1.一种靶向根除耐药幽门螺杆菌（H. pylori）的多功能级联纳米酶（FPB-Co-Ch NPs），其特征在于，包括以新型普鲁士蓝类似物（FPB NPs）为核心，包覆Co3O4纳米粒子，最外修饰有壳聚糖涂层。
2.根据权利要求1所述的一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶（FPB-Co-Ch NPs），其特征在于，所述新型普鲁士蓝类似物（FPB NPs）为铁氰化钾和1,1-二茂铁甲酸在酸性环境合成的一种全新的普鲁士蓝类似物，其利用了创新性的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在稀盐酸溶液(0.1 mM)中，摩尔浓度比1:1的完全溶解于超纯水的K3[Fe(CN)6]和完全溶解于无水乙醇的Fc(COOH)2室温搅拌6 h制备而成，洗脱冻干后低温保存。
3.根据权利要求1或2所述的一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶（FPB-Co-Ch NPs），其特征在于，所述包覆FPB NPs的Co3O4纳米粒子的引入方法，包括以下步骤：称取FPB NPs复溶于超纯水，超声10 min 使其完全分散。再以FPB NPs：CoCl2·6 H2O：尿素的质量比为2.8：1：151加入，超声1 min 使其完全混合均匀，在80℃的高压反应釜中反应24h，离心，弃上清，超纯水洗涤三次，烘干，得到蓝灰色粉末，即FPB-Co NPs。
4.根据权利要求1或2所述的一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶（FPB-Co-Ch NPs），其特征在于，该纳米酶修饰了具有粘附和穿透胃粘膜黏液层能力和电正性可吸附于细菌表面特性的壳聚糖材料，其修饰方法包括以下步骤：在超纯水中质量比4:1的PFB-Co NPs壳聚糖季铵盐均匀混合后，室温搅拌2 h，得到PFB-Co-Ch NPs, 洗脱干燥后低温保存。
5.根据权利要求1到4所述的一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶（FPB-Co-Ch NPs），其特征在于，所述纳米酶FPB NPs为平均粒径60 nm的立方体，所述纳米酶FPB-Co NPs为平均粒径100 nm的立方体。纳米粒子均呈单个立方体分散。
6. 一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶的抗菌机制，其特征在于，通过多功能级联纳米酶的催化，将胃内感染H. pylori后的炎症部位的ROS转化为大量氧气，形成一个不利于H. pylori生存的富氧环境，同时在菌体表面生成羟基自由基发挥化学动力学疗法，该纳米酶的级联催化包括以下步骤：Ⅰ、以·O2-为底物，通过SOD酶样活性，转化为H2O2 和O2；Ⅱ、通过CAT酶样活性,将H2O2转化为O2；Ⅲ、通过POD酶样活性,将H2O2转化为·OH；IV、通过POD酶样活性，将O2 转化为 ·O2-。
7.一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶抗H. pylori感染的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：Ⅰ、通过体外细菌培养实验检测该纳米酶对H. pylori的抑菌率，通过平板计数和细菌活死染色后共聚焦显微镜观察结果；Ⅱ、利用透射电镜观察纳米酶对H. pylori菌膜的直接损伤作用；Ⅲ、通过菌体内β-糖苷酶水平检测和菌体内ROS水平检测考察纳米酶对H. pylori菌体内代谢的间接损伤作用；IV、通过灌胃构建敏感型和耐药型H.pylori感染小鼠模型，然后对比使用该纳米酶和抗生素治疗效果区别。V、按照权利要求7所述的一种纳米酶剂抗H. pylori感染的实验方法，其特征在于，在步骤IV中所述通过灌胃构建敏感型和耐药型H. pylori感染小鼠模型方法，其特征在于，包括以下步骤：使用C57BL/6JN小鼠，分别感染敏感Hp菌株（ATCC 43504）和临床耐药Hp菌株。断水断食12 h后，接种Hp，每只小鼠灌胃500 μL麦氏浊度1.0（3×108个/mL）的Hp菌悬液，隔一天一次，共7次。VI、根据步骤Ⅰ到步骤IV的结果分析确定纳米酶抗H. pylori感染的特性。
