1.一种用于修复石油烃污染盐碱化土壤的微生物固定化菌剂及制备方法，其特征在于，其步骤如下：

1)菌悬液的制备：将在LB液体培养基中培养至对数期的B05(HRJ4)菌液离心，弃去上清液，并用无菌水冲洗两次，以保证菌液中不含其它碳源，后重悬于等量无菌水中得到菌悬液；

2)生物炭的制备：将木屑洗净晾干之后粉碎，在马弗炉中700℃条件下缺氧裂解，得到700℃的生物炭，标记为BC(Biochar)。将BC过50目筛备用；

3)将BC和菌悬液按照5∶100(w/v)的比例混合两小时，使细菌吸附在BC表面或进入BC的孔隙中，这样我们就得到了B-BC(Bacteria-Biochar)；

4)然后向B-BC混合溶液中添加2％(w/v)的海藻酸钠，这样就得到了海藻酸钠、生物炭吸附载体、细菌混合悬浊物。将该悬浊物逐滴滴加到灭过菌的2％(w/v)CaCl2溶液中，静置30min，制成直径3～5mm可沉降的固定化菌球，将该小球命名为B-BC-SA；

5)固定化小球需要在CaCl2溶液中交联16h以增加其硬度。最后用纱布将小球捞出，并用无菌水冲洗，并4℃保存在无菌生理盐水中；

6)降解率测定：将适量石油烃加入无机盐培养基(M9MM)中，灭菌之后接种菌液，在150rpm，30℃条件下培养7天。降解完成之后的样品用1∶1H2SO4酸化至PH为2，加入1gNaCl(25ml体系)破乳化作用，然后加入20ml二氯甲烷60w条件下超声萃取15min，用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20ml二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相，无水硫酸钠脱水，40℃旋蒸蒸干，并用色谱纯二氯甲烷定容。样品制备完成之后，用配备有HP-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测器的气象色谱仪来检测，计算降解率。

2.权利要求1所述的微生物固定化菌剂，其特征在于，选用的菌种于2014年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；具体为：变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)HRJ4(保藏编号CGMCC No.10134)，保藏名称为B05，该菌株具有较好的耐盐碱及石油烃降解能力。

3.权利要求1所述的无机盐培养基(M9MM)，其特征在于，无机盐培养基成分为(1L)：8.5g Na2HPO4·2H2O，3.0g KH2PO4，1.0g NH4Cl，0.49gMgSO4·7H2O，0.011g CaCl2，NaCl的量根据需要加入。微量元素：0.4mg CuSO4，1.0mg KI，4.0mg MnSO4·H2O，4.0mg ZnSO4·7H2O，5.0mg H3BO3，1.6mg H2MoO4·2H2O，2.0mg FeCl3·6H2O。其中1mol/l的MgSO4·7H2O和1mol/l的CaCl2分开灭菌之后再加入培养基中，盐度为3％，PH为9。

4.权利要求1所述的GC检测条件如下：氮气作为载气；不分流模式；进样口温度和检测器温度都为300℃；柱箱温度为：40℃保持0.5min，以每分钟15℃的速度升至290℃并保持5min。

5.权利要求1所制得的高效石油烃降解菌固定化菌球，其特征在于：其应用于盐碱性石油烃污染土壤的生物修复。

技术领域

[0001]本发明涉及一种用于修复石油烃污染盐碱化土壤的微生物固定化菌剂及制备方法，具体涉及一种将筛选得到的高效石油烃降解菌固定化并应用于修复盐碱性石油污染环境的技术方法，其属于环境修复技术领域。

背景技术

[0002]在石油开采和油井施工作业过程中，易造成石油泄漏，污染土壤。我国大港油田、大庆油田、胜利油田等多个油田的土壤因其特定的地质条件和不合理的人类活动均有不同程度的盐碱化。盐碱土壤本身理化性质差，石油污染进一步恶化了其理化性质，对土壤微生物造成显著胁迫，干扰土壤物质循环。此外，石油中含有的多环芳烃等污染物具有“三致”效应，具有较高的生态风险，对人类健康具有潜在威胁。因此，石油污染盐碱土壤的修复是一项紧迫任务。然而目前的土壤修复方法大多集中在石油或者盐碱单一胁迫方面，针对石油和盐碱复合胁迫下的土壤修复制剂罕见报道。

[0003]目前，石油污染土壤的修复方法主要有：萃取、淋洗、堆肥、植物修复、微生物修复等。微生物由于具有繁殖能力强、适应性强、降解谱广等优点，常用于清除石油类污染物。从石油污染土壤中分离高效石油烃降解菌，特别是适应特定土壤环境的降解菌，仍是石油污染土壤修复的研究热点之一。通常情况下，石油烃降解菌不太适应盐碱性土壤环境，盐碱胁迫影响其生长活性剂其降解效果的发挥。从石油污染盐碱土壤中分离得到的耐盐碱石油烃降解菌能够较好地适应盐碱土壤环境，可以在高盐碱条件下高效地降解石油烃。

