1.新型抗烟草花叶病毒药剂，其特征在于中文通用名称或代号分别是：苯并噻二唑(BTH)、噻酰菌胺(TDL)、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑(Ribavirin)、宁南霉素(Ningnanmycin)、安托芬(Antofine)、病毒星1号(Virus conquerorl)、病毒星2号(Virus conqueror2)和XY-13、XY-30，其具体的化学结构为：

2.权利要求1所述的BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30中任意2个化合物的组合物用于诱导烟草抗TMV的活性和药效以及这些组合物用于直接防治TMV的活性。

3.权利要求1和权利要求2所述的BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30中任意2个化合物的组合物中有效成分的含量比在0.1％∶69.9％到69.9％∶0.1％之间的任意组合。

4.权利要求1和权利要求2及权利要求3所述的BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30中任意2个化合物的组合物可以配制成粉剂、可湿性粉剂、乳油、颗粒剂和水剂以及这些制剂的加工方法。

5.从离体半叶枯斑法的测定、活体植株法的测定和钝化活性的测定及诱导活性测定的完整体系系统的评价新化合物诱导活性和抗病毒活性的筛选体系。

6.不同作用方式的抗病毒化合物之间生物活性筛选方法和评价方法。

技术领域

[0001]本发明的技术方案涉及包含具有抗烟草花叶病毒活性的组合物，具体涉及目前发现的抗烟草花叶病毒高活性化合物之间的互作组合物及其配方组成，以及这些组合物用于烟草花叶病毒的防治。

背景技术

[0002]植物病毒病是“植物癌症”，其危害仅次于真菌病害，全世界每年仅由烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)造成的损失就达1亿美元以上(Bos L.100years of virology：from vitalism viamolecular biology to genetic engineering.Trends in microbiology，2000，8(2)：82-87)。由于病毒在植物细胞中专性寄生，其复制所需的物质、能量和场所完全依赖寄主，且植物没有完整的免疫代谢系统，使得植物病毒病的防治尤为困难。农业措施(轮作、倒茬、选用抗性品种及种子脱毒处理等)可以预防病毒病害的发生，利用病毒间的交叉保护选用弱毒株系和卫星RNA等生物制剂可干扰病毒的侵染和增殖，抗病毒基因的转基因植物为人类征服病毒病害也提供了新的途径(Whitham S A and Wang Y Z.Roles for host factors in plant viral pathogenicity.Current Opinion inPlant Biology，2004，7：365-371；李在国，黄润秋.植物病毒防治剂的作用机制.植物保护，1999，3：37-39)，杀虫剂可控制病毒的传播媒介。但这些措施无论是单独应用还是综合应用都不能有效地克服病毒病造成的危害。为了开发理想的抗植物病毒药剂，化学科学工作者进行了许多的定向合成和筛选尝试，但至今没有开发出像杀虫剂和除草剂以及杀菌剂等类似的高效而环境友好的抗病毒剂，如果说有，也没有象常规农药那样在品种上丰富。

