1.抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，包括：以旋转的不锈钢管为接收器，通过静电纺丝技术，依次将有机高分子聚合物、Cu2+络合物催化剂和有机高分子聚合物的混合物、有机高分子聚合物制备成具有三层结构的超细纤维多孔管状支架材料；通过调控Cu2+络合物催化剂和有机高分子聚合物的种类和比例，以及三层静电纺丝液的电纺时间，来调控NO的释放速率。

2.根据权利要求1所述的抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，其特征在于：血管支架材料由有机高分子材料构成，具体说是可降解的有机高分子材料，包括聚己内酯PCL、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物PLGA、聚丙交酯-聚己内酯共聚物PLCL、聚-3-羟基丁酸酯-聚-4-羟基丁酸酯共聚物P3HB4HB中的一种或几种的混合物。

3.根据权利要求1所述的抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，其特征在于：所述Cu2+络合物催化剂为Cu2+有机络合物，包括Cu2+-Cyclen络合物、Cu2+-Cyclam络合物、Cu2+-DTTCT络合物中的一种或几种的混合物。

4.根据权利要求1所述的抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，其特征在于：进行三层结构静电纺丝时，温度为25℃，空气湿度为40％，流速为1ml/h，电压为14kv，接收距离为20cm，内、中、外三层纺丝时间为30-60min。

所属技术领域：

[0001]本发明涉及组织工程血管支架材料表面修饰方法，具体说是抗凝血性人工血管支架材料的构建方法。 

背景技术：

[0002]小口径血管在临床上有很大需求，但目前的小口径人工血管移入体内后再狭窄率很高。为了在临床减少血栓形成带来的危害，医学上常使用抗凝血剂，然而，长期使用外源抗凝血剂也有副作用，特别是增加了出血的可能性。 

[0003]内皮细胞是保持血管稳定性的天然调节物。内皮细胞在抗血栓形成、抑制血小板聚集、分泌血管活性因子等方面发挥着重要作用。内皮细胞中具有抗血栓、抗血小板凝聚性质的分子包括一氧化氮(NO)和肝素。其中NO是生物体内的一种信息分子，其从内皮细胞表面的持续释放能够有效地防止血小板在正常血管壁上的粘附和活化，NO也能抑制平滑肌细胞的增殖，因而具有抗凝血效果。 

[0004]基于此，有实验室研究制备了多种可释放NO的高分子材料。这些研究大多是将NO供体混合进或连接到聚合物上用来制备能释放NO的材料。虽然采用可释放NO的高分子材料是提高人工血管抗凝血性质的新途径，但，由于这类可释放NO的聚合物材料所储存和能够释放NO的量有限，释放速率也太快，从而影响了NO释放的持久性，在很大程度上限制了其在长期植入材料中的应用，这是使用这类材料最大的局限性。 

[0005]由于在健康血液中已经存在S-亚硝基硫醇等NO供体的前驱体，而体内的谷胱甘肽过氧化酶在谷胱甘肽的存在下能够循环催化体内的亚硝基硫醇释放NO。一种有效的方法是在人工血管支架材料上固定催化剂，使其催化体内内源性RSNOs局部释放NO，实现NO释放的持久性。固定的催化剂中可以是联硒化合物，也可以是某些金属离子复合物。Cu2+-cyclam复合物是催化剂中重要的一种，Cu2+可以被还原剂硫醇还原为Cu+，然后Cu+作为催化剂与内源性的RSNOs反应释放NO。最后，催化部位又恢复成氧化型Cu2+。反应机理如下： 

[0006]2Cu2++2RSH→2Cu++RS-SR+2H+        (1) 

[0007]Cu++RSNO+H+→Cu2++RSH+NO↑       (2) 

[0008]其中，Cu2+络合物采用Cu2+的有机络合物，目的在于使其与有机高分子能有更好的相容性，以利于其在复合材料中分散均匀；Cu2+络合物举例如下： 

[0009]

