1.一种多肽分子FcGH，其特征在于，所述多肽分子FcGH的结构如下所示：

2.一种FcGHCu纳米制剂，其特征在于，将权利要求1所述的多肽分子FcGH与铜离子混合，调节pH值为7.4后自组装，得到FcGHCu。
3.根据权利要求2所述的FcGHCu，其特征在于，所述多肽分子FcGH与铜离子的摩尔比为1:1。
4.权利要求2或3所述的FcGHCu在制备提高细胞摄取效率试剂中应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞包括小鼠结肠癌CT26细胞和/或小鼠乳腺癌4T1细胞。
6.一种FcGHCu-HCPT纳米制剂，其特征在于，将权利要求1所述的多肽分子FcGH与FcGH-HCPT、铜离子混合，调节pH值为7.4后自组装，得到FcGHCu-HCPT纳米制剂；
所述FcGH-HCPT的结构如下所示：

7.根据权利要求6所述的FcGHCu-HCPT纳米制剂，其特征在于，所述多肽分子FcGH与FcGH-HCPT的摩尔比为9:1。
8.根据权利要求6所述的FcGHCu-HCPT纳米制剂，其特征在于，所述多肽分子FcGH与铜离子的摩尔比为1:1。
9.权利要求6～8任一项所述的FcGHCu-HCPT纳米制剂在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括小鼠结肠癌的皮下肿瘤和/或乳腺癌。

技术领域
[0001]本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种多肽分子FcGH及其纳米制剂FcGHCu、FcGHCu-HCPT的相应应用。
背景技术
[0002]纳米载药系统如聚合物纳米粒、脂质体及胶束等被广泛运用于药物的体内递送。传统纳米制剂的构建方式依赖DSPE-PEG，LNP等两亲性成分，制备步骤繁琐，在工业放大过程中可重复性差(Progress in Pharmaceutical Sciences.2018,42(11):831-837)。如何高效制备集多种作用机制于一身的纳米制剂有利于开发新颖肿瘤治疗方法。共组装是一种新颖的纳米药物制备方式，具有成分简单、制备简便以及重复性好等优势(Theranostics.2023,13(15):5322-5347.)。但由于目前共组装的制备方式较少，因此所形成的纳米结构形貌、功能均较为单一。研究表明，金属离子能够显著影响生物大分子的结构，调节大分子的活性(Int.J.Mol.Sci.2017,18(11),2285)。因此，通过金属离子控制自组装或共组装过程具有广阔的前景。
[0003]此外，金属离子通过各种特定机制引起肿瘤细胞死亡。例如，三价铁离子通过产生致命的活性氧(ROS)和脂质过氧化产物的积累来触发细胞铁死亡(Cell.2012,149,1060–1072.)。铜离子通过诱导硫辛酸化线粒体酶(即二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶(DLAT))聚集而引发铜凋亡，从而导致线粒体应激和细胞能量代谢破坏(Science.2022,375,1254–1261.)。激活这些金属相关途径可激活抗癌药物在细胞内的多重效应，引起免疫原性细胞死亡，以实现有效的癌症治疗。
[0004]基于以上的研究背景，在本专利中我们提出了一类可以高效制备纳米组装体的铜离子诱导方法。通过控制添加铜离子的量，可以精准的控制所形成纳米结构的形貌，并制备相应的纳米制剂。且由于制备简单，因此具有可重复性好、可大规模放大等优势，解决了传统纳米制剂制备过程中需要大型仪器以及制备步骤繁琐等缺点。
发明内容
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种多肽分子FcGH及其纳米制剂FcGHCu、FcGHCu-HCPT的相应应用，所述多肽分子FcGH可以自发组装成纳米纤维，加入等摩尔铜离子，该多肽分子可以组装成均一的纳米颗粒，提高细胞摄取效率，进而制备得到的FcGHCu-HCPT纳米制剂可以诱导细胞内多重通路的激活，抑制肿瘤生长。
[0006]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007]本发明提供了一种多肽分子FcGH，所述多肽分子FcGH的结构如下所示：