8.根据权利要求1到7所述，其特征在于，所抗H. pylori包括敏感型和耐药型H.pylori。
9. 权利要求1～7任意一项所述的一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶在H. pylori感染导致疾病中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病为胃炎、胃溃疡或十二指肠溃疡。

技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一靶向根除耐药幽门螺杆菌（H. pylori）的多功能级联纳米酶的制备方法、抗菌机制和抗敏感性及耐药性H. pylori感染的实验方法。
背景技术
[0002]幽门螺杆菌(H. pylori)是一种革兰氏阴性、弯曲的微需氧杆菌，在20世纪80年代早期由Warren和Marshall在胃活检中首次发现。其被认为是胃炎、消化性溃疡、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的主要病因和胃癌的危险因素。除了胃肠道疾病，幽门螺旋杆菌还在消化道外疾病中起作用，包括免疫血小板减少性紫癜、不明原因的缺铁性贫血和维生素B12缺乏症。世界卫生组织和国际癌症研究机构将幽门螺旋杆菌定义为一类致癌物。
[0003]幽门螺旋杆菌长期感染世界上一半以上的人口，尽管发达国家的H. pylori感染率稳步下降，但在发展中国家，H. pylori的患病率仍然很高(高达80%)，且临床实践证明，H. pylori感染不易治愈。因此众多患者的幽门螺旋杆菌早期根除非常必要，而H. pylori感染的抗生素治疗是复杂的，一般是使用两种抗生素和一种酸抑制剂。因为H. pylori定位于胃粘膜的酸性表面，所以需要一种酸性抑制剂来维持恒定的pH值，从而提高抗生素的疗效。根除h的一线治疗方案是标准的三联疗法，包括质子泵抑制剂(PPI)、阿莫西林和克拉霉素，或含铋四联疗法。然而，在一些地区，标准三联疗法根除率已低于《马斯特里赫特条约》的80%，含氟喹诺酮类药物治疗已作为二线或三线治疗用于抢救治疗。不幸的是，H. pylori对氟喹诺酮类药物的耐药性最近也有所增加。
[0004]目前抗生素耐药性是影响H. pylori的根除治疗方案疗效的主要因素。Hp对一线抗生素的耐药率(包括多重耐药率)呈逐年上升趋势，并且耐药率有一定的地区差异。近些年的多项研究都证实了幽门螺旋杆菌对抗生素的耐药性在世界范围内迅速上升，特别是克拉霉素，其耐药性在日本和意大利达到30%，在中国甚至高达50%。这导致幽门螺旋杆菌的抗菌药物根除率一直下降，一项研究表明敏感菌株的根除率约为88%，而耐药菌株的根除率仅为18%。除了耐药性的增加，复杂的抗生素疗法也降低了患者的依从性，这些都导致了幽门螺旋杆菌根除率的下降。此外，抗生素也会扰乱人体的肠道菌群，造成严重的副作用，影响体内多种有益的生理和代谢过程。因此，开发其它的治疗方法已是当务之急。
[0005]最近，纳米酶已经成为对抗细菌感染的有希望的“抗生素”。目前，已有多篇报道应用了具有氧化酶和过氧化物酶样活性的纳米酶用于抗菌治疗，并取得了良好的治疗效果。但是目前已经报道的纳米酶的多酶活性仍有待提高，以提高抗菌抗炎效果。普鲁士蓝纳米颗粒(PBNPs)及其类似物因其优异的生物相容性已成为临床应用中最重要的纳米酶之一，其具有多酶样活性，包括过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，已被用于在肿瘤微环境中过量ROS存在的情况下催化H2O2转化为O2，实现O2的自供应，同时可有效清除ROS，调节氧化应激，其内在机制与PBNPs的容量降低和低氧化还原电位有关。二茂铁是芬顿反应的催化剂，可通过芬顿反应生成羟基自由基加强纳米材料的POD样活性。Co3O4NPs是一种金属氧化物，被报道具有pH依赖性多酶样活性，包括过氧化氢酶（CAT）样、过氧化物酶（POD）样、超氧化物歧化酶(SOD)样和氧化酶（OXD）样活性,并且Co3O4NPs已被证明对致病菌具有良好的抗菌活性。同时，壳聚糖可以促进纳米颗粒在纳米颗粒-细菌界面的相互作用。