[0003]目前发现的具有抗病毒活性的化学合成的化合物主要包括：杂环类化合物、核苷酸、生物碱、取代苯、醛及其缩合物、有机磷、氨基酸衍生物、维生素、植物激素、抗生素等，但真正应用于农田生产的并不多，已开发成功并具有实用价值的抗植物病毒剂有DADHT、DHT、病毒唑、菌毒消等，但它们的大田防治效果一般低于60％。有关天然源抗植物病毒的研究仅仅局限在室内，极少部分有活性的物质在实际中得到应用，植物源的抗病毒物质主要有商陆、印度的苦棣树(Azadirachta indica)、紫茉莉(Jasminum sambacum)、夏弗塔雪轮(Sileneschafta)、麝香石竹(Dianthus caryophyllus)、苋色藜(Chenopodium amaranticolor)、菠菜及甜菜等许多藜科植物的压出液、草莓、天竺葵(Largonium bortorum)、曼陀罗(Datura stramonium)、洋葱(Allium cepa)、水茄(Solanum torvam)、阿拉伯相思树(Acacia arabica)、石榴、萄萄、百日草、红花、番茄、麦仙翁(Agrostemma githago)、苔藓植物泥炭藓(Sphagnum compaclum)、蕨类植物(Ampeloplerisprolifera)、连翘(Forsythia suspensa Vahl)、大黄(Rheum of ficinaleBaill)、板蓝根(Isatis tinctora L.)、小藜(Chenopidium serotinum)、玉簪(Hosta plantaginea)、贯众、金银花、槟榔、薄荷、蒲公英、茵陈、柴胡、鱼腥草、马齿笕、黄苓、穿心莲、萝摩、香菇、地锦、大豆、紫草等中草药。有研究发现植物病毒压出液若被细菌污染后很快丧失侵染力，从此开始了微生物源抗病毒物质的研究，已发现，软腐细菌、红酵母、玉米枯萎杆菌、枯草芽抱杆菌、产气杆菌、根瘤菌、酵母菌、粉霉(Trichothecium roseum)和红霉(Neurospora sitophila)、赤霉菌、穗孢青霉、黑足根霉、菜豆炭疽菌、褐腐核菌等的代谢产物，香菇菌(Lentunus edodes)、木耳(Auricularia auricula)、银耳(Tremella fuciformis)、洋蘑菇(Agaricus campestris)、金钱菌的培养物；放线菌诺卡氏茵产生的诺卡霉素(noformycin)可减少TMV的繁殖，熏衣草链霉菌的代谢产物全霉素(holomycin)和灭瘟素(blasticdin S)、放线菌酮(cycloheximide)、间型霉素B(tormycinB)、比奥罗霉素(bihoromycin)、月佳霉素(laurusin)、庆大霉素(gentamicin)、多氧霉素(povamycin)、卡那霉素(kanamycin)、丝裂霉素(mitomycin)、奈良霉素(naramycin)、杀结核菌素(tubercidin)、道诺霉素(daunomycin)、光神霉素(mithramycin)等对植物病毒病均有一定的效果。海洋天然产物如海藻、海绵、腔肠动物、苔藓动物、被囊动物、棘皮动物、软体动物、鱼类等海洋动物中已发现抗动物病毒的物质，但抗植物病毒的研究较少。其它如植物激素和无机盐等也具有抗植物病毒的活性(李在国，黄润秋，杨华铮等.化学合成植物病毒抑制剂研究进展.农药，1998，37(5)：3-6；金林红，宋宝安，杨松，等.天然产物抗植物病毒剂国内外研究进展.农药，2003，42(4)：10-12；江山，博士学位论文，中国农业大学图书馆，1994)。

[0004]表1  具有抗病毒化合物的化学结构



[0005]我国对抗植物病毒药剂的需求和开发一直受到相当的关注，近年来发现的具有高活性的抗植物病毒药剂主要有安托芬及其衍生物和宁南霉素，以及联三唑化合物和病毒星。宁南霉素是从诺尔斯链霉菌西仓变种Streptomyces noursei var.xichangemsis发酵液中分离出的胞嘧啶核苷肽型抗生素(表1)(向固西，胡厚芝，陈家任等.一种新的农用抗生素---宁南霉素.微生物学报，1995，35(5)：368-374)，生物活性的研究表明，50μg·mL-1到200μg·mL-1的宁南霉素对TMV、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PYV)的防效为69.4％到95.4％(胡厚芝，向固西，陈家任等.宁南霉素防治烟草花叶病的研究.应用与环境生物学报，1998，4(4)：390-395)。

[0006]安托芬(antofine)是从牛心朴子草中分离得到的生物碱，其生物总碱在50μg·mL-1浓度对烟草枯斑的抑制率达到70-80％(An T Y，Huang R Q，Yang Z et al..Alkaloids from Cynanchumkomarovii with inhibitory activity against the tobacco mosaic virus.Phytochemistry，2001，58：1267-1269；姚宇澄，安天英，高俊等.牛心朴子草植物农药的化学成分与生物活性研究.有机化学，2001，21(11)：1024-1028)，有关牛心朴子草提取液及其抗病毒活性的应用已经申请专利并于2004年获得授权(李广仁，安天英，杨炤，等.中华人民共和国国家发明专利，ZL00106234.4)，其提取液的主要活性成份是菲并吲哚里西啶生物碱7-脱甲氧基娃儿藤碱(R-(-)-antofine，安托芬)，其化学结构见表1。半叶枯斑法测定结果表明，该类物质对TMV、马铃薯Y病毒(PVY)和芜菁花叶病毒(TUMV)呈现高活性，用酶联免疫法(ELASA)测得其对TUMV的最佳浓度防效与枯斑法测定结果基本相符，其活性物质在1μg·mL-1浓度下对烟草花叶病毒的抑制率仍高达60％(姚宇澄，杨炤，高俊等.牛心朴子草抗植物病毒组分的生物活性研究.内蒙古工业大学学报，2002，21(1)：1-4)，发明人的研究结果发现，该类提取物在室内的抗病毒活性比文献报道的任何已商品化的抗植物病毒药剂(如病毒A、病毒唑、DADHT和DHT)的活性高出1-2个数量级(表2)，是目前发现的最好的抗植物病毒的药剂。

