1.一种利用环介导等温扩增技术检测豚鼠气单胞菌的试剂盒，其特征在于，它包括如下成分及各成分的作用浓度：

(1)特异性寡核苷酸引物：FIP、BIP、F3、B3、(各引物浓度均为5-15μmol/L)；

FIP：5’AGGCCCGCCGAGGCTGCGATTTTAGCGATAACAACGTTGA3’

BIP：5’AATAAAGCATGATTTTCGTTTTTCCGTGAGAAGGGCGGTGTC3’

F3： 5’AAGTTCGTTACCCAATGTAGAG3’

B3： 5’CCCTTCTACCGCCGTGCAAG3’

(2)DNA提取试剂：TE缓冲液(5-15mmol/L Tris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH 8.0)；蛋白酶K溶液(浓度10-20mg/mL，pH8.0)；Tris饱和酚(pH8.0)；乙酸钠(浓度2-5mol/L)；乙醇(浓度95％)；

(3)PCR试剂管成分为：

10×反应缓冲液(200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％Triton X-100)

(4)dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度为5-15mmol/L)；

(5)双蒸水；

(6)BstDNA聚合酶(8u/μL)。

2.按照权利要求1所述的一种利用环介导等温扩增技术检测豚鼠气单胞菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒检测使用方法如下：

(1)DNA抽提

挑取待检测菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存；

(2)环介导等温扩增(LAMP)

在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：

PCR反应体系：

10×反应缓冲液       (2.5μL)

(200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)

Bst DNA聚合酶        8U(1μL)

FIP                  40pmol(4μL)

BIP                  40pmol(4μL)

F3                   5pmol(0.5μL)

B3                   5pmol(0.5μL)

dNTPs         每种80nmol/L(10mmol/L 0.5μL)

DNA样品       50ng(2μL)

双蒸水        10μL

LAMP扩增程序：

①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上；

②62℃保持60分钟；

③80℃保持2分钟；

(3)电泳检查

LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色，电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带，且间距为160bp左右。

技术领域

[0001]本发明属于病原菌诊断领域，主要内容是通过用环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification LAMP)技术特异性扩增16S和23S核糖体RNA基因的转录间区，对致病性鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)进行快速检测。在等温条件(65℃左右)保温几十分钟即可达到区分豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)和相似致病菌的目的。能够大大提高临床诊断豚鼠气单胞菌的效率。

背景技术

[0002]豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)在自然环境中广泛分布，尤其分布于多种水体中。有文献报道从淡水、咸水、自来水和土壤中以及动物和人类粪便中分离出豚鼠气单胞菌。该菌与许多疾病有关，它能够引起感染性腹泻，还可引起多种肠道外感染，如呼吸系统，泌尿系统，创伤，腹腔，胆囊及胆管等部位感染。豚鼠气单胞菌对免疫低下人群的危害尤其严重，个别情况甚至会危及生命。儿童是最易感染群体。近年来由豚鼠气单胞菌引起的新的其它病症也不断被报告，例如炎症性肠病和菌血症等(van der Gaag et al.，Aeromonas caviaeinfection mimicking inflammatory bowel disease in a child；Teiraet al.，Bacteremia of biliary origin caused by Aeromonas caviae in a healthypatient)。

[0003]目前国际上对于气单胞菌诊断主要基于生化检验，对于气单胞菌的诊断需要排除在生化性状上极其相近的其它种，并且要经过数目众多的一组反应才能确诊，而且在某些情况下结果并不准确。尤其在鉴定到种的水平上，比较困难。再加上生化反应所用的时间较长，使得对于该致病菌的检测效率十分低下，完全确诊需要1-3周时间。常规检测费时费力，对于及时确定病人治疗方案非常不利，并且传统的检测方法需要较大的劳动量，因此会增加检测成本。近年来分子生物学检测方法迅速发展，但是主要以常规聚合酶链式反应(PCR)检测为主。聚合酶链式反应检测虽然也比较快速简便，但是由于一对引物所能达到的特异性有限，使其准确度受到一定限制。此外，这种方法在检验灵敏度上最多能达到103-104CFU/ml，其效果并不非常理想(M.N.Gonza′lez-Rodri′guez et al.，PCR detection of potentially pathogenicaeromonads in raw and cold-smoked freshwater fish)。还有一些分子生物学检测技术如16S rRNA基因测序鉴定技术也可用于气单胞菌检测。测序技术虽然有较高的准确度，但是要以分离的细菌纯培养物和聚合酶链式反应产物作为基础，过程比较长，技术复杂，对操作人员要求较高，不利于推广应用。国内对于气单胞菌诊断的报道不是很多，仅有的少量报道都局限于应用国外已经开发的检验技术。国内与豚鼠气单胞菌相关的病例报道并不少见，但是尚缺少对该致病菌的快速和准确的检测方法。因此，发展一种快速，高准确性和高灵敏度的豚鼠气单胞菌检验方法和试剂盒非常有必要。