发明内容
[0006]为了克服上述目前H. pylori根除过程中面临的困难，本发明的目的在于提供一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶（FPB-Co-Ch NPs）的制备方法，抗菌机制和应用，解决现有的抗H. pylori药物靶向性较差，药效不显著的问题。受H. pylori微需氧特性的启发，本发明所构建的具有pH选择性的增强的多功能级联纳米酶，可通过级联酶促反应，创建一个富氧环境来抑制H. pylori的生长，以有针对性地有效根除和预防H. pylori的复发。
[0007]在PBNPs中引入二茂铁形成的新型普鲁士蓝类似物纳米粒子可通过二茂铁催化的芬顿反应进一步增强纳米酶的过氧化物酶（POD）样活性。进一步结合Co3O4NPs的新型普鲁士蓝类似物纳米粒子有望实现纳米酶的pH选择性多酶样活性增强，以实现更强的治疗效果。包覆壳聚糖后，可以提高纳米材料的电正性，使其更好的与细菌菌体发生静电吸附。
[0008]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种多功能级联纳米酶的制备方法、抗菌机制和其抗敏感型和耐药型H. pylori感染的实验方法，多功能级联纳米酶的制备方法包括合成新型普鲁士蓝类似物后作为核心，包覆Co3O4NPs，最外层再修饰壳聚糖涂层，形成复合纳米酶FPB-Co-Ch NPs。
[0009]优选地，所述作为核心新型普鲁士蓝类似物（FPB NPs）的合成制备方法包括在稀盐酸溶液(0.1 mM)中，摩尔浓度比1:1的完全溶解于超纯水的K3[Fe(CN)6]和完全溶解于无水乙醇的Fc(COOH)2室温搅拌6 h混合而成，洗脱冻干后低温保存。
[0010]优选地，所述新型普鲁士蓝类似物包覆Co3O4NPs得到FPB-Co NPs的方法包括在纯净水中，质量比为2.8：1：151的FPB NPs，CoCl2·6 H2O和尿素均匀混合后，在80℃的高压釜中反应24 h，洗脱干燥后低温保存。
[0011]优选地，所述FPB-Co NPs最外层再修饰壳聚糖涂层，形成复合纳米酶FPB-Co-ChNPs 的方法包括在超纯水中质量比4:1的PFB-Co NPs壳聚糖季铵盐均匀混合后，室温搅拌2h，得到PFB-Co-Ch NPs, 洗脱干燥后低温保存。
[0012]优选地，所述一种多功能级联纳米酶的抗菌机制为：通过Ⅰ-IV的纳米酶级联循环过程，不断放大反应，增加胃内氧气含量与化学动力学疗法产物·OH，以协同抑制微需氧特性的H. pylori，同时减少因感染H. pylori引起胃粘膜组织炎症反应中的ROS来抗炎与修复胃黏膜组织，纳米酶级联催化过程如下：
Ⅰ、以·O2-为底物，通过SOD酶样活性，转化为H2O2 和O2；
Ⅱ、通过CAT酶样活性,将H2O2转化为O2；
Ⅲ、通过POD酶样活性,将H2O2转化为·OH；
IV、通过POD酶样活性，将O2 转化为 ·O2-。
[0013]优选地，所述一种多功能级联纳米酶抗敏感型和耐药型H. pylori感染的实验方法包括：
Ⅰ、通过体外细菌培养实验检测该纳米酶对H. pylori的抑菌率，通过平板计数和细菌活死染色后共聚焦显微镜观察结果；
Ⅱ、利用透射电镜观察纳米酶对H. pylori菌膜的直接损伤作用；
Ⅲ、通过菌体内β-糖苷酶水平检测和菌体内ROS水平检测考察纳米酶对H. pylori菌体内代谢的间接损伤作用；
IV、通过灌胃构建敏感型和耐药型H. pylori感染小鼠模型，然后对比使用该纳米酶和抗生素治疗效果区别。
[0014]V、通过灌胃构建敏感型和耐药型H. pylori感染小鼠模型方法，包括以下步骤：使用C57BL/6JN小鼠，分别感染敏感Hp菌株（ATCC 43504）和临床耐药Hp菌株。断水断食12 h后，接种Hp，每只小鼠灌胃500 μL麦氏浊度1.0（3×108个/mL）的Hp菌悬液，隔一天一次，共7次。