[0007]表2  安托芬抗烟草花叶病毒活性的比较研究结果(半叶法)

[0008]化合物  浓度/μg·mL-1  抑制率/％  化合物 浓度/μg·mL-1  抑制率/％ R-(-)-antofine  1  60  病毒唑  500  40～50 R-(-)-antofine  10  65  DADHT  500  50 R-(-)-antofine  50  80  DHT  500  50

[0009]联三唑类抗病毒化合物是最近在进行点击化学的研究过程中发现的，由叠氮与炔烃生成1，2，3-三唑的Huisgenl，3-偶极环加成反应是一个最典型的点击化学反应，武汉大学通过Huisgen反应合成了一系列新型联三唑化合物，本发明的发明人发现2个联三唑化合物对烟草花叶病毒有较好的抑制效果(Yi Xia，Zhijin Fan，Jianhua Yao，et al.，Discovery of bitriazolylcompounds as novel antiviral candidates for combating the tobacco mosaic virus.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2006，16(10)：2693-2698)，由于这类联三唑化合物不仅制备简单、价廉，而且可直接抑制烟草花叶病毒的活性，因而是一个优秀的抗植物病毒药物先导化合物，现已申请中华人民共和国国家发明专利(曲凡歧，夏熠，范志金，等，联三唑化合物及其制备方法和用途，中华人民共和国国家发明专利，公开号：CN1687059A，公开日期：2005年10月26日；曲凡歧，范志金，夏熠，等，联三唑化合物及制备方法和用途，中华人民共和国国家发明专利，公开号：CN1803780A，公开日期：2006年7月19日)，这类化合物的结构通式见表1，部分化合物对TMV的抑制率见下表3。

[0010]表3  部分联三唑化合物抗烟草花叶病毒的活性(浓度500μg/mL)

[0011]化合物  抗TMV效果％  化合物  抗TMV效果％ 1a  35  1d  75±11 1b  23  1e  15 1c  17  1f  63±5 病毒唑  30  病毒唑  30

[0012]α-氨基膦酸及其酯作为天然氨基酸的类似物于20世纪50年代末从动物体内分离得到，其生物活性包括抗肿瘤活性、抗植物病毒、植物生长调节、除草、杀菌、抑制酶活性、抗氧化及防辐射、破坏生物细胞膜等受到关注，α-氨基膦酸酯上与磷原子相连的2个烷氧基不同、α位碳原子以及氨基上取代基的不同其生物活性的差异很大，近年来受性原子的引入受到了重视。贵州大学对α-氨基膦酸酯进行了系统的结构优化，将氟原子引入这类分子中，发现部分化合物具有很好的抗烟草花叶病毒活性(宋宝安，吴扬兰，黄荣茂，具有农用抗植物病毒活性的含氟α-氨基烷基膦酸酯及其合成，公开号：CN1432573，公开日期：2003年07月30日；宋宝安，张国平，胡德禹，等，N-取代苯并噻唑基-1-取代苯基-O，O-二烷基-α-氨基膦酸酯类衍生物及制备方法和用途，公开号：CN1687088，公开日期：2005年10月26日)，其中病毒星1号正在商品化的进程中，另一个衍生物也具有很好的抗TMV活性(结构通式见表1)。

