1.一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂的制备方法，其特征在于所述的固化吸附菌剂的制备过程是：

第1、将保藏号为CGMCC No.6104的红平红球菌（Rhodococcuserythropolis）T7-3；保藏号为ATCC 23344的伯克霍尔德菌（Burkholderia mallei）；保藏号为ATCC 19194的不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus）；以及保藏号为ATCC15692的假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA01分别经斜面培养、摇瓶种子发酵和发酵罐级联放大，最终均得到浓度为108~1010个/mL的发酵液；

第2、将第1步得到的各菌液按体积比等比例混合；

第3、向第2步的混合菌液中添加100~1000g/L的沸石或陶粒，充分混合；

第4、向第3步的混合物中添加絮凝剂1~2g/L，所述的絮凝剂为硫酸铝钾，充分混合，混合后静置0.5~24h，制得菌体吸附率≥90%的固化吸附菌剂。

2.一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂，其特征在于所述的固化吸附菌剂由权利要求1所述的方法制得。

3.权利要求2所述的固化吸附菌剂在海洋滩涂或海底沉积物环境石油污染的生物修复中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于按1~2kg/m2修复面积加入所述固化吸附菌剂，按0.2~1kg/m2修复面积添加硫酸铵或磷酸氢二钠。

技术领域

[0001]本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体说，涉及一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染修复的微生物固化吸附菌剂制备方法，及其在海洋滩涂和海底沉积物石油污染生物修复中的应用。

背景技术

[0002]随着海上石油开发和油轮事故的频发，海上石油污染日益严重，直接影响了海洋养殖和捕捞业的发展。海上溢油不仅直接造成污染危害，而且因无法完全清除，一些残余油在自然条件下很难降解，有毒、有害成分具有积累性，因而对海洋生态造成长期的损害。2005年国家监测结果显示，渤海海域，特别是黄河口和莱州湾生态监控区，石油污染仍较严重，海洋生物种类和数量减少，产卵场严重退化，造成这种现象的因素很多，其中烃类污染的加剧不容忽视。因此，在大力发展海上石油开采和运输的同时，必须看到石油污染事件逐石油污染的技术研究刻不容缓。尤其是2010年7月16日在大连发生的溢油事故，及后来在山东蓬莱发生的溢油事故后，海洋年增多的事实，开展减少或消除海洋石油污染的治理日益受到政府的高度重视。

[0003]溢油事故发生后，经物理方法（如机械回收等）可清除部分表面溢油，剩余的溢油在风、浪、流的作用下，会漂移至滩涂，密度较大的会沉入海底。石油中难降解的芳烃组分（致癌物质）长期滞留在滩涂土壤和海底沉积物环境中，对海洋生态系统及人体健康造成巨大的持久性损害。

[0004]微生物治理技术是国际上公认的高效修复石油污染的新技术，是指利用微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程。微生物能适应各种复杂的生态环境，其繁殖代谢能力极强，能快速降解石油中各种有毒物质，而且具有价格低廉、自然环保、二次污染少、对人畜无害等诸多优势，已经成为现场去除溢油污染修复的重要选择途径。采用该技术处理物理方法无法清除的溢油是恢复生态环境的最佳途径，已受到各国政府、科学家和企业家的高度重视。发展和推广微生物治理技术适合我国的国情，对保护我国海洋生态环境，维持海洋资源的可持续性发展具有重大的科学意义和应用价值。

[0005]在海洋石油污染生物修复处理的过程中，经常会用到低温耐盐的烃降解菌株，它们以自己的方式摄取烃类，然后参与自身代谢，最终生成小分子有机酸或气体。针对生物添加法的研究有两个发展趋势：一是针对微生物降解能力不足的生态系统，加入外源微生物做补充；二是针对土著微生物不能降解的原油类型或重要的石油成分，选择或改造优良性能的降解微生物。美国政府资助的“自然与加速生物治理研究项目”力图通过现代分子生物学手段，在阐明污染物代谢机理的基础上发展适宜的分子调控手段，以降低生物修复过程中降解菌的营养添加量和生物累积量；也有学者以铜绿假单胞菌作为受体，将恶臭假单胞菌等携带的各种质粒转入其中，构成了带有多种质粒的“超级嗜油工程菌”，用于海上溢油处理，其清除油污的能力比野生菌高几十倍到几百倍。国内也有学者利用混合菌协同作用加强石油烃的降解效果，王加宁等人公开了一种降解石油污染物及石油产品的固体微生物混合菌剂及其制备方法（公开号：CN101050435A），可应用于石油污染土壤及石油产品泄露等突发事故应急处理的生物修复技术中，其中，微生物菌剂是由枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇单胞菌混合发酵制成。朱生凤等人公开了溢油污染海岸线生物修复用菌剂及制备方法（公开号：CN101717725A），利用硅藻土、高岭土、草炭和甲壳质等至少一种固定化载体包埋短小芽孢杆菌、威尼斯不动杆菌、门多萨假单胞菌和皮氏罗尔斯通菌等微生物菌剂，以提高溢油污染海岸线生物降解效果。这些发明可以提高石油污染的生物修复效率，也可以应用在浅海修复作业区，但是由于菌剂的密度较小，不能应用于海底沉积物的修复区域，因此限制了其应用范围。