[0015]VI、根据步骤Ⅰ到步骤IV的结果分析确定纳米酶抗H. pylori感染的特性。
[0016]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种靶向治疗H. pylori的多功能级联纳米酶，（1）纳米酶作为天然酶的替代品，是非免疫原性的，易于生成、储存和运输，由于其固有的催化性能、高稳定性、可调节的理化性质和对环境的响应性，可以在更大范围的条件下工作，如pH、温度、盐浓度、氧化还原微环境等，已被构建为用于生物医学的级联催化体系。本专利提出的一种多功能纳米酶，作为非载药单纳米酶药物，廉价易得，可以在酸性环境中保持稳定性并且特异性的启动级联酶促反应，以消灭耐药的H. pylori，具有良好临床应用前景。（2）抗菌机制：Co3O4包覆新型普鲁士蓝类似物的Co-Fe纳米酶表现出类似氧化酶（OXD）-、超氧化物歧化酶(SOD)-、过氧化物酶(POD)-和过氧化氢酶(CAT)-的酶活性，这些活性可以自供应O2,形成不利于H. pylori生存的富氧环境，O2也可与多种细胞因子相互作用，促进血管生成，调节增殖和迁移；同时，纳米酶可触发·OH生成，破坏菌膜，实现化学动力学抗菌治疗，从而杀死胃中的H. pylori；最后，通过不断消耗·O2-和H2O2，调节因H. pylori感染造成的胃内炎症组织的氧化应激，缓解炎症，同时恢复受损的胃粘膜。（3）壳聚糖具有多阳离子结构，可与革兰氏阴性表面的主要阴离子成分脂多糖、蛋白质相互作用，并具有一定的抗菌作用，这可能是通过结合并削弱外膜的屏障功能。细菌的外膜在保护生物体方面起着至关重要的作用。本专利对复合纳米酶进行壳聚糖表面修饰，发挥细菌靶向粘附作用，提高复合材料的生物相容性。本专利评估了其在体内选择性治疗敏感和耐药H. pylori感染的潜力，尤其对于耐药的H. pylori，这种酸性环境激活的多功能纳米酶比标准的一线三联疗法更有效。此外，FPB-Co-Ch NPs的级联多功能纳米酶特性在肠道中性条件下被抑制，从而避免了抗生素引起的胃肠道菌群平衡失调。总之，这种基于胃酸活化产氧系统的FPB-Co-Ch NPs多功能级联纳米酶活性有望克服选择性治疗H. pylori感染的关键挑战。与一线抗生素治疗相比，该平台结合了根除耐药细菌、调节炎症、修复功能和避免肠道菌群失调的能力。
附图说明
[0017]图1为不同纳米酶的透射电镜图；其中，a为FPB NPs，b为FPB-Co NPs;
图2为一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶（FPB-Co-Ch NPs）的酶促抗菌机制图；
图3为不同纳米酶在体外不同环境抑制敏感型和耐药型H. pylori的效果对比图；其中，a为敏感H. pylori组的平板计数结果统计，b为耐药H. pylori的平板计数结果统计，c为纳米酶FPB-Co-Ch与敏感H. pylori和耐药H. pylori共孵育后的MIC值测定结果图；
图4为不同纳米酶在体外不同环境抑制敏感型和耐药型H. pylori的效果对比图；其中，a为 用FPB-Co-Ch NPs在SGF下孵育H. pylori 0.5 后(右),透射电镜图像显示FPB-Co-Ch NPs杀死H. pylori的能力，b为通过β-半乳糖苷酶测定H. pylori细胞膜通透性的变化，c为GES-1细胞与不同浓度的FPB-Co-Ch NPs在SGF中共培养40 min后的存活率。
[0018]图5为不同纳米酶在体内清除敏感型和耐药型H. pylori的效果对比图。
具体实施方式
[0019]为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0020]需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0021]下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供的一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶，该纳米酶（FPB-Co-Ch NPs）由包覆了Co3O4纳米粒子的新型普鲁士蓝类似物再修饰壳聚糖制备得到；