[0013]本发明的发明人已建立了植物抗病激活剂诱导烟草抗TMV活性的筛选体系和测定方法的标准操作规程(SOP)，该体系得到了系统的验证，并对目前发现的具有诱导活性的先导化合物BTH和TDL进行结构衍生(范志金，刘凤丽，刘秀峰，等，苯并噻二唑衍生物及其合成方法和诱导抗病活性的筛选，中华人民共和国国家发明专利，公开号：CN1680342A，公开日期：2005年10月12日；范志金，石祖贵，刘秀峰，等，新型[1，2，3]噻二唑衍生物及其合成方法和用途，中华人民共和国国家发明专利，公开号：CN1810808A.公开日期：2006年8月2日)。苯并[1，2，3]-噻二唑-7-硫代羧酸甲酯(又名苯并噻二唑，活化酯，BTH)是在研究开发磺酰脲除草剂时发现该化合物能激发植物产生系统获得抗病性的它在离体条件下对晚疫菌(Phttophthora infestant)、交链孢菌(Alternaria)、黑粉菌(Smut fungus)等无任何直接的杀菌活性，但却能诱导水稻、小麦、烟草等多种植物的内部免疫机制，起到对霜霉病(Peronosporaparasitica)、晚疫病(Late blight)、稻瘟病(Blast fungus)等病原菌的广谱的系统防治作用(Kunz W，Staub T，Mtraux J P，et al.Method for protecting plants against diseases.US 4968344，1990-11-06)。噻酰菌胺即[1，2，3]-噻二唑-5-甲酰胺类化合物(3’-氯-4，4’-二甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酰苯胺)(TDL)是日本科学家发现的具有很好杀菌活性的化合物(Tsubata K，Sanpei O，Takagi K，et al.Thiadiazole carboxamide derivative，plant disease controlling agent，and method of using the same.WO 9923084，1999-05-14)，该化合物及其中间体[1，2，3]-噻二唑-5-甲酸都能诱导烟草植株抗性基因的表达并产生对TMV的抗性(表1)(Yasuda M，Kusajima M，Nakajima M，et al..Thiadiazolecarboxylic acid moiety of tiadinil，SV-03，induces systemic acquired resistance in tobacco withoutsalicylic acid accumulation.J.Pestic.Sci.，2006，31(3)：329-334)。另外，β-氨基丁酸(BABA)也是具有诱导活性的物质，其化学结构见表1，它是一种由番茄根系分泌的非天然的、非蛋白质氨基酸，对病原菌无离体的直接的杀菌作用，但可保护豌豆免受卵菌纲病原菌根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches Drechsler)的侵染，根腐丝囊霉(A.euteiches)接种前3天用100mg/LBABA灌根处理豌豆，发现植物表现出很好的抗病活性(鲍丽丽，刘凤丽，范志金，具有植物诱导抗病活性的先导化合物及其结构修饰，农药学学报，2005，7(3)：201-209)。

[0014]为了充分发挥现有抗病毒药剂的作用，有效利用现有的抗病毒药剂，给先导结构的优化和药剂的推广使用以及我国新型、高效、低毒的抗植物病毒药剂的研究开发提供的理论指导，发明人在国家自然科学基金(批准号：20672062和30270883)和国家重点基础研究发展计划“973”项目(批准号：2003CB114402)及天津市科技发展计划和元素有机化学国家重点实验室开放基金(0602和0702)的资助下对这些药剂的互作对TMV的影响进行了系统的研究，并对上述药剂进行了诱导活性和直接抗病毒活性以及联合毒力作用的研究，发现了部分具有理论意义和实际应用价值的研究结果。

[0015]本发明的目的

[0016]本发明的目的是：提供新型抗烟草花叶病毒化合物组合物的组成和加工方法以及这些制剂用于烟草花叶病毒的防治和诱导烟草植株抗烟草花叶病毒。

[0017]本发明的内容

[0018]本发明所要解决的技术问题是：提供BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑(Ribavirin)、宁南霉素(Ningnanmycin)、安托芬(Antofine)、病毒星1号(Virus conquerorl)、病毒星2号(Virus conqueror2)和XY-13、XY-30之间二元复配制剂，评价复配制剂对TMV的防治效果。这些二元组合物可以与常规助剂加工出抗植物病毒的复配制剂，复配制剂的生物活性可以利用规范化的生物活性测定和评价方法加以确定，生物活性主要包括这些组合物的诱导活性和直接的抗病毒效果。

[0019]本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：选择BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸、DL-β-氨基丁酸、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30为研究对象，分别进行离体半叶枯斑法测定、活体活性的测定和钝化活性的测定以及诱导活性的测定，系统评价各药剂的抗病毒活性和诱导活性，最后进行药剂之间互作效果的测定和配方的确定以及加工方法的探索。

[0020]I.半叶枯斑法生物活性的测定

[0021]按所需浓度称量供试化合物，加入50μL二甲基甲酰胺(DMF)使其溶解，兑入含有微量表面活性剂土温80的双蒸水，配成不同浓度的溶液。用磷酸缓冲液将TMV病毒粗提液稀释至10μg/mL，摩擦接种于撒有500目金刚砂的适龄珊西烟(Nicotinana tabacum Xanthi-NC)：TMV枯斑寄主烟草叶片，接种后立即用清水冲洗叶片。待叶面完全干后，剪下，并沿主叶脉把叶片剪成两半，左右半叶分别浸入供试化合物溶液和清水中(处理和空白对照)。30分钟后取出，置于搪瓷盘中，控制温度在24±1℃，并在光照下保湿培养，使病毒与药液、寄主叶片组织同时接触，3天后观察其产生枯斑数量，记录发病情况。按下式计算出供试化合物对TMV的直接相对效果，每一处理重复3次，除空白对照外，还设计标准药剂处理对照。按下式计算枯斑抑制率：