发明内容

[0004]本发明的目的是提供一种豚鼠气单胞菌环介导等温扩增快速检测试剂盒和检测方法。运用环介导等温扩增技术检测豚鼠气单胞菌的方法，能够提高检测效率和检测的准确度，本发明针对16S-23S核糖体RNA转录间区6个区域设计4种特异引物，具有极高的特异性和灵敏度。检测时间只需2个小时左右。此外，由于本检测方法和所需设备简单，因此还可用于野外实地检测。

[0005]1.试剂盒成分

[0006]为了解决该致病菌常规检测方法效率低下的问题，本发明是通过利用一种豚鼠气单胞菌环介导等温扩增快速检测试剂盒而实现的，它的成分和浓度如下：

[0007]1)特异性寡核苷酸引物：FIP、BIP、F3、B3(各引物浓度均为5-15μmol/L)

[0008]FIP：5’AGGCCCGCCGAGGCTGCGATTTTAGCGATAACAACGTTGA3’

[0009]BIP：5’AATAAAGCATGATTTTCGTTTTTCCGTGAGAAGGGCGGTGTC3’

[0010]F3： 5’AAGTTCGTTACCCAATGTAGAG3’

[0011]B3： 5’CCCTTCTACCGCCGTGCAAG3’

[0012]2)DNA提取试剂：TE缓冲液(5-15mmol/L Tris，0.5-1.5mmol/L EDTA，pH 8.0)；蛋白酶K溶液(浓度10-20mg/mL，pH8.0)；Tris饱和酚(pH8.0)；乙酸钠(浓度2-5mol/L)；乙醇(浓度95％)。

[0013]3)PCR反应体系：

[0014]10×反应缓冲液(200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％Triton X-100)

[0015]4)dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度为5-15mmol/L)。

[0016]5)双蒸水。

[0017]6)BstDNA聚合酶(8u/μL)

[0018]2.试剂盒使用方法

[0019]1)DNA抽提

[0020]挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存。

[0021]2)环介导等温扩增(LAMP)

[0022]在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：

[0023]10×反应缓冲液          (2.5μL)

[0024](200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)

[0025]Bst DNA聚合酶           8U(1μL)

[0026]FIP                     40pmol(4μL)

[0027]BIP                     40pmol(4μL)

[0028]F3                      5pmol(0.5μL)

[0029]B3         5pmol(0.5μL)

[0030]dNTPs      每种80nmol/L(10mmol/L 0.5μL)

[0031]DNA样品    50ng(2μL)

[0032]双蒸水     10μL

[0033]LAMP扩增程序：①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。

[0034]3)电泳检查

[0035]LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色，电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带，且间距为160bp左右。

[0036]本发明利用气单胞菌16S-23S核糖体RNA基因转录间区序列的特异性，通过六个区域设计四对特异性引物，扩增出容易判断的梯状条带，在已试验的109个其它致病细菌中均未发现假阳性结果。

[0037]本发明与现有技术相比的优点在于：基于DNA的鉴定方法适用于直接从患者含菌体液、组织等临床样品中直接运用环介导等温扩增方法扩增特异性靶基因，从而检测豚鼠气单胞菌。LAMP方法具有检测准确、特异性强，操作方便，设备简单的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标细菌。它用环介导等温扩增方法扩增细菌特异性靶基因，避免了反复培养，冗长的一系列生化反应，节约时间，劳动力和成本。LAMP鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确，能够排除一些生理生化鉴定方法不能排除的干扰菌。