其中，所述新型普鲁士蓝类似物（FPB NPs）为铁氰化钾和1,1-二茂铁甲酸在酸性环境合成的一种全新的普鲁士蓝类似物，其利用了创新性的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在稀盐酸溶液(0.1mM)中，摩尔浓度比1:1的完全溶解于超纯水的K3[Fe(CN)6]和完全溶解于无水乙醇的Fc(COOH)2室温搅拌6 h混合而成，洗脱冻干后低温保存；
其中，所述新型普鲁士蓝类似物包覆Co3O4NPs得到FPB-Co NPs的方法包括在milliq水中， 质量比为2.8：1：151的FPB NPs，CoCl2·6 H2O和尿素均匀混合后，。在80℃的高压釜中反应24 h，洗脱干燥后低温保存。
[0022]其中，所述新型普鲁士蓝类似物包覆Co3O4 NPs得到FPB-Co NPs的方法包括在milliq水中， 质量比为2.8：1：151的FPB NPs，CoCl2·6 H2O和尿素均匀混合后，在80℃的高压釜中反应24 h，洗脱干燥后低温保存。
实施例
[0023]1. 靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶的制备方法
（1）首先，将K3[Fe(CN)6] (5 mM)溶于稀盐酸溶液(0.1 mM, 50 mL)，Fc(COOH)2(5mM)溶于乙醇溶液(50 mL)，然后将二者混合，室温搅拌。反应6 h后， 10000 rpm离心10分钟, 弃上清后，用乙醇水溶液、超纯水分别洗涤三次，得到蓝色产物(FPB NPs)，少量超纯水重悬后冻干,低温保存。
[0024]（2）其次，将得到的冻干的FPB NPs (0.4 mg)在20 mL MilliQ水中超声处理10min，使其完全均匀分散。然后加入CoCl2·6H2O (6 μmol)和尿素(0.36 mmol)，超声处理1min，使其形成均匀溶液。在80℃的高压反应釜中反应24 h，冷却至室温后，离心弃上清，用乙醇和超纯水各洗涤3次后烘干，得到蓝灰色产物FPB-Co NPs，低温保存。
[0025]（3）最后将FPB-Co NPs (2 mg)溶解于去离子水(2 mL)中，再加入壳聚糖季铵盐(0.5 mg)，室温搅拌2 h，超纯水洗涤三次后得到产物PFB-Co-Ch，少量超纯水重悬后冻干,低温保存。
[0026]2. 靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶表征
（1）粒径、电位及形貌表征
用动态光散射粒度分析仪(Zeta Sizer Nano ZS90,Malvern,UK)测量纳米微囊的粒径和表面电荷分布，具体方法如下：分别取适量纳米酶（FPB NPs, FPB-Co NPs）用超纯水稀释后，加入样品池中进行测量，每个样品重复三次。由粒径和电位测量结果可知，FPB NPs的平均粒径60 nm，zeta电位为-19.63±0.72m V；FPB-Co NPs平均粒径为120 nm, zeta电位为-28.43 ± 0.49 mV，表明包覆Co3O后4的粒径有所增大；而经过壳聚糖进一步修饰后，FPB-Co-Ch NPs粒径又明显增大，平均粒径为181 nm, zeta电位为27 ± 1.06 mV，表明纳米酶经过壳聚糖涂层修饰后，电位逆转，这是因为壳聚糖带正电荷，中和掉了负电荷。
[0027]用透射电子显微镜(TEM)观察样品的形貌，将制备的纳米酶FPB NPs及FPB-Co NPs适当稀释后，取10μL滴到230目碳涂层铜网上，约5 min后，用滤纸从边缘吸走多余样品并使其在室温下干燥48 h后于透射电镜下观察。 由图1a电镜结果可看出， 制备FPB NPs表面光滑、结构呈均匀立方体，平均尺寸约为60 nm。TEM图显示，当FPB NPs转化为FPB-Co NPs时，平均尺寸增加到约120 nm(图1b)，元素扫描显示，FPB-Co NPs上可以观察到Fe和Co的元素分布。FPB-Co NPs尺寸均匀，其表面覆盖了一层较小的球形纳米颗粒，形成粗糙的表面。这些结果表明Co3O4NPs可以在FPB NPs表面成功生长。