[0010]含Cu2+有机络合物的结构 

[0011](A)Cu2+-Cyclen：Cu2+-1，4，7，10-四氮杂环十二烷 

[0012](B)Cu2+-Cyclam：Cu2+-1，4，8，11-四氮杂环十四烷 

[0013](C)Cu2+-DTTCT：Cu2+-二苯并[e，k]-2，3，8，9-四苯基-1，4，7，10-四氮杂-环十二烷-1，3，7，9-四烯物 

[0014]现有研究是将Cu2+有机络合物催化剂与高分子聚合物均匀混合，然后静电纺丝来制备能催化体内RSNO释放NO的材料。虽然能够起到催化释放NO的目的，但是，由于这类均匀混合负载到聚合物超细纤维上的体外催化剂负载不稳定，尤其是亲水性物质易从聚合物超细纤维膜表面脱落，从而使得局部Cu2+浓度过大，导致NO释放速率过快，存在突释现象，影响了NO释放的持久性，在很大程度上限制了其在长期植入材料中的应用，；局部过大的Cu2+浓度还会导致材料毒性，这是使用这类材料最大的局限性。 

[0015]本发明的目的在于解决NO突释问题和提高催化剂负载稳定性。 

发明内容：

[0016]为了实现本发明的目的，本发明利用上述NO产生原理，在人工血管上负载含Cu2+有机络合物，并提供一种具有三层结构的抗凝血性人工血管支架材料的构建方法。 

[0017]本发明的技术方案为：抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，包括：以旋转的不锈钢管为接收器，通过静电纺丝技术，依次将有机高分子聚合物、Cu2+络合物催化剂和有机高分子聚合物的混合物、有机高分子聚合物制备成具有三层结构的超细纤维多孔管状支架材料；通过调控Cu2+络合物催化剂和高分子聚合物的种类和比例，以及三层静电纺丝液的电纺时间，来调控NO的释放速率。 

[0018]本发明所述的血管支架材料由有机高分子材料构成，具体说是可降解的有机高分子材料，包括聚己内酯PCL、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物PLGA、聚丙交酯-聚己内酯共聚物PLCL、聚-3-羟基丁酸酯-聚-4-羟基丁酸酯共聚物P3HB4HB中的一种或几种的混合物。 

[0019]本发明所述的Cu2+络合物催化剂为Cu2+有机络合物，包括Cu2+-Cyclen络合物、 Cu2+-Cyclam络合物、Cu2+-DTTCT络合物中的一种或几种的混合物。 

[0020]本发明所述的静电纺丝方法，其特征在于：进行三层结构静电纺丝时，温度为25℃，空气湿度为40％，流速为1ml/h，电压为14kv，接收距离为20cm，内、中、外三层纺丝时间为30-60min。 

[0021]本发明的突出优点在于：1)采用本发明方法构建的血管支架材料，以体外催化剂修饰材料，催化体内存在的内源NO供体RSNO，实现NO持续、局部释放；2)通过调控三层结构中的催化剂和高分子材料的比例可以有效调控NO的释放速率。进而，有效利用NO这一重要的生物信号分子，发挥NO抑制抗血小板黏附、血小板激活和抑制平滑肌细胞增殖的功能；从而提高其抗凝血性能，诱导和促进血管再生，防止血管再狭窄，改善血管功能；3)采用本发明方法构建的血管支架材料，由于可以使用性能不同的多种高分子聚合物分别构建内、中、外三层，使得支架材料整体性能优化，可以创造出更能仿生的细胞外基质微环境，为体内移植后细胞的生长提供更有利的环境条件，有利于血管的再生；4)本发明所形成的三层结构血管支架材料，不仅实现了Cu2+络合物催化剂的负载，还改善了均匀混合电纺结构的支架材料催化NO突释现象，提高了Cu2+络合物催化剂的负载稳定性。 

附图说明：

[0022]图1为人工血管支架材料横截面的三层结构示意图。 

[0023]其中，1为有机高分子聚合物；2为Cu2+络合物催化剂。 

具体实施例：

[0024]实施例1.抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，依次包括如下步骤： 

[0025]①制备P3HB4HB电纺液与P3HB4HB和Cu2+-Cyclen络合物的混合电纺液： 

[0026]称取12％的P3HB4HB 300mg，溶于6ml溶剂(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)；制备三份；其中一份溶入1.2mg Cu2+-Cyclen络合物； 

[0027]②通过静电纺丝技术制备具有三层结构的多孔血管支架材料： 

[0028]以内径3mm的不锈钢管为静电纺丝接收器，依次将上述P3HB4HB电纺液，P3HB4HB和Cu2+-Cyclen络合物混合电纺液，以及P3HB4HB电纺液电纺于管状接收器，形成图1所示人工血管支架； 

[0029]静电纺丝条件：温度为25℃，空气湿度为40％，流速为1ml/h，电压为14kv，接收距离为20cm，内层P3HB4HB电纺液的纺丝时间为30min，中层溶有Cu2+-Cyclen络合物的P3HB4HB电纺液的纺丝时间为30min、外层P3HB4HB电纺液的纺丝时间为30min。 