附图说明

[0038]附图：引物特异性测试图和病人样本检测结果图

具体实施方式

[0039]下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

[0040]实施例1：病人样本1

[0041]1.DNA抽提

[0042]挑取疑似菌落加入到0.4mLTE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。

[0043]2)环介导等温扩增(LAMP)

[0044]在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：

[0045]成分             体系中各组分终浓度和体积

[0046]10×反应缓冲液   (2.5μL)

[0047](200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)

[0048]Bst DNA聚合酶    8U(1μL)

[0049]FIP              40pmol(4μL)

[0050]BIP              40pmol(4μL)

[0051]F3               5pmol(0.5μL)

[0052]B3               5pmol(0.5μL)

[0053]dNTPs            每种80nmol/L(10mmol/L 0.5μL)

[0054]DNA样品          50ng(2μL)

[0055]双蒸水           10μL

[0056]LAMP扩增程序：①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。

[0057]3.被检测样品目的LAMP扩增和电泳检查

[0058]LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带。且间距为160bp左右(附图，泳道4)，为保证检测的准确性，扩增的产物分别用Bgl I和Xba I进行酶切(见附图，泳道11-14)。

[0059]附图中各个泳道表示的样本如下

[0060]1，9，10，15：分子量maker

[0061]2：豚鼠气单胞菌(ATCC 15468)

[0062]3：豚鼠气单胞菌临床分离株

[0063]4：病人样本1 LAMP扩增产物

[0064]5：病人样本2 LAMP扩增产物

[0065]6：病人样本3 LAMP扩增产物

[0066]7：嗜水气单胞菌(ATCC 7966)

[0067]8：温和气单胞菌(ATCC43979)

[0068]11，12：LAMP扩增产物用Bgl I酶切后的结果图

[0069]13，14：LAMP扩增产物用Xba I酶切后的结果图

[0070]实施例2：病人样本2

[0071]1.DNA抽提

[0072]挑取疑似菌落加入到0.4mLTE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存。

[0073]2)环介导等温扩增(LAMP)

[0074]在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：

[0075]10×反应缓冲液     (2.5μL)

[0076](200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)

[0077]Bst DNA聚合酶      8U(1μL)

[0078]FIP                40pmol(4μL)

[0079]BIP                40pmol(4μL)

[0080]F3                 5pmol(0.5μL)

[0081]B3                 5pmol(0.5μL)

[0082]dNTPs              每种80nmol/L(10mmol/L 0.5μL)

[0083]DNA样品            50ng(2μL)

[0084]双蒸水             10μL

[0085]LAMP扩增程序：①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。

[0086]3.被检测样品目的LAMP扩增和电泳检查

[0087]LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带。且间距为160bp左右(附图，泳道5)，为保证检测的准确性，扩增的产物分别用Bgl I和Xba I进行酶切。

[0088]实施例3：病人样本3

[0089]1.DNA抽提

[0090]挑取疑似菌落加入到0.4mLTE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时。加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，8000转/分离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000转/分离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000转/分离心5分钟，弃上清，加入50μLTE溶液，置-20℃保存。

[0091]2)环介导等温扩增(LAMP)

[0092]在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL：

[0093]10×反应缓冲液     (2.5μL)

[0094](200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/LMgSO4，1％Triton X-100)

[0095]Bst DNA聚合酶      8U(1μL)

[0096]FIP                40pmol(4μL)

[0097]BIP                40pmol(4μL)

[0098]F3                 5pmol(0.5μL)

[0099]B3                 5pmol(0.5μL)

[0100]dNTPs              每种80nmol/L(10mmol/L 0.5μL)

[0101]DNA样品          50ng(2μL)

[0102]双蒸水           10μL

[0103]LAMP扩增程序：①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。

[0104]3.被检测样品目的LAMP扩增和电泳检查

[0105]LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，阳性结果应是呈梯状分布的条带。且间距为160bp左右(附图，泳道6)，为保证检测的准确性，扩增的产物分别用Bgl I和Xba I进行酶切。

[0106]序列列表

[0107]                       SEQUENCE LISTING

[0108]

[0109]