[0028]x射线光电子能谱分析仪(Thermo Scientific ESCALAB 250Xi)进行x射线光电子能谱(XPS)测量。XPS表征样品为粉末。使用紫外可见分光光度计(Yuke T-N6000SPlus)进行紫外可见检测。 使用x射线粉末衍射仪(Rigaku Smart Lab 3kW)获得x射线衍射(XRD)光谱。傅立叶变换红外(FTIR)光谱在Bruker TENSOR红外光谱仪上收集，范围从400到4000cm-1。FPB NPs和FPB-Co NPs的宽范围XPS光谱中，FPB-Co NPs中出现了一个新的Co2p峰，O信号相对增加(O1s, 532 eV)， Fe2p峰降低，这可能是由于FPB NPs表面Co3O4NPs的修饰所致。FPB NPs和FPB-Co NPs的局部Co2p光谱显示， 780 eV和797 eV的峰值分别对应于Co2p3/2和Co2p1/2。这两个特征峰的出现进一步证实了Co3O4NPs中存在Co2+和Co3+，这被认为是影响其催化性能的关键因素。紫外测定结果中，FPB-Co NPs在700 nm处仍然有FPB NPs的特征吸收峰，说明FPB NPs的结构没有被破坏。从x射线衍射(XRD)结果得到，FPB NPs的形态与FPB-Co NPs的峰位一致，没有发生变化，说明在FPB NPs表面形成较小的Co3O4对FPB NPs的结构没有显著影响。同时，观察到FPB NPs和FPB-Co NPs的傅里叶变换红外光谱(FTIR)非常相似。在2088.03 cm-1处最强的峰归因于FPB NPs的C≡N拉伸。在1702.77 cm-1和1611.12 cm-1处的吸收峰来源于羧基的C=O伸缩振动。位于602.33 cm-1和501.30 cm-1的吸收带分别属于Fe-C键的面内和面外变形。1080.05 cm-1、1219.16 cm-1和1417.58 cm-1属于C-C吸收峰。羧基O-H的伸缩振动峰为3119.54 cm-1和3630.01 cm-1。这两种光谱的相似性表明，FPB NPs在FPB-Co NPs形成过程中未被破坏。
[0029]（2）多功能级联纳米酶对模拟胃液（SGF）的耐受性研究
H. pylori生存在胃黏膜这种极端环境中，纳米酶要在人胃液中发挥抑菌作用就必须具有一定的对胃酸的耐受能力。通常人体胃液的pH值在1～4这个范围内，会受进食的影响而产生变化。在空腹状态下pH值比较低，会达到pH值为1的酸环境；而进食后pH值又会达到3.5左右。 将FPB-Co-Ch NPs分别置于SGF（模拟胃液，pH 1.3）和SIF（模拟肠液，pH7.0）中37℃恒温孵育12小时，研究FPB-Co-Ch NPs的稳定性。通过透射电镜来观察纳米酶形貌变化，结果显示，纳米酶的粒径及形貌变化不大。表明纳米酶FPB-Co-Ch NPs在模拟胃液的消化过程(低酸性和胃蛋白酶存在)中，可基本保持结构完整，受胃部环境影响较小，这表明FPB-Co-Ch NPs具有良好的耐酸性。
[0030]3. 一种靶向根除耐药H. pylori的多功能级联纳米酶的抗菌机制
如图2所示，在SGF中，级联多功能纳米酶PFB-Co NPs通过OXD-样活性将O2分解为·O2−，再通过SOD-样活性将·O2−降解为H2O2，然后，通过CAT-/POD-样活性将H2O2转化为氧气O2和·OH，最后实现循环，不断放大反应。此外，由于材料的POD-样活性强于OXD-样活性，因此O2可以大量积累，以形成不利于H. pylori生存的富氧环境。同时，此过程中产生的·OH 可用于化学动力学疗法通过破坏菌膜来抗菌，最终实现协同强力抗菌效果。
[0031]4.多功能级联纳米酶对H. pylori的体外清除作用
（1）平板计数法体外抗菌活性鉴定与细菌活/死染色实验体外抗菌活性鉴定：