[0006]加快国内生物修复技术的发展，符合我国海洋环境保护发展的需要，加强低温耐盐烃降解菌、微生物降解机理、缓释营养剂和更多疏水固定化载体的研究，有利于海洋溢油生物修复技术的发展和工业化应用。海洋滩涂石油污染的生物修复具有很好的发展前景。

发明内容

[0007]本发明目的是解决现有微生物修复方法是使用的修复菌剂存在菌剂密度较小，不能应用于海底沉积物的修复区域等，因此限制了菌剂应用范围的问题，提供一种适用于海洋滩涂和海底沉积物等海洋环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂制备方法，及其在海洋滩涂和海底沉积物等海洋环境石油污染的生物修复中的应用。

[0008]本发明提供的适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂，是由菌浓为108~1010个/mL的适合降解目标油品的微生物发酵菌液中加入100~1000g/L多孔介质和1~2g/L絮凝剂，充分混合制成。

[0009]所述的微生物包括：红球菌（Rhodococcus erythoropolis T7-3，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No.6104，以下简称T7-3），或伯克霍尔德菌（Burkholderia mallei ATCC23344，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC23344，以下简称ATCC23344），或不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus ATCC19194，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC19194，以下简称ATCC19194），或芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ATCC14580，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC14580，以下简称ATCC14580），或假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa PA01，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC15692，以下简称ATCC15692），或这些菌的等比例混合物（以下简称混合菌）。

[0010]所述的多孔介质为沸石或陶粒。

[0011]本发明同时提供了一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂制备方法，具体过程是：

[0012]第1、选取适合降解污染区域原油的微生物菌种（具体微生物如前所述）；

[0013]第2、经斜面培养、摇瓶种子发酵和发酵罐级联放大获得菌浓为108~1010个/mL的发酵菌液；

[0014]第3、向第2步的发酵菌液中添加100~1000g/L多孔介质，充分混合；所述的多孔介质为沸石或陶粒；

[0015]第4、向第3步的混合物中添加絮凝剂1~2g/L，充分混合，混合后静置0.5~24h，制得菌体吸附率≥90%的固化吸附菌剂。

[0016]本发明还提供了以上所述固化吸附菌剂在海洋滩涂或海底沉积物环境石油污染的生物修复中的应用。具体应用过程是，按1~2kg/m2修复面积加入所述固化吸附菌剂，按0.2~1kg/m2修复面积添加营养盐肥料。所述营养盐肥料为硫酸氨或磷酸氢二钠。

[0017]本发明固化吸附菌剂在室内模拟、滩涂和海底现场条件下均有利于长期持菌，并降解石油烃，因此可用于滩涂和海底现场石油污染的生物修复领域。

[0018]本发明的优点和积极效果：

[0019]本发明提供一种利用沸石或陶粒吸附石油烃高效降解菌剂及其营养剂的方法，能将石油烃高效降解菌及其营养携带到海底沉积物中，并能延长石油烃高效降解菌及其营养剂在滩涂的滞留时间，明显提高目标菌在目标地点的存活率，扩大了修复菌剂的应用范围，因此具有海洋滩涂和海底沉积物石油污染生物修复能力。

附图说明

[0020]图1是烃降解菌对原油的降解率随时间变化曲线图。

[0021]图2是固体材料吸附前后上清液残留微生物效果比较图（A为未吸附的发酵液上清100μl涂平板效果，B为吸附后的发酵液上清100μl涂平板效果）。

[0022]图3是固体材料吸附前后发酵液外观图（A为吸附后的发酵液，B为未吸附的发酵液）。

[0023]图4是固体材料吸附前后扫描电镜（SEM）图（A为吸附前的材料多孔介质内部，B为吸附后的材料多孔介质内部）。

[0024]图5是室内模拟实验沉积物中细菌总数变化曲线图。

[0025]图6是室内模拟实验沉积物中烃降解菌总数变化曲线图。

[0026]图7是室内模拟实验的石油烃降解曲线图。

[0027]图8是滩涂现场实验沉积物中总石油烃变化曲线图。

[0028]图9是滩涂现场实验沉积物中总菌数变化曲线图。

[0029]图10是滩涂现场实验沉积物中烃降解菌的变化曲线图。

[0030]图11是滩涂现场试验沉积物中总石油烃60天降解率直方图。

具体实施方式

[0031]实施例1、红球菌T7-3固化吸附菌剂的制备方法

[0032]1、降解菌种的筛选

[0033]以污染地域收集原油（本实施例暂以海二站混合原油为例，以下简称原油），以2%的质量体积比加入到无机盐培养基（KH2PO43.48g/L，Na2HPO41.5g/L，MgSO40.70g/L，(NH4)2SO44g/L，NaCl20g/L，酵母粉0.05g/L，pH7.0~7.2）中，形成原油无机盐培养基，121℃灭菌20min，筛选对原油降解性能好的菌种，培养条件为25℃，150r/min，接种量2%，培养时间为7d。