[0008]
[0009]本发明还提供了一种FcGHCu纳米制剂，将上述技术方案所述的多肽分子FcGH与铜离子混合，调节pH值为7.4后自组装，得到FcGHCu。
[0010]优选的，所述多肽分子FcGH与铜离子的摩尔比为1:1。
[0011]本发明还提供了上述技术方案所述的FcGHCu在制备提高细胞摄取效率试剂中应用。
[0012]优选的，所述细胞包括小鼠结肠癌CT26细胞和/或小鼠乳腺癌4T1细胞。
[0013]本发明还提供了一种FcGHCu-HCPT纳米制剂，将上述技术方案所述的多肽分子FcGH与FcGH-HCPT、铜离子混合，调节pH值为7.4后自组装，得到FcGHCu-HCPT纳米制剂；
[0014]所述FcGH-HCPT的结构如下所示：
[0015]
[0016]优选的，所述多肽分子FcGH与FcGH-HCPT的摩尔比为9:1。
[0017]优选的，所述多肽分子FcGH与铜离子的摩尔比为1:1。
[0018]本发明还提供了上述技术方案所述的FcGHCu-HCPT纳米制剂在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。
[0019]优选的，所述肿瘤包括小鼠结肠癌的皮下肿瘤和/或乳腺癌。
[0020]本发明的有益效果为：
[0021]本发明设计合成多肽分子FcGH，该多肽分子可以通过两种方式组装：不加铜离子条件下，该分子可以自发组装成纳米纤维；加入等摩尔铜离子，该分子可以组装成均一的纳米颗粒。将FcGH与HCPT偶联的前药FcGH-HCPT以9:1的摩尔比进行共组装，可以获得不同的纳米制剂FcGH0-HCPT和FcGHCu-HCPT。实验结果显示，FcGHCu-HCPT相较于HCPT单药或FcGH0-HCPT摄取效率大大提升，并且产生更强的细胞毒性。对其机制进行探究，本发明发现FcGHCu-HCPT可以诱导细胞内多重通路的激活，例如：铁死亡、铜死亡、凋亡等。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023]图1为所设计的化合物的结构；
[0024]图2为FcGH的LC-MS图谱；
[0025]图3为FcGH-HCPT的LC-MS图谱；
[0026]图4为FcGH与Cu2+在不同比例下的电镜形貌；
[0027]图5为FcGH在加铜和不加铜条件下的动态光散射结果；
[0028]图6为FcGH0与FcGHCu在不同时间下细胞内的分布；
[0029]图7为FcGHCu-HCPT纳米制剂的细胞毒性；
[0030]图8为FcGHCu-HCPT纳米制剂诱导CT26细胞内多重通路的westernblot结果；
[0031]图9为FcGHCu-HCPT诱导CT26细胞免疫原性死亡的共聚焦结果；
[0032]图10为FcGHCu-HCPT在CT26小鼠皮下瘤模型中的肿瘤生长抑制效果；
[0033]图11为FcGHCu-HCPT在4T1小鼠原位模型中的肿瘤生长抑制效果。
具体实施方式
[0034]本发明提供了一种多肽分子FcGH，所述多肽分子FcGH的结构如下所示：
[0035]
[0036]在本发明中，所述多肽分子FcGH的制备方法优选包括以下步骤：采用标准Fmoc的正交策略合成多肽FcGH。详细的合成过程如图6所示。通过HBTU/DIEA将Fmoc-Lys(DDE)-OH、Fmoc-Tyr(Otbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH依次偶联到CTC树脂上，并用体积分数为20％哌啶/DMF去保护。然后，在甘氨酸的N端加入二茂铁。然后，用体积分数为2％NH2NH2/DMF去除赖氨酸侧链上的DDE保护基团30min。随后用HBTU/DIEA偶联Fmoc-His(trt)-OH和Fmoc-Gly-OH，并脱除Fmoc保护。合成完毕后，加入体积分数TFA/TIS/H2O＝95％/2.5％/2.5％的混合物，从树脂中裂解多肽。需要注意的是，强氧化性TFA可以将二茂铁(Fc)氧化为二茂铁鎓盐(Fc+)。因此，应通过饱和抗坏血酸将粗肽还原到还原状态，并呈现绿色到黄色的变化(Fc+到Fc)。纯化过程中采取乙酸铵/乙酸缓冲液。
