激发波长设定在400nm，在430-700范围内记录实验数据，光电管的电压为950V）。

[0032]图1是该溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针的透射电镜图。图中显示：该方法制备的纳米粒子的尺寸在50-80nm，具有一定的分散性。

[0033]图2是该溶菌酶分子印迹-量子点纳米荧光探针对模板分子溶菌酶的识别性能的荧光表征。通过比较直线的斜率（探针的斜率与参比的斜率之比），可以说明纳米粒子的识别行为。

[0034]图3是非印迹纳米粒子（参比）对模板分子溶菌酶的识别性能的荧光表征。通过比较印迹纳米探针和非印迹纳米粒子（参比）对模板分子的荧光变化，可以看出，对相同浓度的模板分子，印迹纳米粒子的荧光响应大，说明了探针具有良好的识别行为。