[0022] X = CK - A CK × 100

[0023]其中：X为化合物对TMV的直接抑制率或相对效果，单位：％

[0024]CK为清水对照半叶的平均枯斑数，单位：个

[0025]A为药剂处理半叶的枯斑数，单位：个。

[0026]II.活体植株法生物活性的测定

[0027]在珊西烟(Nicotinana tabacum Xanthi-NC)：TMV枯斑寄主烟草叶长到8-10片真叶时打顶处理，保留第5至第8片真叶，整株喷施不同浓度的待测药剂，置于24±1℃的温室中培养24小时后，在叶片表面均匀撒布500目金刚沙后，摩擦接种10μg/mL TMV，接种后立即用清水冲洗叶片，以双蒸水为对照，在24±1℃下培养72小时后，统计枯斑数目，按下式计算枯斑抑制率：

[0028] X = CK - A CK × 100

[0029]其中：X为化合物对TMV的直接抑制率或相对效果，单位：％

[0030]CK为清水对照半叶的平均枯斑数，单位：个

[0031]A为药剂处理半叶的枯斑数，单位：个。

[0032]III.钝化作用的测定

[0033]体外钝化：将1000μg/mL抗病毒药液与10μg/mLTMV混合，对照用双蒸水与TMV混合，在室温下放置24小时后，摩擦接种。置于温度为24±1℃，相对湿度60％的温室中培养72小时后，按照活体植株法进行枯斑统计和枯斑抑制率的计算。体内钝化：待处理的烟苗在叶片表面均匀撒布500目金刚沙后，摩擦接种10μg/mL TMV后，在1-1.5小时内喷施不同的抗病毒药剂，对照喷施双蒸水。置于温度为24±1℃，相对湿度60％的温室中，72小时后，按照活体植株法进行枯斑统计和枯斑抑制率的计算。

[0034]IV.诱导抗病活性的测定

[0035]将苗龄一致的普通烟，3盆为一组，分别于接种前7天前处理过的烟苗，处理方式包括：喷施供试化合物溶液2到3次，每次20mL，或灌根处理烟苗2到3次，每次20mL，第7天于新长出的烟叶上摩擦接种TMV，将烟苗置于其生长适宜温度及光照下培养3天后，检查发病情况，综合病斑数目按下式计算出供试化合物对TMV的诱导抗病毒效果，每一处理设3次重复，对照分空白对照和标准药剂处理对照2种。

[0036] R = CK - I CK × 100

[0037]其中，R为新化合物对烟草抗TMV的诱导效果，单位：％

[0038]CK为清水对照叶片的平均枯斑数，单位：个

[0039]I为经化合物诱导处理后叶片的平均枯斑数，单位：个。

[0040]V.双剂法生物活性的测定

[0041]在珊西烟(Nicotinana tabacum Xanthi-NC)：TMV枯斑寄主烟草叶长到8-10片真叶时，打顶处理，保留第5片至第8片真叶，将2.5mLA药剂(1000μg/mL)+2.5mL B药剂(1000μg/mL)混匀后喷洒于珊西烟的叶片，对照喷双蒸水，置于24±1℃的温室中培养24小时后在叶片表面进行全叶摩擦接种10μg/mL TMV病毒液，接种后立即用清水冲洗叶片。在24±1℃温室中培养72小时后，进行枯斑数目统计，按照活体植株法进行枯斑统计和枯斑抑制率的计算。

[0042]VI.抗病毒药剂互作各制剂的加工

[0043]BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30复配制剂加工过程可用与农业上常用的表面活性剂如十二烷基硫酸钠或木质素磺酸钠等混合，也可以与渗透剂、稳定剂、溶剂、助溶剂和增效剂等合并使用，载体可以是液体(水和甲苯等)或固体高岭土和硅藻土，加工后的制剂药效稳定，制剂本身稳定性合格；上述化合物中任意2个化合物的组合物的质量百分比可以是0.1％∶69.9％到69.9％∶0.1％之间的任意组合，这些组合物可以加工成粉剂、可湿性粉剂、乳油、颗粒剂和水剂。其冷热储存稳定性按照农业部的方法进行并以生物测定方法确定。