[0037]本发明还提供了一种FcGHCu，将上述技术方案所述的多肽分子FcGH与铜离子混合，调节pH值为7.4后自组装，得到FcGHCu。在本发明中，所述多肽分子FcGH与铜离子的摩尔比优选为1:1。
[0038]本发明还提供了上述技术方案所述的FcGHCu在制备提高细胞摄取效率试剂中应用。在本发明中，所述细胞优选包括小鼠结肠癌CT26细胞和/或小鼠乳腺癌4T1细胞。
[0039]本发明还提供了一种FcGHCu-HCPT纳米制剂，将上述技术方案所述的多肽分子FcGH与FcGH-HCPT、铜离子混合，调节pH值为7.4后自组装，得到FcGHCu-HCPT纳米制剂；所述FcGH-HCPT的结构如下所示：
[0040]
[0041]在本发明中，所述多肽分子FcGH与FcGH-HCPT的摩尔比优选为9:1。在本发明中，所述多肽分子FcGH与铜离子的摩尔比优选为1:1，调节pH为7.4后，震荡混匀即可获得组装体FcGHCu-HCPT。
[0042]在本发明中，所述FcGH-HCPT的制备方法优选为：将纯化的FcGH粉末10.66mg(0.01mmol)先溶于超干DMF(3ml)中。然后，将NHS活化的HCPT(10-羟基喜树碱)(0.012mmol)溶解于3ml DMF中加入，通过DIEA将混合物的pH调整为8。偶联反应在1h内完成，反应溶液经制备型高效液相色谱直接过滤纯化。
[0043]本发明还提供了上述技术方案所述的FcGHCu-HCPT纳米制剂在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤优选包括小鼠结肠癌的皮下肿瘤和/或乳腺癌。
[0044]为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0045]实施例1
[0046]多肽FcGH的制备
[0047]采用标准Fmoc的正交策略合成多肽FcGH(图1-图3)。通过HBTU/DIEA将Fmoc-Lys(DDE)-OH、Fmoc-Tyr(Otbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH依次偶联到CTC树脂上，并用体积分数20％哌啶/DMF去保护。然后，在甘氨酸的N端加入二茂铁。然后，用2％NH2NH2/DMF去除赖氨酸侧链上的DDE保护基团30min。随后用HBTU/DIEA偶联Fmoc-His(trt)-OH和Fmoc-Gly-OH，并脱除Fmoc保护。合成完毕后，加入体积分数TFA/TIS/H2O＝95％/2.5％/2.5％的混合物，从树脂中裂解多肽。需要注意的是，强氧化性TFA可以将二茂铁(Fc)氧化为二茂铁鎓盐离子(Fc+)。因此，应通过饱和抗坏血酸将粗肽还原到还原状态，并呈现绿色到黄色的变化(Fc+到Fc)。纯化过程中采取乙酸铵/乙酸缓冲液。
[0048]实施例2
[0049]多肽FcGH-HCPT的制备
[0050]用磁力搅拌在玻璃瓶中合成FcGH-HCPT(图4)。将纯化的FcGH粉末10.66mg(0.01mmol)先溶于超干DMF(3mL)中。然后，将NHS活化的HCPT溶解于3ml DMF中并分别加入，通过DIEA将混合物的pH调整为8。偶联反应在1h内完成，反应溶液经制备型高效液相色谱直接过滤纯化。
[0051]实施例3
[0052]纳米制剂FcGH0，FcGHCu，FcGH0-HCPT和FcGHCu-HCPT的制备
[0053]以上的纳米制剂其组装成分和方式如下表1：
[0054]表1自组装制剂的配方及组装方式
[0055]
[0056]以上纳米制剂的的具体制备步骤如下：自组装是通过自发组装的方式进行的，将多肽溶液在室温下放置2天后，多肽会自发组装成纳米结构；铜离子诱导组装是通过加入与FcGH等摩尔的Cu2+之后，将pH调节至7.4后混匀即可获得。
[0057]实施例4
[0058]动态光散射和透射电镜检测FcGH0和FcGHcu的生成过程
[0059]采用动态光散射(DLS)检测FcGH分子在不同条件下体系内的衍生计数率，从而判断纳米结果的生成过程。结果显示，在未加铜离子的情况下，FcGH的衍生计数率可在2天内升高至2997.9±144.51266kcps，即自发形成FcGH0纳米结构，透射电镜显示结构为未蠕虫状纳米纤维；在加入铜离子的情况下，加入瞬间衍生计数率即升高至3832.5±145.6kcps，说明立即形成FcGHCu纳米结构，透射电镜显示结构为纳米颗粒(图4和图5)。