本专利分别在富氧(20% O2)和低氧(5% O2)环境下验证敏感和耐药H. pylori菌株的存活率。平板培养3天后，通过平板计数法得出，敏感和耐药的H. pylori菌株在缺氧(5%O2)环境下可以很好地生长，而在富氧(20% O2)环境下不能存活。将菌液和一定量的FPB-Co-Ch NPs加入SGF中，37℃，150 rpm，孵育40 min，然后用涂布板法将溶液置于哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件培养3天，观察菌落数，拍照记录。本专利研究了FPB-Co-Ch NPs对SGF和SIF中敏感和耐药H. pylori的抑菌性能，结果得到，在模拟胃液(SGF, pH1.3)中共孵育40min后，与对照组相比，加入FPB-Co-Ch NPs后，敏感和耐药的H. pylori菌株的生长均受到抑制(图3a,b)。然而，在模拟肠液(SIF, pH7.0)中与FPB-Co-Ch NPs共孵育后，与对照组相比，两组菌株的生长均未受到抑制。综上，说明纳米酶的多酶活性在中性环境下未被激活，未能产生抗菌作用。FPB-Co-Ch NPs具有有效靶向根除耐药H. pylori的能力，可以显著提高对耐药H. pylori的抗菌效果，同时肠道条件下多酶活性被抑制，避免非特异性靶向造成损伤，并具有良好生物相容性。由图3c结果可看出, FPB-Co-Ch NPs对敏感型和耐药型H.pylori均增殖表现出剂量依赖性的有效抑制能力。
[0032]（3）用透射电镜观察细菌形态：
以100 μg/mL FPB-Co-Ch NPs在SGF中孵育H. pylori悬液(ATCC 43504和临床耐药株7-18-4 1 × 108CFU/mL) 40 min。然后，将H. pylori悬液离心(15,000 rpm, 5min)，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，最终成为体积为1 mm3的沉淀物。2.5%戊二醛固定2 h后，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。再次用1% 柠檬酸固定2 h后，沉淀物也用磷酸盐缓冲液洗涤。然后分别依次用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇脱水15 min，最后用100%乙醇脱水3次。沉淀用纯丙酮和包埋液包埋。切片后，H. pylori样品用3% 醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。用透射电镜(Hitachi, Japan)观察H. pylori的形态。图4a的透射电镜(TEM)图像显示，对照组H.pylori细胞膜完整、清晰，而100 μg/mL FPB-Co-Ch NPs在SGF中孵育后，H. pylori细胞膜破碎、模糊。
[0033]（4）β-糖苷酶活性测定：
用β-半乳糖苷酶试剂盒测定H. pylori菌膜的通透性。将包含纳米酶的细菌上清液与实验溶液在SGF中共孵育40 min后，用酶板分析仪测定420 nm处实验溶液的光密度(OD)。实验结果如4b所示，以β-半乳糖苷酶作为测定细菌细胞膜通透性的指标。与对照组相比，FPB-Co-Ch NPs可以显著增加细菌膜的通透性。
[0034]（4）生物相容性评估:
采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测细胞活力，人胃上皮细胞(GES-1,5 × 104个细胞/孔)均匀铺板于96孔板上，于添加10% 胎牛血清和1% 双抗的RPMI 1640 (Gibco)培养基中37℃培养24 h。 然后向细胞中加入FPB-Co-Ch NPs(0-250 μg/mL)孵育12 h， DPBS洗涤细胞3次，加入10% CCK-8溶液。在37°C，5% CO2中培养2 h后，用多功能微孔板检测器(TECAN, spark, Austria)测量450 nm处的吸光度值。实验过程至少进行了三次。实验结果如图4c所示，FPB-Co-Ch NPs对胃粘膜上皮细胞(GES-1)的增殖抑制作用可以忽略不计，即使在有效杀菌浓度(125 μg/mL)的两倍下，细胞活力仍保持在85%以上。上述结果表明其具有良好的生物安全性。