[0044]本发明的有益效果是：BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30为目前发现的具有各种作用方式的抗植物病毒药剂的化合物，这些化合物单独的抗病毒活性已经有报道，但是BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、宁南霉素具有诱导烟草抗TMV的活性，它们之间进行组合用于诱导烟草抗TMV以及这些药剂分别与病毒唑、安托芬、病毒星1号和病毒星2号和XY-13、XY-30组合进行抗植物病毒的活性均未见文献报道，本发明成功进行了这些组合物用于TMV的控制。本发明还在已建立的科学合理和规范化的植物抗病激活剂生物活性筛选和评价体系的基础上成功进行了具有诱导活性的化合物与直接抗病毒化合物之间的生物活性筛选和评价；同时，本发明从离体半叶枯斑法的测定、活体植株法的测定和钝化活性的测定以及诱导活性测定的完整体系系统的评价了目前发现的具有高抗病毒活性的化合物；最后本发明针对具有不同理化性质的药剂之间选择适当的剂型进行了药剂之间互作组合物加工方法的探索，有的组合物中加入了稳定剂，有的组合物利用有效成分之间性质的差异得到了自身剂型的稳定，如BABA和安托芬以及4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸和安托芬之间的组合。

[0045]本发明将通过特定生物活性测定实施例更加具体地说明BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30的抗病毒作用方式和及其互作组合物体的加工方法和抗TMV的生物活性，但所述实施例仅用于具体的说明本发明而非限制本发明，尤其是其互作组合物的生物活性仅仅是举例说明，而不是限制本专利，具体的实施方式如下：

[0046]实施例1 

[0047]半叶枯斑法生物活性测定结果

[0048]按照前述方法进行半叶枯斑试验，测定结果见表4，表4可见，BTH、TDL和4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸及DL-β-氨基丁酸没有任何直接抗TMV活性，仅在1000μg/mL时有30％左右的效果；病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30具有抗病毒的活性，安托芬对TMV侵染的抑制作用最好，对照药剂病毒唑的作用的最差；安托芬的离体效果最好，高于宁南霉素，XY-13和XY-30的效果高于病毒星。

[0049]表4  抗病毒剂对病毒侵染的抑制效果(离体法)(％)

[0050] 药剂浓度/μg/mL  0.5  1  5  10  25  50  100  250  500  1000  BTH  ND  ND  ND  ND  ND  ND  16  30  36  37  DL-β-氨基丁酸  ND  ND  ND  ND  ND  ND  6  0  7  0  TDL  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND  10  13  22  4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸  ND  ND  ND  ND  ND  ND  ND  18  15  24  病毒唑  ND  ND  ND  ND  ND  ND  2  26  33  33  宁南霉素  ND  ND  ND  ND  ND  ND  22  39  43  71  安托芬  44  48  95  97  96  96  97  ND  ND  ND  病毒星1号  ND  ND  ND  ND  ND  ND  14  1 5  21  22  病毒星2号  ND  ND  ND  ND  ND  ND  11  24  32  38  XY-13  ND  ND  ND  ND  ND  ND  24  33  57  58  XY-30  ND  ND  ND  ND  ND  ND  22  40  60  66

[0051]ND：未测定(如果测定没有实际应用价值)

[0052]实施例2

[0053]活体植株法生物活性测定结果

[0054]按照前述方法进行活体植株测定，各药剂对活体TMV的抑制作用的测定结果见表5和图1-图4，测定结果表明，商品化的植物诱导抗病激活剂BTH对TMV侵染珊西烟的活体抑制效果最好，1000μg/mL时抑制率高达68％，31.3μg/mL时抑制率达到59％，TDL和4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸以及DL-β-氨基丁酸在高浓度下也不表现出活体的活性，这与其诱导抗病效果的部分发挥有密切的关系；病毒星系列中病毒星1号效果较差，1000μg/mL时抑制率仅为24％，62.5μg/mL时没有抗病毒的效果；XY系列中XY-30的效果最差，1000μg/mL时仅为18％；1000μg/mL时，参照药剂病毒唑的抑制率52％，宁南霉素和XY-13的效果要好于病毒唑，抑制率分别为68％和61％，但是安托芬的效果比病毒唑要差，抑制率为40％。

[0055]表5  抗病毒剂对病毒侵染的抑制效果(活体法)(％)

[0056] 浓度/药剂μg/mL  31.3  62.5  125  250  500  1000  BTH  59  64  64  64  66  68  DL-β-氨基丁酸  ND  ND  ND  5  9  10  TDL  ND  ND  35  38  47  45  4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸  ND  ND  30  25  39  43  病毒唑  23  30  37  43  44  52  宁南霉素  23  26  28  51  53  68  安托芬  28  33  34  36  37  40  病毒星1号  0  0  5  9  17  24  病毒星2号  26  27  28  32  34  34  XY-13  ND  ND  12  25  46  61  XY-30  ND  ND  8  14  22  18