[0034]本实施例从30种待选菌株中选择红球菌（Rhodococcus erythoropolis）T7-3，（已于2012年5月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No.6104，建议分类命名为红平红球菌（Rhodococcus erythoropolis）以下简称T7-3）。接种至以灭菌的原油无机盐培养基，测定了菌种在降解过程中的原油降解率，其中：原油降解率%=（降解前原油含量—降解后原油含量）/降解前原油浓度×100%，原油含量测定参照国标GB17378.4-2007法测定。结果见图1所示。从图中可以看出，T7-3对原油的降解率为75%。

[0035]2、菌种的扩大培养

[0036]本发明的菌种扩大培养方法经过平板分纯，斜面培养、摇瓶种子培养和发酵罐培养四个步骤，最终菌体细胞密度达到2×108个/mL以上。下面选择的是发明内容中所述微生物中的一种，并不限制本发明。

[0037]1）、平板分纯

[0038]将菌种T7-3以灭菌接种环挑取单菌落接种到1号固体培养基平板上，反复划线，25℃下培养72h后，观察有无杂菌，以验证目标菌的纯度。

[0039]其中，1号固体培养基平板制备方法如下：分别称取5.0g蛋白胨，1.0g酵母粉，依次搅拌溶解于1000mL陈化海水中，然后称取18g琼脂粉，煮沸溶解后，调pH7.6~7.8，于121℃下灭菌20min后降至50℃，以每20mL倒入并平铺于培养皿（d=10cm）底部，冷却后得到固体培养基平板。

[0040]2）、斜面培养

[0041]将上述平板上验证正确的单菌落以灭菌接种环挑取一环，接种到1号固体培养基斜面上，反复划线，25℃下培养72h后，备用。

[0042]其中，1号固体培养基斜面制备方法如下：分别称取5.0g蛋白胨，1.0g酵母粉，依次搅拌溶解于1000mL陈化海水中，然后称取18g琼脂粉，煮沸溶解后，调pH7.6~7.8，于121℃下灭菌20min后降至50℃，以每5mL分装于180mm×18mm（长×直径）试管中，10°-20°倾斜室温放置，冷却后得到固体培养基斜面。

[0043]3）、摇瓶种子培养

[0044]将上述斜面上的菌种，在超净工作台上无菌操作接种到装有200mL的1号液体培养基的500mL锥形瓶中，25℃,200r/min培养到细胞密度刚达到5×108个/mL即停止培养，备用。

[0045]其中1号液体培养基制备方法如下：分别称取5.0g蛋白胨，1.0g酵母粉，依次搅拌溶解于1000mL陈化海水中，每200mL分装到500mL锥形瓶中，于121℃下灭菌20min。

[0046]4）、发酵罐培养

[0047]将上述种子液培养液以3-5%的接种量分别在装有40~60%液量已灭菌发酵培养基的发酵罐中逐级放大发酵培养。发酵过程中，控制pH为7.2，培养温度为25℃，转速为600r/min，通气量为1.0~2.0L/min，培养60h至菌体细胞密度达到2×108个/mL以上。

[0048]上述发酵培养基的制备方法如下：分别称取30.0g葡萄糖、80.0g液体石蜡、4.0g磷酸二氢钾、6.0g磷酸氢二钾、10.0g硫酸铵、25.0g氯化钠、0.2g硫酸镁、0.01g氯化钙、0.005g生物素依次添加到1000mL的蒸馏水中，搅拌溶解后调pH至7.2，于115℃灭菌15min。

[0049]3、固化吸附菌剂的吸附

[0050]下面公开的是菌种T7-3与固体材料以几种不同比例的制备过程，并不限制本发明。

[0051]将T7-3种子液与沸石（或陶粒）以表1所列的比例进行吸附实验，其中1-9组加固体吸附介质后搅拌2min再静止1.5h，吸附后的体系取上清液100μl稀释涂营养琼脂平板计算剩余菌浓（cfu1），并以初始种子液中的菌浓（cfu2）作对照，计算沸石吸附的菌体量（cfu3）和吸附率（%）（见图2），其中吸附率的计算方法如下：cfu3=cfu2-cfu1，吸附率%=cfu3/cfu2×100%。以第3组实验形成的菌剂3号为例，沸石吸附前T7-3菌体浓度为9×108CFU/mL，吸附后菌体浓度为1.9×108CFU/mL，吸附率达到78.9%，平均每g沸石吸附1.8×109CFU菌体。