[0004]微生物修复在实施过程中也存在着一定的难度。例如，由于石油烃组成复杂，毒性强，且生物可用性降低等原因使原位生物强化修复的效率低。同时外来菌种受生态系统中环境因素的复杂性和波动性的冲击，接种微生物数量和活性迅速降低至无法达到预期目标，外源微生物的生存能力、活性以及迁移能力与环境因素之间的关系直接决定着生物强化修复的治理效果。就修复高盐碱石油污染土壤而言，固定化微生物技术比游离微生物具有明显的优势，固定化菌剂能够较好地弥补游离细菌生存能力差的缺点，固定化载体还可以作为一种膨松剂，有利于氧气 的传递，用生物炭作载体来修复石油污染土壤具有重要研究意义。

发明内容

[0005]1.一种用于修复石油烃污染盐碱化土壤的微生物固定化菌剂及制备方法，其特征在于，其步骤如下：

[0006]1)菌悬液的制备：将在LB液体培养基中培养至对数期的HRJ4菌液离心，弃去上清液，并用无菌水冲洗两次，以保证菌液中不含其它碳源，后重悬于等量无菌水中得到菌悬液；

[0007]2)生物炭的制备：将木屑洗净晾干之后粉碎，在马弗炉中700℃条件下缺氧裂解，得到700℃的生物炭，标记为BC(Biochar)。将BC过50目筛备用；

[0008]3)将BC和菌悬液按照5∶100(w/v)的比例混合两小时，使细菌吸附在BC表面或进入BC的孔隙中，这样我们就得到了B-BC(Bacteria-Biochar)；

[0009]4)然后向B-BC混合溶液中添加2％(w/v)的海藻酸钠，这样就得到了海藻酸钠、生物炭吸附载体、细菌混合悬浊物。将该悬浊物逐滴滴加到灭过菌的2％(w/v)CaCl2溶液中，静置30min，制成直径3～5mm可沉降的固定化菌球，将该小球命名为B-BC-SA；

[0010]5)固定化小球需要在CaCl2溶液中交联16h以增加其硬度。最后用纱布将小球捞出，并用无菌水冲洗，并4℃保存在无菌生理盐水中；

[0011]6)降解率测定：将适量石油烃加入无机盐培养基(M9MM)中，灭菌之后接种菌液，在150rpm，30℃条件下培养7天。降解完成之后的样品用1∶1H2SO4酸化至PH为2，加入1g NaCl(25ml体系)破乳化作用，然后加入20ml二氯甲烷60w条件下超声萃取15min，用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20ml二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相，无水硫酸钠脱水，40℃旋蒸蒸干，并用色谱纯二氯甲烷定容。样品制备完成之后，用配备有HP-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测器的气象色谱仪来检测，计算降解率。

[0012]2.发明内容1所述的微生物固定化菌剂，其特征在于，选用的菌种于2014年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；具体为：变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)HRJ4(保藏编号CGMCC No.10134)，该菌株具有较好的耐盐碱及石油烃降解能力，图1为HRJ4在不同 盐度和PH条件下在LB培养基中培养24h之后的OD值，图2为HRJ4在PH为9，盐度为3％条件下培养7d之后培养基中剩余的石油烃含量。

[0013]3.发明内容1第六步中所述的无机盐培养基(M9MM)，其特征在于，无机盐培养基成分为(1L)：8.5g Na2HPO4·2H2O，3.0g KH2PO4，1.0g NH4Cl，0.49gMgSO4·7H2O，0.011g CaCl2，NaCl的量根据需要加入。微量元素：0.4mg CuSO4，1.0mg KI，4.0mg MnSO4·H2O，4.0mg ZnSO4·7H2O，5.0mg H3BO3，1.6mgH2MoO4·2H2O，2.0mg FeCl3·6H2O。其中1mol/l的MgSO4·7H2O和1mol/l的CaCl2分开灭菌之后再加入培养基中，盐度为3％，PH为9。

[0014]4.发明内容1第六步中所述的GC检测条件如下：氮气作为载气；不分流模式；进样口温度和检测器温度都为300℃；柱箱温度为：40℃保持0.5min，以每分钟15℃的速度升至290℃并保持5min。