[0060]实施例5
[0061]FcGH0与FcGHCu的细胞摄取效率
[0062]在共聚焦皿中分别接种1*105个CT26和4T1细胞。分别用FcGH0-FITC(FITC含量为40μM)和FcGHCu-FITC(FITC含量为40μM)处理细胞2h、4h、6h和8h后，用溶酶体探针对细胞进行染色。通过共聚焦显微镜观察，本发明观察到FcGH0与FcGHCu具有不同的CT26细胞和4T1细胞摄取效率。其中，FITC标记的FcGHCu可以在2h以内就大量进入细胞，并在6h后，导致溶酶体破坏而逃逸。而FITC标记的FcGH0则在6h仍然不能明显进入细胞。这说明FcGHCu具有更高的入胞效率(图6)。
[0063]实施例6
[0064]FcGHCu-HCPT纳米制剂诱导多重细胞死亡方式
[0065]在HCPT浓度为50μM时，FcGHCu-HCPT、FcGH0-HCPT、HCPT组处理CT26细胞后的细胞存活率分别为：14.8％，26.4％和23.8％(图7)。并且，FcGHCu-HCPT处理的细胞表现出不同的死亡形态以及分子特征，主要表现在释放HMGB1、HSP70和ATP到细胞外；而细胞核的HMGB1减少，细胞内的CRT蛋白转移到细胞表面(图8)。根据以上现象，推测这是一种免疫原性的死亡方式。将5×105CT26细胞接种于6个孔板。细胞贴壁后，分别用1mL HCPT(10μM)、FcGH0(100μM)、FcGHCu(100μM)、FcGH0-HCPT(FcGH-HCPT剂量＝10μM)和FcGHCu-HCPT(FcGH-HCPT剂量＝10μM)处理细胞12h。收集细胞进行WB实验，发现FcGHCu-HCPT处理的细胞剪切的caspase-3上升、GPX4下降；DLAT蛋白出现寡聚化(图9)。因此，判断这种死亡方式是由多种通路引起的，主要包括铜死亡、铁死亡和凋亡等。
[0066]实施例7
[0067]FcGHCu-HCPT纳米制剂可在体内抑制肿瘤生长
[0068]将CT26细胞皮下注射于背后部位，待肿瘤生长至50-100mm3后，构建皮下肿瘤模型。分别静脉注射50μL生理盐水、HCPT、FcGH0、FcGHCu、FcGH0-HCPT、FcGHCu-HCPT。14天后，各组的肿瘤平均体积分别为：1610，1451.6，1179.9，697.8，877.4和123.8mm3；其中，相对于生理盐水组，FcGH0、FcGHCu、FcGH0-HCPT、FcGHCu-HCPT处理后肿瘤的生长抑制率分别为：9.8％，26.7％，56.6％,45.5％和92.3％(图10)。通过流式细胞仪的检测，发现小鼠体内的DC细胞被显著激活而成熟。通过组织切片的免疫染色可以看出，肿瘤部位存在大量的CD4+T细胞和CD4+T细胞的浸润。
[0069]将4T1细胞皮下注射于雌鼠皮下乳房垫，待肿瘤生长至50-100mm3后，构建乳腺癌原位模型。分别静脉注射50μL生理盐水、HCPT、FcGH0、FcGHCu、FcGH0-HCPT、FcGHCu-HCPT。14天后，肿瘤的平均体积分别为：1053.6，719.4，693.1，542.9，571.4和137.3mm3。其中，相对于生理盐水组，HCPT、FcGH0、FcGHCu、FcGH0-HCPT、FcGHCu-HCPT处理后肿瘤的生长抑制率分别为31.7％，34.2％,48.4％,45.7％,86.9％(图11)。
[0070]由以上实施例可以得出，本发明设计了一种名为FcGH的短肽。FcGH可以通过两种不同的途径进行自组装:自发自组装和Cu2+诱导自组装。通过控制Cu2+的加入量，这两种组装途径可以形成可调节的组装体形态。由Cu2+诱导自组装形成的纳米颗粒比自发形成的蠕虫状纤维具有更高的细胞摄取效率。此外，这种Cu2+诱导的组装过程在Cu2+与FcGH的摩尔比为1:1时发生。通过与FcGH偶联的10-羟基喜树碱(HCPT)共组装，Cu2+诱导的超分子纳米药物FCGHCu-HCPT引起癌细胞的多种细胞死亡模式，提高免疫原性，与游离HCPT相比，增强了治疗效果。这项工作强调了Cu2+诱导的自组装作为指导纳米药物组装和协同肿瘤治疗的有效工具。
[0071]尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。