[0052]表1多孔介质对T7-3菌体细胞的吸附作用

[0053]组别 菌号 菌液ml 沸石g 陶粒g 硫酸铝钾g 吸附率％ 菌材比 1 T7-3 25 2.5 / / 35.3 10∶1 2 T7-3 25 7.5 / / 59.1 10∶3 3 T7-3 25 12.5 / / 78.9 2∶1 4 T7-3 25 15 / / 76.7 5∶3 5 T7-3 25 17.5 / / 84.5 10∶7 6 T7-3 25 20 / / 88.7 5∶4 7 T7-3 25 25 / / 91.2 1∶1 8 T7-3 25 / 15 / 92.2 5∶3 9 T7-3 25 / 20 / 85.5 5∶4

[0054]由表1可以看出，以25ml菌液为例，材料加入量2.5g，即质量体积比100g/L时，对应菌材比为10:1；材料加入量12.5g，即质量体积比500g/L时，对应菌材比为2:1，以此类推。可见材料加入量在100~1000g/L的时候多孔介质对菌体细胞均有一定的吸附作用。加入材料500g/L以上，菌体吸附率就可达到75%以上，固体材料吸附前后发酵液外观图见图3所示，说明沸石或陶粒等固体材料对菌体吸附效率较高，可以应用于固体菌剂的制备。对空白沸石和吸附后的固体微生物菌剂样品进行扫描电镜（SEM）检测，如图4所示，可以明显看到吸附在沸石上的菌体，并且菌体密度较大，说明使用沸石作为载体进行菌体吸附制备固体微生物菌剂是可行的。

[0055]实施例2、伯克霍尔德菌ATCC23344固化吸附菌剂的制备方法

[0056]1、降解菌种的筛选

[0057]以污染地域收集原油（本实施例暂以海二站混合原油为例，以下简称原油），以2%的质量体积比加入到无机盐培养基（KH2PO43.48g/L，Na2HPO41.5g/L，MgSO40.70g/L，(NH4)2SO44g/L，NaCl20g/L，酵母粉0.05g/L，pH7.0~7.2）中，筛选对原油降解性能好的菌种，培养条件为25℃，150r/min，接种量2%，培养时间为7d。

[0058]本实施例从30种待选菌株中选择伯克霍尔德菌（Burkholderia malleiATCC23344，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC23344，以下简称ATCC23344)，接种至以未接菌的原油无机盐培养基，测定了菌种在降解过程中的原油降解率，其中：原油降解率%=（降解前原油含量—降解后原油含量）/降解前原油浓度×100%，原油含量测定参照国标GB17378.4-2007法测定。结果见图1所示。从图中可以看出，ATCC23344对原油的降解率为68%。

[0059]2、菌种的扩大培养

[0060]同实施例1的第二步。

[0061]3、固化吸附菌剂的吸附

[0062]下面公开的是菌种ATCC23344与固体材料以几种不同比例的制备过程，并不限制本发明。

[0063]将ATCC23344种子液与固体吸附介质沸石（或陶粒）以表2所列的比例进行吸附实验，加固体吸附介质后搅拌2min再静止1.5h，吸附后的体系取上清液100μl稀释涂营养琼脂平板计算剩余菌浓（cfu1），并以初始种子液中的菌浓（cfu2）作对照，计算沸石吸附的菌体量（cfu3）和吸附率（%），其中吸附率的计算方法如下：cfu3=cfu2-cfu1，吸附率%=cfu3/cfu2×100%。以第14组实验形成的菌剂14号为例，吸附率达到86.7%。

[0064]表2多孔介质对ATCC23344菌体细胞的吸附作用

[0065]组别 菌号 菌液ml 沸石g 陶粒g 硫酸铝钾g 吸附率％ 菌材比 11 ATCC19194 25 2.5 / / 76.8 10∶1 12 ATCC15692 25 7.5 / / 79.5 10∶3 13 ATCC23344 25 12.5 / / 83.2 2∶1 14 ATCC23344 25 15 / / 86.7 5∶3 15 ATCC23344 25 17.5 / / 85.9 10∶7 16 ATCC23344 25 20 / / 89.7 5∶4 17 ATCC23344 25 25 / / 92.2 1∶1 18 ATCC23344 25 / 15 / 93.2 5∶3 19 ATCC23344 25 / 20 / 95.5 5∶4

[0066]由表2可以看出，材料加入量在100～1000g/L的时候多孔介质对菌体细胞有75%以上的吸附作用。加入材料500g/L以上，菌体吸附率就可达到80%以上。

