1.一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括构建含有如SEQ ID NO.3所示Tir目的基因片段的重组表达载体，将所述重组表达载体转化宿主细胞获得重组菌；所述重组菌诱导表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白，获得的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白纯化后进行免疫处理，得到肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体为如SEQ ID NO.3所示的Tir目的基因片段重组于pET-32a(+)载体的Nde I酶切位点和BamH I酶切位点之间。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白的方法包括，当重组菌在600nm处的吸光值达到0.4-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并置于10-20℃，诱导培养15-18h表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Tir融合蛋白的纯化包括以下步骤：将诱导表达的Tir融合蛋白样本与耐变性纯化His树脂进行孵育，加入洗脱缓冲液I和洗脱缓冲液II洗涤杂蛋白；再使用变性洗脱液洗脱目的蛋白；所述洗脱缓冲液I包括50MmNaH2PO4，300mM NaCl，2mM咪唑，8MCO(NH2)2；所述洗脱缓冲液II包括50MmNaH2PO4，300mMNaCl，20mM咪唑，8M CO(NH2)2；所述变性洗脱液包括50Mm NaH2PO4，300mM NaCl，60mM咪唑，8M CO(NH2)2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述免疫处理包括如下步骤：首先将Tir融合蛋白与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫小鼠，而后将Tir融合蛋白与非完全弗氏佐剂混合后进行第2-4次免疫小鼠。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体还包括运用proteinA纯化珠进行IgG亚型抗体富集，得到纯化抗体。
7.一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体是通过权利要求1～6中任一项所述制备方法制得。
8.根据权利要求7所述的多克隆抗体在检测肠出血性大肠杆菌Tir蛋白中的应用。

技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]大肠杆菌也称大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，有致病性和非致病性之分。与人类疾病有关的大肠杆菌统称为致泻大肠埃希氏菌(DiarrheagenicEscherichiacoli,DEC)，是一种重要的食源性致病菌，极易造成人体感染，感染后可引发腹痛腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症等病症，威胁人类健康及生命财产安全。其中，肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)主要血清型是O157:H7，肠出血性大肠杆菌是一种主要的食源性病原体，特异性地定居在大肠中，导致各种疾病。据报道，在美国每年有超过73,000人感染EHEC，而且有多人因为严重的并发症死亡。老人和小孩都属于易感人群，有报道显示10～100个细菌即可引起人类疾病。肠出血性大肠杆菌引起疾病的症状轻重不一，可表现为普通的腹泻到出血性结肠炎(HC)，也可表现为致命的溶血尿毒综合症(HUS)，因此，为了更好解决EHEC引发的食品安全和医疗卫生感染等问题，所以对EHEC的致病机理的研究尤为重要。
[0003]EHEC感染过程初步分为五个阶段：(1)穿过胃肠道系统抵达感染位点；(2)肠上皮细胞的初始粘附和定植；(3)通过III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)将效应蛋白注入大肠上皮细胞引起细胞骨架重排；(4)在粘附素intimin的介导下细菌与大肠上皮细胞形成紧密粘附；(5)产生志贺毒素引起宿主疾病。并且感染过程严格受基因所调控。
[0004]EHEC定植在肠道黏膜，诱发特征性的组织病理学粘附抹去(attaching andeffacing,A/E)损伤。A/E损伤的特点是肠道刷状毛边缘微绒毛的局部丢失和细菌与宿主细胞的亲密粘附，附着的细菌刺激肠上皮细胞骨架重排引起肌动蛋白在细菌周围聚合，形成突起杯状基座结构。A/E病变形成所需的基因位于肠细胞消失(LEE)致病性岛的位点，LEE编码一种III型分泌系统，该系统可将多种效应蛋白(包括Tir(translocated intiminreceptor)、EspF、EspG、EspH和Map)和Intimin基因编码的内膜蛋白(Intimin)。Tir在EHEC的致病过程中起着关键性作用，Tir作为intimin受体，与intimin相互作用，并在细菌粘附位点招募宿主蛋白和引起肌动蛋白重排，启动EHEC在肠道的初始粘附，Tir在易位到宿主后会即刻整合到细胞膜上将两端暴露在细胞质和细胞外区域，形成A/E损伤相关的基座结构。