[0015]5.该微生物菌剂制备简单并有较好的稳定性。采用本微生物菌剂处理石油污染盐碱土壤具有处理成本低、利于石油专性降解菌适应新的污染环境、提高和改善土壤的微生态环境质量和对环境不造成二次污染的优点，可以显著地提高盐碱土壤中石油烃的降解效率，同时也可适用于有一定含盐量的石油污染水体的修复。

[0016]说明书附图：

[0017]图1是菌B05(HRJ4)在不同盐度和PH条件下在LB培养基中培养24h之后的OD值图；

[0018]图2是菌B05(HRJ4)对各种烃类的降解效果图；

[0019]图3是制备得到的固定化小球(左：B-BC-SA；右：B-WC-SA)图；

[0020]图4是生物炭、木屑以及各种固定化菌剂的扫描电镜结果(A：生物炭；B：木屑；C：生物炭吸附细菌；D：木屑吸附细菌；E：B-BC-SA；F：B-WC-SA)图；

[0021]图5是各实验组和对照组对混合烃中每种组分的降解结果图。

具体实施方式：

[0022]结合以下具体实施案例进一步阐明本发明。需理解，以下实施方式仅用于解释本发明，而不限制本发明的适用范围。下列实施方式中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作。

[0023]实施例：

[0024]将石油烃降解菌变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)B05(HRJ4)(保藏编号CGMCC No.10134)进行固定化，所述固定化选用生物炭和海藻酸钠为固定化载体，石油烃降解菌培养液(B)、700℃下制备的生物炭(BC)和海藻酸钠(SA)的比例为100∶5∶2。首先，将培养至对数期的变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)HRJ4菌液离心，弃去上清液，并中无菌水冲洗两次，以保证菌液中不含其它碳源，后重悬于等量无菌水中得到菌悬液。将BC和菌悬液按照5∶100(w/v)的比例混合两小时，使细菌吸附在BC表面或进入BC的孔隙中，这样我们就得到了B-BC。然后向混合溶液中添加2％(w/v)的海藻酸钠，这样就得到了海藻酸钠、生物炭吸附载体、细菌混合悬浊物。用无菌注射器抽取含有石油烃降解菌、生物炭(BC)和海藻酸钠的混合液滴落至灭过菌的2％(w/v)CaCl2溶液中，静置30min，制成直径3～5mm可沉降的固定化菌球，如图3所示，在CaCl2溶液中交联16h，最后用纱布将小球捞出，并用无菌水冲洗，并4℃保存在无菌生理盐水中，将此固定化菌剂命名为B-BC-SA。另外，将生物炭BC换成木屑按上述同样步骤来制备对照组固定化菌剂，命名为B-WC-SA。所有的固定化菌剂在用之前都保存在4℃条件下。

[0025]BC和WC吸附细菌24小时后用纱布捞起并用无菌水冲洗，B-BC-SA小球和B-WC-SA小球用液氮速冻，并从中间切断，于是我们就可以观察到固定化小球的内部结构。所有的样品均在35℃条件下烘干，并用扫描电子显微镜来观察材料表面或内部细菌的存在状态。结果如图4所示。

[0026]为了考察B-BC-SA对于石油烃污染废水中THPs的降解效率，将实验分组设置如下：(1)游离细菌(B)；(2)B-BC-SA；(3)B-WC-SA；(4)BC吸附细菌(B-BC)；(5)BC未吸附细菌(BC)；(6)对照组，只添加碳源(CK)。

[0027]在50ml锥形瓶中添加25ml M9MM和125mg石油烃混合物，并按照上述设置来安排实验。所有锥形瓶均在150rpm、30℃、避光条件下培养7天。所有实验组及对照组均设三组平行。7天降解完成之后，样品用1∶1H2SO4酸化至PH为2，加入1g NaCl破乳化作用，然后加入20ml二氯甲烷60w条件下超声萃取15min，用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20ml二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相，无水硫酸钠脱水，40℃旋蒸蒸干，并用色谱纯二氯己烷定容。

[0028]样品制备完成之后，用配备有HP-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测器的气象色谱仪(USA)来检测。检测条件如下：氮气作为载气；不分流模式；进样口温度和检测器温度都为300℃；柱箱温度为：40℃保持0.5min，以每分钟15℃的速度升至290℃并保持5min。每组样品都分析三次，实验结果用平均值和标准差来表示。

[0029]7天之后的降解结果为(图5)：对于TPHs降解率最高的处理组为添加B-BC-SA的样品，降解率7天后能够达到82.2％，这显著(p＜0.05)高于添加游离细菌的样品。添加B-WC-SA和BC的样品降解率也都高于添加游离细菌的样品，说明固定化技术都能在一定程度上促进TPHs的降解。由于700℃的生物炭具有丰富的孔结构和较强的传质能力，B-BC-SA成为所有固定化材料中降解效果最好的一种。