[0067]实施例3、不动杆菌ATCC19194固化吸附菌剂的制备方法

[0068]1、降解菌种的筛选

[0069]以污染地域收集原油（本实施例暂以海二站混合原油为例，以下简称原油），以2%的质量体积比加入到无机盐培养基（KH2PO4 3.48 g/L，Na2HPO41.5g/L，MgSO40.70g/L，(NH4)2SO44g/L，NaCl20g/L，酵母粉0.05g/L，pH7.0~7.2）中，筛选对原油降解性能好的菌种，培养条件为25℃，150r/min，接种量2%，培养时间为7d。

[0070]本实施例从30种待选菌株中选择不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus ATCC 19194，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC19194，以下简称ATCC 19194），接种至以未接菌的原油无机盐培养基，测定了菌种在降解过程中的原油降解率，其中：原油降解率%=（降解前原油含量—降解后原油含量）/降解前原油浓度×100%，原油含量测定参照国标GB17378.4-2007法测定。结果见图1所示。从图中可以看出，ATCC19194对原油的降解率为63%。

[0071]2、菌种的扩大培养

[0072]同实施例1的第二步。

[0073]3、固化吸附菌剂的吸附

[0074]下面公开的是菌种ATCC19194与固体材料以几种不同比例的制备过程，并不限制本发明。

[0075]将ATCC19194种子液与沸石（或陶粒）以表3所列的比例进行吸附实验，加固体吸附介质后搅拌2min再静止1.5h，吸附后的体系取上清液100μl稀释涂营养琼脂平板计算剩余菌浓（cfu1），并以初始种子液中的菌浓（cfu2）作对照，计算沸石吸附的菌体量（cfu3）和吸附率（%），其中吸附率的计算方法如下：cfu3=cfu2-cfu1，吸附率%=cfu3/cfu2×100%。以第25组实验形成的菌剂25号为例，吸附率达到88.5%。

[0076]表3多孔介质对ATCC19194菌体细胞的吸附作用

[0077]组别 菌号 菌液ml 沸石g 陶粒g 硫酸铝钾g 吸附率％ 菌材比 21 ATCC19194 25 2.5 / / 63.2 10∶1 22 ATCC19194 25 7.5 / / 74.8 10∶3 23 ATCC19194 25 12.5 / / 79.8 2∶1 24 ATCC19194 25 15 / / 86.7 5∶3 25 ATCC19194 25 17.5 / / 88.5 10∶7 26 ATCC19194 25 20 / / 89.7 5∶4 27 ATCC19194 25 25 / / 91.2 1∶1 28 ATCC19194 25 / 15 / 88.2 5∶3 29 ATCC19194 25 / 20 / 89.5 5∶4

[0078]由表3可以看出，材料加入量在100~1000g/L的时候，多孔介质对菌体细胞有60%以上的吸附作用。加入材料500g/L以上，菌体吸附率就可达到80%以上。

[0079]实施例4、假单胞菌ATCC15692固化吸附菌剂的制备方法

[0080]1、降解菌种的筛选

[0081]以污染地域收集原油（本实施例暂以海二站混合原油为例，以下简称原油），以2%的质量体积比加入到无机盐培养基（KH2PO4 3.48 g/L，Na2HPO4 1.5 g/L，MgSO4 0.70 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L，NaCl 20g/L，酵母粉0.05 g/L，pH 7.0~7.2）中，筛选对原油降解性能好的菌种，培养条件为25℃，150r/min，接种量2%，培养时间为7d。

[0082]本实施例从30种待选菌株中选择假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa PA01，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC15692，以下简称ATCC 15692），接种至以未接菌的原油无机盐培养基，测定了菌种在降解过程中的原油降解率，其中：原油降解率%=（降解前原油含量—降解后原油含量）/降解前原油浓度×100%，原油含量测定参照国标GB17378.4-2007法测定。结果见图1所示。从图中可以看出，ATCC15692对原油的降解率为56%。

[0083]2、菌种的扩大培养

[0084]同实施例1的第二步。

[0085]3、固化吸附菌剂的吸附

[0086]下面公开的是菌种ATCC15692与固体材料以几种不同比例的制备过程，并不限制本发明。

[0087]将ATCC15692种子液与沸石（或陶粒）以表4所列的比例进行吸附实验，加固体吸附介质后搅拌2min再静止1.5h，吸附后的体系取上清液100μl稀释涂营养琼脂平板计算剩余菌浓（cfu1），并以初始种子液中的菌浓（cfu2）作对照，计算沸石吸附的菌体量（cfu3）和吸附率（%），其中吸附率的计算方法如下：cfu3=cfu2-cfu1，吸附率%=cfu3/cfu2×100%。以第35组实验形成的菌剂35号为例，吸附率达到82.5%。