[0035]5.多功能级联纳米酶体内根除H. pylori的效果评价
(1)实验动物模型
①实验动物模型建立
C57BL/6小鼠，3-4周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，各组小鼠分别灌胃400 μL敏感型和耐药型H. pylori溶液(1 × 108CFU/mL)，每隔一天1次，连续灌胃2周，感染2周。所有涉及小鼠的实验都得到了南开大学实验动物中心动物伦理委员会批准。然后，处死已建立的H. pylori感染小鼠模型(n = 6)，从腹腔切除胃。胃沿大弯曲纵向切开，进行细菌学培养 (取胃黏膜匀浆0.2 mL于血平板上，用研磨器涂匀，微需氧条件下培养3 d后观察)、快速尿素酶实验(取胃组织匀浆常温放置，滴加支快速尿酶检测试试纸，观察试纸30 min内由黄色变成樱红色为阳性)、胃组织切片革兰氏染色、H&E染色、吉姆萨染色，证实H. pylori在小鼠胃内成功定植，经以上鉴定证实H. pylori感染造模成功后进行后续验证。
[0036](2)体内清除H. pylori的效果评价
将已建立的敏感型和耐药型幽门螺旋杆菌感染小鼠随机分为5个治疗组(n = 6)，分别给予DPBS、FPB NPs (25 mg/kg)、FPB-Co NPs(25 mg/kg)、FPB-Co-Ch NPs(25 mg/kg)和奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素三联治疗，同时取6只未感染H. pylori小鼠作为阴性对照，阴性对照同样给予相同量的无菌生理盐水。上述药物灌胃前，提前12 h禁食禁水并记录小鼠体重，灌胃后2 h给予食物和水。 接下来，每隔一天口服1次，连续2周。三联治疗组先以400 μmol/kg剂量灌胃奥美拉唑(质子泵抑制剂)，等待30 min后再给药阿莫西林28.5 mg/kg、克拉霉素14.3 mg/kg。末次给药后2天(48 h)，处死三组治疗小鼠，腹腔切除胃。沿大弯曲纵向切开胃，生理盐水轻轻漂洗胃内容物，去除内容物后置于10 m L的离心管中分别加入生理盐水2.5 mL，于冰浴条件下对胃组织进行匀浆处理，随后每份匀浆样品取200μL的上清液用生理盐水梯度稀释10倍。用无菌涂布棒将稀释后的匀浆液均匀地涂布于血平板上，于37℃、微需氧环境中培养36～48h，进行菌落计数，换算每个胃内的细菌负载量。血平板为7%无菌去纤羊血和多种抗生素(10 μg/mL万古霉素、5 μg/mL乳酸甲氧苄啶、2.5 U/mL多粘菌素B、5 μg/mL两性霉素B)的哥伦比亚琼脂平板。在37℃、5% O2、10% CO2、85% N2的微氧条件下孵育36～48h，进行菌落计数，换算每个胃内的细菌负载量。 同时，取胃组织进行组织切片染色研究。同时收集小鼠肠道粪便。结果如图5a，治疗14天后,在感染敏感和耐药H.pylori的小鼠中，PBS治疗组小鼠胃组织中菌有大量H. pylori存在，FPB NPs组和FPB-CoNPs组均有一定的治疗效果，FPB-Co-Ch NPs组均没有H. pylori存在，与未感染H. pylori组相似。但耐药组小鼠的抗生素治疗组仍有少量H. pylori存在。以上结果说明FPB-Co-ChNPs纳米酶在胃中被激活，在体内表现出有效的H. pylori杀伤作用，并且不易引起H.pylori的抗性。采用苏木精-伊红(H&E)染色法观察小鼠胃组织病理学变化。与感染组相比，FPB-Co-Ch NPs处理后小鼠胃组织无明显炎症和损伤，上皮细胞层清晰。经病理分析，FPB-Co-Ch NPs组炎症评分低于感染组和抗生素组，损伤评分比感染组低近3倍，比抗生素组低2倍以上(图5b,c)，表明FPB-Co-Ch NPs可能在H. pylori感染后的炎症反应中修复组织损伤。
[0037]以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。