[0030]③脱管，进行NO释放体外实验和AV-Shunt半体内抗凝血实验，观察NO控制释放情 况和人工血管支架材料的抗凝血情况；评价该NO催化释放材料的负载稳定性。 

[0031]实施例2.抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，依次包括如下步骤： 

[0032]①制备PCL电纺液与PCL和Cu2+-Cyclam络合物的混合电纺液： 

[0033]称取PCL，300mg，溶于6ml溶剂(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)；制备三份；其中一份溶入1.2mg Cu2+-Cyclam络合物； 

[0034]②通过静电纺丝技术制备具有三层结构的多孔血管支架材料： 

[0035]以内径3mm的不锈钢管为静电纺丝接收器，依次将上述PCL电纺液，PCL和Cu2+-Cyclam络合物混合电纺液，以及PCL电纺液电纺于管状接收器，形成图1所示人工血管支架； 

[0036]静电纺丝条件：温度为25℃，空气湿度为40％，流速为1ml/h，电压为14kv，接收距离为20cm，内层PCL电纺液的纺丝时间为30min，中层溶有Cu2+-Cyclam的PCL电纺液纺丝时间为30min、外层PCL电纺液的纺丝时间为30min。 

[0037]③脱管，进行NO释放体外实验和AV-Shunt半体内抗凝血实验，观察NO控制释放情况和人工血管支架材料的抗凝血情况；评价该NO催化释放材料的负载稳定性。 

[0038]实施例3.抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，依次包括如下步骤： 

[0039]①制备PCL与PLGA混合电纺液，PCL和PLGA和Cu2+-DTTCT络合物的混合电纺液：称取PCL和PLGA各150mg，溶于6ml溶剂(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)；制备三份；其中一份溶入1.2mg Cu2+-DTTCT复合物； 

[0040]②通过静电纺丝技术制备具有三层结构的多孔血管支架材料： 

[0041]以内径3mm的不锈钢管为静电纺丝接收器，依次将上述PCL和PLGA电纺液，PCL和PLGA和Cu2+-Cyclam络合物混合电纺液，以及PCL和PLGA电纺液电纺于管状接收器，形成图1所示人工血管支架； 

[0042]静电纺丝条件：温度为25℃，空气湿度为40％，流速为1ml/h，电压为14kv，接收距离为20cm，内层PCL和PLGA电纺液纺丝时间为30min，中层溶有Cu2+-DTTCT络合物的PCL和PLGA电纺液的纺丝时间为45min、外层PCL和PLGA电纺液的纺丝时间为30min。 

[0043]③脱管，进行NO释放体外实验和AV-Shunt半体内抗凝血实验，观察NO控制释放情况和人工血管支架材料的抗凝血情况；评价该NO催化释放材料的负载稳定性。 

[0044]实施例4.抗凝血性人工血管支架材料的构建方法，依次包括如下步骤： 

[0045]①制备P3HB4HB电纺液，P3HB4HB和Cu2+-Cyclen与Cu2+-Cyclam络合物的混合电纺液： 

[0046]称取12％的P3HB4HB 300mg，溶于6ml溶剂(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)；制备三份；其中一份溶入0.6mg Cu2+-Cyclen和0.6mg Cu2+-Cyclam络合物； 

[0047]②通过静电纺丝技术制备具有三层结构的多孔血管支架材料： 

[0048]以内径3mm的不锈钢管为静电纺丝接收器，依次将上述P3HB4HB电纺液，P3HB4HB 和Cu2+-Cyclen与Cu2+-Cyclam络合物混合电纺液，以及P3HB4HB电纺液电纺于管状接收器，形成图1所示人工血管支架； 

[0049]静电纺丝条件：温度为25℃，空气湿度为40％，流速为1ml/h，电压为14kv，接收距离为20cm，内层P3HB4HB电纺液的纺丝时间为30min，中层溶有Cu2+-Cyclen和Cu2+-Cyclam络合物的P3HB4HB电纺液的纺丝时间为50min、外层P3HB4HB电纺液的纺丝时间为30min。 

[0050]③脱管，进行NO释放体外实验和AV-Shunt半体内抗凝血实验，观察NO控制释放情况和人工血管支架材料的抗凝血情况；评价该NO催化释放材料的负载稳定性。