[0088]表4多孔介质对ATCC15692菌体细胞的吸附作用

[0089]组别 菌号 菌液ml 沸石g 陶粒g 硫酸铝钾g 吸附率％ 菌材比 31 ATCC15692 25 2.5 / / 65.2 10∶1 32 ATCC15692 25 7.5 / / 68.8 10∶3 33 ATCC15692 25 12.5 / / 76.5 2∶1 34 ATCC15692 25 15 / / 76.7 5∶3 35 ATCC15692 25 17.5 / / 82.5 10∶7 36 ATCC15692 25 20 / / 85.7 5∶4 37 ATCC15692 25 25 / / 89.2 1∶1 38 ATCC15692 25 / 15 / 87.2 5∶3 39 ATCC15692 25 / 20 / 88.5 5∶4

[0090]由表4可以看出，材料加入量在100~1000g/L的时候，多孔介质对菌体细胞有65%以上的吸附作用。加入材料500g/L以上，菌体吸附率就可达到75%以上。

[0091]实施例5、混合菌固化吸附菌剂的制备方法

[0092]1、降解菌种的筛选

[0093]以污染地域收集原油（本实施例暂以海二站混合原油为例，以下简称原油），以2%的质量体积比加入到无机盐培养基（KH2PO43.48g/L，Na2HPO41.5g/L，MgSO40.70g/L，(NH4)2SO44g/L，NaCl20g/L，酵母粉0.05g/L，pH7.0~7.2）中，筛选对原油降解性能好的菌种，培养条件为25℃，150r/min，接种量2%，培养时间为7d。

[0094]本实施例从30种待选菌株中选择假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa PA01，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC15692，以下简称ATCC15692），不动杆菌（Acinetobacter haemolyticusATCC19194，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC19194，以下简称ATCC19194），伯克霍尔德菌（Burkholderia mallei ATCC23344，购买于美国典型培养物中心，其货号为ATCC23344，以下简称ATCC23344)，和红球菌（Rhodococcus erythoropolisT7-3，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.6104，以下简称T7-3）的等体积发酵混合物（以下简称混合菌），接种至以未接菌的原油无机盐培养基，测定了菌种在降解过程中的原油降解率，其中：原油降解率%=（降解前原油含量-降解后原油含量）/降解前原油浓度×100%，原油含量测定参照国标GB17378.4-2007法测定。结果见图1所示。从图中可以看出，混合菌对原油的降解率为85.6%。

[0095]2、固化吸附菌剂的吸附

[0096]下面公开的是混合菌与固体材料以几种不同比例的制备过程，并不限制本发明。

[0097]将混合菌发酵液与沸石（或陶粒）以表5所列的比例进行吸附实验，40-48组加固体吸附介质后搅拌2min再静止1.5h，49-50组加固体吸附介质后再加入1~2g/l硫酸铝钾，摇动后静止1.5h，吸附后的体系取上清液100μl稀释涂营养琼脂平板计算剩余菌浓（cfu1），并以初始种子液中的菌浓（cfu2）作对照，计算沸石吸附的菌体量（cfu3）和吸附率（%），其中吸附率的计算方法如下：cfu3=cfu2-cfu1，吸附率%=cfu3/cfu2×100%。以第42组实验形成的菌剂42号为例，吸附率达到82.5%。以第49组实验形成的菌剂49号为例，吸附率达到98.5%。

[0098]表5多孔介质对混合菌菌体细胞的吸附作用

[0099]组别 菌号 菌液ml 沸石g 陶粒g 硫酸铝钾g 吸附率％ 菌材比 40 混合菌 25 2.5 / / 76.8 10∶1 41 混合菌 25 7.5 / / 78.4 10∶3 42 混合菌 25 12.5 / / 81.1 2∶1 43 混合菌 25 15 / / 84.6 5∶3 44 混合菌 25 17.5 / / 85.5 10∶7 45 混合菌 25 20 / / 88.7 5∶4 46 混合菌 25 25 / / 91.2 1∶1 47 混合菌 25 / 15 / 92.2 5∶3 48 混合菌 25 / 20 / 85.5 5∶4 49 混合菌 25 12.5   0.2 98.5 2∶1 50 混合菌 25 12.5   0.4 98.6 2∶1

[0100]由表5可以看出，只要混合菌菌液和材料的体积比达到2:1以上，菌体吸附率就可达到80%以上，添加絮凝剂硫酸铝钾可以提高固体材料吸附菌体的效果，菌体吸附率最高可达到98%。

[0101]综合表1~5中的数据，得到本发明提供的固化吸附菌剂的最佳制备方法：即每1份发酵菌液分别添加100~1000g/L多孔介质（沸石或陶粒）、0.15%磷酸氢二铵和0.4%硝酸钠，充分搅拌混合，静置1.5h，即可制得菌体吸附率≥75%的固化吸附菌剂。如果搅拌后添加1~2g/L的硫酸铝钾，混匀后静置1.5h，即可制得菌体吸附率≥98%的固化吸附菌剂。