[0057]ND：未测定(如果测定没有实际应用价值)

[0058]实施例3

[0059]钝化作用的测定效果

[0060]按照前述方法进行钝化作用的测定，各药剂对TMV侵染的体外钝化结果见表6，从表中可以看出，BTH和宁南霉素以及XY-30对TMV有很好的体外钝化效果，而病毒唑、安托芬、XY-13和病毒星系列以及TDL、TDLA和BABA对TMV几乎无体外钝化作用，各药剂体外钝化作用测定的部分结果见图5-图8。各药剂对TMV侵染的体内钝化结果见表6，从表6中可见，宁南霉素以及XY-30仍然有较好的体内钝化效果，而BTH、TDL、病毒唑、安托芬和XY-13也表现出一定的体内钝化效果，病毒星系列的体内的钝化作用最差。各药剂体内钝化测定的部分结果见图9-图12。

[0061]表6抗病毒剂的钝化结果(％)

[0062] 药剂  浓度μg/mL  体外钝化  体内钝化  药剂 浓度μg/mL  体外钝化  体内钝化  BTH  1000  88  44  安托芬 1000  21  57  TDL  1000  35  40  病毒星1号 1000  0  3  TDLA  1000  22  29  病毒星2号 1000  30  34  BABA  1000  0  25  XY-13 1000  26  68  宁南霉素  1000  81  76  XY-30 1000  66  71  病毒唑  1000  13  45

[0063]实施例4

[0064]诱导活性的测定效果

[0065]按照前述方法进行活体诱导活性的测定，实验结果见表7，BTH、TDL和4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸以及DL-β-氨基丁酸具有诱导烟草植株抗TMV的活性，BTH在100μg/mL时就有很好的诱导活性，达90％以上，TDL和4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸以及DL-β-氨基丁酸仅在500μg/mL以上才有较好的诱导活性，诱导活性为50％左右，宁南霉素在高浓度下有一定的诱导活性；而病毒唑、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30没有诱导活性。

[0066]表7  几种化合物诱导烟草抗TMV的效果(诱导活性活体法)(％)

[0067]浓度/药剂μg/mL  31.3  62.5  125  250  500  1000 BTH  56  90  96  98  100  100 DL-β-氨基丁酸  ND  ND  20  35  50  60 TDL  ND  ND  28  30  42  66 4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸  ND  ND  12  27  49  58 病毒唑  ND  ND  5  8  17  24 宁南霉素  23  26  25  34  41  55 安托芬  7  7  10  22  15  27 病毒星1号  ND  ND  0  10  23  18 病毒星2号  ND  ND  0  7  16  21 XY-13  ND  ND  0  8  0  24 XY-30  ND  ND  0  0  17  19

[0068]ND：未测定(如果测定没有实际应用价值)

[0069]实施例5

[0070]双剂法生物活性测定结果

[0071]按照前述方法进行药剂互作对TMV侵染活性的测定，实验几种抗病毒药剂互作对TMV的活性测定结果见表8，BTH、TDL和4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸以及DL-β-氨基丁酸之间的互作具有增效作用，BTH、TDL和4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸及DL-β-氨基丁酸与其他药剂之间的互作也具有一定的增效作用。如具有诱导抗病活性的化合物与BTH组合基本表现了BTH的效果，其抗病毒活性最高；而病毒唑、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30之间的组合基本表现相加活性，例如，安托芬与这几个药剂的组合效果均高于其他药剂单独作用的效果，宁南霉素混剂组合和安托芬混剂组合等的增效幅度知最高；病毒星系列混剂组合和XY系列混剂的组合仅有相加作用；部分活性测定的结果见图13-图19。

[0072]表8  几种药剂互作对TMV侵染的影响(1000μg/mL+1000μg/mL，1∶1/υ∶υ)(％)

[0073] 药剂  BTH  TDL  TDLA  BABA  病毒唑  宁南霉素  安托芬  病毒星1号  病毒星2号  XY-13  XY-30  BTH  98  TDL  95  66  TDLA  92  60  58  BABA  96  54  62  60  病毒唑  73  56  47  41  52  宁南霉素  95  60  66  58  74  68  安托芬  86  92  85  75  70  77  80  病毒星1号  73  50  42  55  57  83  87  24  病毒星2号  88  54  48  52  84  83  86  34  34  XY-13  44  45  51  47  32  83  63  74  13  61  XY-30  82  52  57  62  21  92  71  71  42  42  18

