1.一种能够降解石油修复石油污染土壤生态的菌制剂，其特征在于：该菌制剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粪链球菌(Enterococcusfaecalis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)经优化组合组成的复合菌群，其中各菌组分的配比是1～2∶1∶1∶0.5～1。

2.如权利要求1所述的降解石油修复石油污染土壤生态的菌制剂的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：

1)将保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粪链球菌(Enterococcus faecalis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)面菌种活化，分别摇瓶培养；基本培养基：可溶性淀粉培养基培养，pH7.0～7.2，0.1Mpa，121℃高压灭菌20～30min；28～30℃培养12～24h；

2)将上述摇瓶培养的各菌群混合，二级液体扩大培养，总体积5～20L，以玉米面代替可溶性淀粉培养基中的可溶性淀粉，并添加0.1％的腐殖酸，其他成分与可溶性淀粉培养基相同，接种量体积百分比为5％～10％，28～30℃培养12～24h；

3)再经三级液体扩大培养，总体积10倍于2)，扩大培养基同2)，接种量体积百分比为5％～10％，28～30℃培养12～24h；

4)以腐殖酸为载体将混合菌群均匀吸附、固定化于腐殖酸上，腐殖酸与步骤3)的扩大培养液重量比为3~5。

技术领域

[0001]生物技术领域，本发明涉及一种降解石油、修复石油污染土壤生态的菌制剂及其制备方法。

背景技术

[0002]在石油开采、运输和使用中不可避免的会造成对周围环境的污染，尤其是对土壤生态系统的污染日趋严重。对于石油污染土壤生态的修复，国内外已有一些研究，但是，还未见高密度、高活性，能原位大面积使用的降解石油、修复石油污染土壤生态的菌制剂的报道。

发明内容

[0003]本发明所要解决的技术问题是：提供一种高密度、高活性的降解石油、修复石油污染土壤生态的菌制剂及其制备方法。

[0004]本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

[0005]利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粪链球菌(Enteococccus faecalis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)，都是能产生氧化物酶、脱氢酶等和脂多糖类表面活性剂的菌，能够在接近吸附于土壤颗粒上的石油的同时逐步降解石油组分，从而达到降解石油的目的；因为这四种菌都源于土壤，所以在进入土壤后能很快形成优势菌群，占据一定生态位。这四种菌还具有促进植物根生长、改善根围生态环境的作用，因此，如果采用菌剂-植物联合修复技术，将会促进石油污染土壤生态的修复。将四种菌活化经三级液体扩大培养并吸附、固定化于腐殖酸上制备成菌制剂。四株菌种均购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

[0006]降解石油、修复石油污染土壤生态的菌制剂是上述四种菌经优化组合的组成的菌群，其中各组分的配比基本上是1∶1∶1∶1.这四种菌都是农业部允许使用的安全、无害的菌。

[0007]降解石油、修复石油污染土壤生态的菌制剂的制备方法包括下述步骤：

[0008]1.将保存的各斜面菌种活化，分别摇瓶培养；基本培养基：可溶性淀粉培养基培养，pH7.0～7.2，0.1Mpa，121℃高压灭菌20～30min；28～30℃培养12～24h；

[0009]2.将上述摇瓶培养的各菌群混合，二级液体扩大培养(20L罐)，接种量5％～10％，28～30℃培养12～24h；

[0010]3.再经三级液体扩大培养(200L罐)，接种量5％～10％，28～30℃培养12～24h；

[0011]4.以腐殖酸粉末为载体将混合菌群均匀吸附、固定化于3~5倍腐殖酸上。

[0012]5.密封于内衬聚乙烯的包装袋内，室温保存，保质期1年。

[0013]本发明的有益效果

[0014]1)将复合菌固定化于腐殖酸上，使每克菌制剂的有效菌菌落数(cfu)可高达100个亿以上(即1~3×1010/g)，几乎达到了最大可能数，至今还未见如此高含菌量菌制剂的报道.腐殖酸不仅能为所培养菌提供一些营养成分，还由于其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在单位体积内附着、吸附固定化较多的菌体。因此，一定量的有效菌菌剂一旦施入土壤可以很快形成优势菌群，发挥降解石油组分、修复石油污染土壤生态的作用。

[0015]2)因为污染土壤的石油组分不仅成分复杂，而且因石油牢固地吸附于土壤微粒上，单一的菌或少量的菌是难以进行石油组分降解的。石油组分的完全降解必须由多种微生物产生多种酶才能最终降解为水和二氧化碳。尤其是难降解的多环芳烃，必须由细菌产生的双加氧酶和真菌产生的单加氧酶作用才能开环，否则多环芳烃就很难开始降解。

[0016]3)除油率的测定以二氯甲烷54℃回流12~20h，低真空旋转蒸发去除二氯甲烷，重量法称重并计算加入菌剂和不加菌剂土壤样品的含油率，二者之差就是除油率，若加入相对于土壤表土(耕种层，约15～20cm)重的2％～5％菌剂，三个月内除油率≥75％(二氯甲烷回流提取，重量法)。

[0017]4)土壤生态修复用PCR-DGGE(DNA扩增-变性梯度凝胶电泳)方法评价，结果显示微生物多样性明显增加，如图1、图2所示，图1变性梯度凝胶电泳图，图2是图1的Quantity one软件处理图。

附图说明

[0018]图1变性梯度凝胶电泳图

[0019]图2是图1的Quantity one软件处理图

[0020]1-0d，2-8d，3-16d，4-32d，表示不同天数的电泳条带。

具体实施方式

[0021]实施例1

[0022]按下列步骤进行：

[0023]1)将4℃保存的四种菌种斜面活化，分别摇瓶培养。以可溶性淀粉培养基培养，具体配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2，0.1Mpa，121℃高压灭菌30min。28℃培养24h。

[0024]2)二级液体扩大培养(6L)，以玉米面代替上述培养基中的可溶性淀粉，并加入0.1％腐殖酸(质量分数)，接种量5％，28℃培养24h。。

[0025]3)三级液体扩大培养(60L)，培养基同上；接种量10％，28℃培养24h。

[0026]4)以腐殖酸为载体将菌液固定、吸附于其上。密封于聚乙烯袋内，室温保存。

[0027]实施例2

[0028]按下列步骤进行：

[0029]1)将4℃保存的四种菌种斜面活化，分别摇瓶培养。以可溶性淀粉培养基扩大培养，具体配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.0，0.1Mpa，121℃高压灭菌30min。28℃培养12h。

[0030]2)二级液体扩大培养(10L)，以玉米面代替上述培养基中的可溶性淀粉，并加入0.1％腐殖酸(质量分数)，接种量5％，28℃培养12h。。

[0031]3)三级液体扩大培养(100L)，培养基同上，接种量10％，28℃培养12h。

[0032]4)以腐殖酸为载体将菌液固定、吸附于腐殖酸上。密封于聚乙烯袋内，室温保存。

[0033]实施例3

[0034]按下列步骤进行：

[0035]1)将4℃保存的三种菌种斜面活化，分别摇瓶培养。以可溶性淀粉培养基扩大培养，具体配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2，0.1Mpa，121℃高压灭菌30min。28℃培养12~24h。

[0036]2)二级液体扩大培养(20L)，以玉米面代替上述培养基中的可溶性淀粉，并加入0.1％腐殖酸(质量分数)，接种量5％，28℃培养24h。。

[0037]3)三级液体扩大培养(200L)，培养基同上，接种量10％，28℃培养12~24h。

[0038]4)以腐殖酸为载体将菌液固定、吸附于腐殖酸上。密封于聚乙烯袋内，室温保存。