[0102]实施例6、本发明提供的固化吸附菌剂7在室内模拟海底沉积物修复中的应用效果

[0103]本实施例叙述的是表1中第7组固化吸附菌剂的模拟修复效果，并不限制本发明。

[0104]在3个10L不锈钢罐（罐底d=40cm，罐高80cm）中分别添加3L人工海水(NaCl24.53g，KCl0.695g，CaCl21.16g，MgCl25.2g,Na2SO44.09g,NaHCO30.201g,KBr0.101g,H3BO30.027g,SrCl20.025g,NaF0.003g,pH7.8,用蒸馏水配制)，121℃灭菌20min，分别加入3kg混有3g海二站混合原油的海底沉积物，静置过夜后，分别加入1kg/m2、1.5kg/m2、2kg/m2修复面积的固体吸附菌剂，再分别加入相当于25%菌剂量营养盐肥料（硫酸铵：磷酸氢二钠=1：1），20-25℃培养15d，每天早晚各用不锈钢棒搅拌一次。每天以5点采样法，用无菌采样器取沉积物各5g左右，存放于无菌容器中，再将5点样品充分混合均匀，取混合泥样2.5g，加入用0.2μm滤器过滤的无菌蒸馏水22.5mL稀释，充分振荡制成1:10的样品均液，检测沉积物中的细菌总数（SY/T0532-93）、石油烃降解菌数（MPN法）和油类指纹分析（GB/T21247-2007）。

[0105]其中石油烃降解菌数的测定方法如下：将待测样品做一系列10倍稀释，每个稀释度取3-5次重复接种于适宜的液体培养基(液体石蜡2g/L，MgSO40.2g/L，CaCl20.02g/L，KH2PO41.0g/L，(NH4)2HPO41.0g/L，KNO31.0g/L，FeCl30.05g/L，pH7.2)中25℃下培养7-10天，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标（计数时观测指标为培养基浊度和烃类物质外观乳化分散程度），由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。

[0106]细菌总数和烃降解菌数量的测定结果如图5和图6所示，可以看出实验中的石油烃降解菌的菌数始终占主导地位，说明烃降解菌的菌浓越高，越有利于提高石油降解率。固化吸附菌剂在25℃，降解效率随时间变化显著增大，尤其从第10天开始，降解效率有了很大提高，在实验阶段的13d达到了50%左右（图7），说明固化吸附菌剂的加入有利于降解沉积物中的石油烃。

[0107]实施例7、本发明提供的固化吸附菌剂42在室内模拟海底沉积物修复中的应用效果

[0108]本实施例叙述的是表5中第42组固化吸附菌剂的模拟修复效果，并不限制本发明。

[0109]在3个10L不锈钢罐（罐底d=40cm，罐高80cm）中分别添加3L人工海水(NaCl24.53g，KCl0.695g，CaCl21.16g，MgCl25.2g,Na2SO44.09g,NaHCO30.201g,KBr0.101g,H3BO30.027g,SrCl20.025g,NaF0.003g,pH7.8,用蒸馏水配制)，121℃灭菌20min，分别加入3kg混有3g海二站混合原油的海底沉积物，静置过夜后，分别加入1kg/m2、1.5kg/m2、2kg/m2修复面积的固体吸附菌剂，再分别加入相当于25%菌剂量营养盐肥料（硫酸铵：磷酸氢二钠=1：1），20-25℃培养15d，每天早晚各用不锈钢棒搅拌一次。每天以5点采样法，用无菌采样器取沉积物各5g左右，存放于无菌容器中，再将5点样品充分混合均匀，取混合泥样2.5g，加入用0.2μm滤器过滤的无菌蒸馏水22.5mL稀释，充分振荡制成1:10的样品均液，检测沉积物中的细菌总数（SY/T0532-93）、石油烃降解菌数（MPN法）和油类指纹分析（GB/T21247-2007）。

[0110]其中石油烃降解菌数的测定方法如下：将待测样品做一系列10倍稀释，每个稀释度取3-5次重复接种于适宜的液体培养基(液体石蜡2g/L，MgSO40.2g/L，CaCl20.02g/L，KH2PO41.0g/L，(NH4)2HPO41.0g/L，KNO31.0g/L，FeCl30.05g/L，pH7.2)中25℃下培养7-10天，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标（计数时观测指标为培养基浊度和烃类物质外观乳化分散程度），由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。

[0111]实验中的石油烃降解菌的菌数始终占主导地位，烃降解菌的菌浓越高，越有利于提高石油降解率。固化吸附菌剂在25℃，降解效率随时间变化显著增大，尤其从第10天开始，降解效率有了很大提高，在实验阶段的第13天达到了60%左右，说明固化吸附菌剂的加入有利于降解沉积物中的石油烃。