[0074]实施例5

[0075]抗病毒药剂互作各制剂的加工方法

[0076]BTH、TDL、4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(TDLA)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、病毒唑、宁南霉素、安托芬、病毒星1号、病毒星2号和XY-13、XY-30复配制剂有效成分的组成为2元化合物为质量百分比在0.1％∶69.9％到69.9％∶0.1％之间的任意组合，加工过程可用与农业上常用的表面活性剂如十二烷基硫酸钠或木质素磺酸钠等混合，也可以与渗透剂、稳定剂、溶剂、助溶剂和增效剂等合并使用，载体可以是液体(水和甲苯等)或固体高岭土和硅藻土，具体组成见表9。

[0077]实施例6

[0078]抗病毒药剂互作各制剂的稳定性

[0079]将上述制剂进行冷储试验，液体制剂在0±2℃放置1周无沉淀析出，固体制剂在54±2℃放置2周，药剂不出现结块现象，所有制剂储存放置前后的药剂药效无显著差异，说明药剂稳定性合格。

[0080]表9  抗病毒化合物的互作组合物加工方法

[0081]组成  总含量(％)  助溶剂  表面活性剂 抗冻剂 稳定剂 补足100％ BTH+TDL  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+TDLA  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+BABA  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+病毒唑  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+宁南霉素  1-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+安托芬  0.1-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+病毒星1号  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+病毒星2号  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+XY-l3  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BTH+XY-30  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+TDLA  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+BABA  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+病毒唑  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+宁南霉素  1-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+安托芬  0.1-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+病毒星1号  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+病毒星2号  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+XY-13  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 TDL+XY-30  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BABA+病毒唑  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 BABA+宁南霉素  1-70  2-8  2-10 2-5 3-8 水 BABA+安托芬  0.1-70  2-8  2-10 2-5 3-8 水 BABA+病毒星1号  5-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 BABA+病毒星2号  5-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 BABA+XY-13  5-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 BABA+XY-30  5-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 病毒唑+宁南霉素  1-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 病毒唑+安托芬  0.5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 病毒唑+病毒星1号  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 病毒唑+病毒星2号  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 病毒唑+XY-13  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 病毒唑+XY-30  5-50  2-8  2-10 无 3-8 硅藻土和高岭土 宁南霉素+安托芬  0.1-10  2-8  2-10 2-5 3-8 水 宁南霉素+病毒星1号  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 宁南霉素+病毒星2号  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 宁南霉素+XY-13  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 宁南霉素+XY-30  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 安托芬+病毒星1号  0.1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 安托芬+病毒星2号  0.1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 安托芬+XY-13  0.1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 安托芬+XY-30  0.1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 病毒星1号+病毒星2号  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 病毒星1号+XY-13  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 病毒星1号+XY-30  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 病毒星2号+XY-13  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 病毒星2号+XY-30  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯 XY-13+XY-30  1-50  2-8  2-10 2-5 3-8 甲苯

附图说明：

[0082]附图1BTH和病毒唑对TMV侵染的抑制作用(植株法)

[0083]附图2宁南霉素和安托芬对TMV侵染的抑制作用(植株法)

[0084]附图3病毒星1号和病毒星2号对TMV侵染的抑制作用(植株法)

[0085]附图4XY-13和XY-30对TMV侵染的抑制作用(植株法)

[0086]附图5BTH和病毒唑对TMV的体外钝化作用

[0087]附图6宁南霉素和安托芬对TMV的体外钝化作用

[0088]附图7病毒星对TMV的体外钝化作用

[0089]附图8 XY-13和XY-30对TMV的体外钝化作用

[0090]附图9BTH和病毒唑对TMV的体内钝化作用

[0091]附图10宁南霉素和安托芬对TMV的体内钝化作用

[0092]附图11病毒星系列对TMV的体内钝化作用

[0093]附图12XY-13和XY-30系列对TMV的体内钝化作用

[0094]附图13XY-13+BTH和XY-13+病毒唑对TMV侵染的抑制作用

[0095]附图14XY-13+宁南霉素和XY-13+安托芬对TMV侵染的抑制作用

[0096]附图15XY-13+病毒星1号和XY-13+病毒星2号对TMV侵染的抑制作用

[0097]附图16XY-30+BTH和XY-30+病毒唑对TMV侵染的抑制作用

[0098]附图17XY-30+宁南霉素和XY-30+安托芬对TMV侵染的抑制作用

[0099]附图18XY-30+病毒星1号和XY-30+病毒星2号对TMV侵染的抑制作用

[0100]附图19XY-13+XY-30对TMV侵染的抑制作用