[0112]实施例8、本发明提供的固化吸附菌剂42在滩涂修复中的应用效果

[0113]本实施例叙述的是表5中第42组固化吸附菌剂及其相应的发酵液混合物在滩涂修复中的应用效果，并不限制本发明。

[0114]在渤海湾选定的石油污染滩涂区域划定3个4m×4m的实验区块，其中2个区块设为试验区，其中1个区块（T1）按3L/m2滩涂面积加入混合菌液，按0.6kg/m2滩涂面积添加营养剂（硫酸氨、磷酸氢二钠）；另1个区块（T2）按1.5kg/m2滩涂面积加入固化吸附菌剂（菌液中加500~1000g/L沸石，加1~2g/L的絮凝剂辅助吸附），按0.6kg/m2滩涂面积添加营养盐肥料（硫酸氨、磷酸氢二钠），以上两个区块菌剂添加方式均为混合后耕耘式撒播；其余1个区块（T3）用作空白实验。按照实施例6的方法对实验区块沉积物介质进行跟踪监测，监测项目包括总石油烃（GB/T16488-1996）、细菌总数（SY/T0532-93）、石油烃降解菌数量（MPN法，同实施例4）和油类指纹分析（GB/T21247-2007），以现场施工当天作为0d，之后分别在3d、9d、18d、30d、60d进行跟踪监测。

[0115]结果见图8-10所示，可见实验初期，原油降解速度较慢，投加菌液（T1）的效果要好于投加固化吸附菌剂（T2）的效果，这与加沸石一组在沸石吸附菌液时使菌的数量损失有关；实验后期，投加固化吸附菌剂（T2）的效果要好于喷洒菌液（T1）的效果。因此，固化吸附菌剂有利于长时间持菌，可用于滩涂现场石油污染的修复。

[0116]实施例9、本发明提供的固化吸附菌剂7和14在滩涂修复中的应用效果

[0117]本实施例叙述的是表1中第7组固化吸附菌剂和表2中第14组固化吸附菌剂在滩涂修复中的应用效果，并不限制本发明。

[0118]在渤海湾选定的石油污染滩涂区域划定3个4m×4m的实验区块，其中2个区块设为试验区，分别为T4：按1.5kg/m2滩涂面积加入第7组固化吸附菌剂，按0.6kg/m2滩涂面积添加营养剂（硫酸氨、磷酸氢二钠）；T5按1.5kg/m2滩涂面积加入第14组固化吸附菌剂，按0.6kg/m2滩涂面积添加营养盐肥料（硫酸氨、磷酸氢二钠），以上两个区块菌剂添加方式均为混合后耕耘式撒播；其余1个区块T6用作空白实验。按照实施例6的方法对60天后实验区块沉积物介质监测总石油烃（GB/T16488-1996）的变化，以T6为对照以计算石油烃降解率。

[0119]实验结果如图11所示。60天后投加7号修复菌剂的滩涂石油烃降解率为56.2%，投加7号修复菌剂的滩涂石油烃降解率为47.8%。此外该固化吸附菌剂有利于长时间持菌，可用于滩涂现场石油污染的修复。

[0120]实施例10、本发明提供的固化修复菌剂的生态安全性评价

[0121]使用的是对表5中42组固化吸附菌剂的生态安全性评价，并不限制本发明。

[0122]根据《海洋石油勘探开发污染物生物毒性》（GB/T18420.2-2001），利用卤虫作为受试生物，进行初步的室内生物毒性实验，求得微生物修复剂野外使用的最佳浓度，为现场实验打下基础。

[0123]取适量卤虫（Artemiidae）虫卵，加入1L海水在室温26℃、光照条件下培养24h。按照投加比要求，依次取受试的混合菌固化吸附菌剂，根据设定的浓度（体积比1.5‰、3‰、6‰、12‰、24‰），取相应量的菌剂加入海水，配制成相应浓度的实验要求浓度的菌剂。在各定量皿中挑选10只健康卤虫放入，然后加入适量各浓度样品，在室温26℃、光照条件下进行培养。且各浓度设一个平行作为对照。每24h进行观察，记录卤虫的死亡个数。

[0124]结果见表6，72h培养时间内，各体积浓度的卤虫存活率均在56%以上。96h培养时间内，体积浓度为6‰的菌剂中卤虫存活个数最多，存活率达90%以上。表明固化吸附菌剂不会影响海洋生态环境。

[0125]表6固化吸附菌剂生态安全评估卤虫存活结果

[0126]浓度 24h存活个数 48h存活个数 72h存活个数 96h存活个数 对照 10 9 9 8 1.5‰ 9 8 7 6 3‰ 8 7 6 6 6‰ 9 9 8 7 12‰ 7 6 6 5 24‰ 6 5 5 3