[0005]现有技术公开了采用EHEC O157菌Tir基因292—1535之间1243核苷酸，编码415个氨基酸的重组Tir蛋白作为抗原免疫家兔获得抗血清，并记载其抗血清中的效价为25600(张雪寒,何孔旺,茅爱华,等.肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究[J].中国农业科学,2010,43(12):2570-2577)。但是，该现有技术仍不能达到更好的抗体效价要求。因此，亟需研究出效价更高、特异性更好的肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体用于肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的检测以及后续以肠出血性大肠杆菌Tir蛋白为线索感染宿主细胞的机制的研究。
发明内容
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
[0008]本发明提供了一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体的制备方法，包括构建含有如SEQ ID NO.3所示Tir目的基因片段的重组表达载体，将所述重组表达载体转化宿主细胞获得重组菌；所述重组菌诱导表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白，获得的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白纯化后进行免疫处理，得到肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体。
[0009]本发明中，所述重组表达载体为如SEQ ID NO.3所示的Tir目的基因片段重组于pET-32a(+)载体的Nde I酶切位点和BamH I酶切位点之间。
[0010]本发明中，所述宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞，所述大肠杆菌感受态细胞包括E.coli BL21。
[0011]本发明中，所述诱导表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白的方法包括，当重组菌在600nm处的吸光值达到0.4-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并置于10-20℃，诱导培养15-18h表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白。
[0012]本发明中，所述Tir融合蛋白的纯化包括以下步骤：将诱导表达的Tir融合蛋白样本与耐变性纯化His树脂进行孵育，加入洗脱缓冲液I和洗脱缓冲液II洗涤杂蛋白；再使用变性洗脱液洗脱目的蛋白；所述洗脱缓冲液I包括50MmNaH2PO4，300mM NaCl，2mM咪唑，8M CO(NH2)2；所述洗脱缓冲液II包括50Mm NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，8M CO(NH2)2；所述变性洗脱液包括50Mm NaH2PO4，300mM NaCl，60mM咪唑，8MCO(NH2)2。
[0013]本发明中，所述免疫处理包括如下步骤：首先将Tir融合蛋白与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫小鼠，而后将Tir融合蛋白与非完全弗氏佐剂混合后进行第2-4次免疫小鼠。
[0014]本发明中，所述肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体还包括运用proteinA纯化珠进行IgG亚型抗体富集，得到纯化抗体。
[0015]本发明还提供了一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体，所述多克隆抗体是通过上述制备方法制得。
[0016]本发明还提供了上述的多克隆抗体在检测肠出血性大肠杆菌Tir蛋白中的应用；所述多克隆抗体能够特异性识别肠出血性大肠杆菌Tir蛋白。
[0017]相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0018]本发明提供了一种Tir目的基因在提高肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体特异性中的应用，所述Tir目的基因片段为SEQ ID NO.3所示。本发明制备的肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的多克隆抗体，通过间接ELISA法测抗血清效价：抗血清效价可达1:102400，特异性较好，可用于肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的检测以及后续以肠出血性大肠杆菌Tir蛋白为线索感染宿主细胞的机制的研究，为进一步研究Tir蛋白在相关疾病发生机制中的作用奠定了基础。
[0019]本发明还提供了肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的多克隆抗体的制备方法，多克隆抗体的制备的主要流程包括制备抗原、免疫动物、测定效价合格后收集血清并纯化/鉴定抗体。本发明的方法过程简单，成本低廉且速度较快，抗体的价格与商业抗体的价格相比更廉价，极大节约了时间和物质成本。在商业中，单克隆抗体在免疫动物后，还需要花费较长的时间制备、筛选才能产生高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株，技术要求高、周期长，成本较高。
附图说明
[0020]图1为实施例1中Tir酶切片段核酸凝胶电泳图；
[0021]图2为实施例1中重组表达载体pET-32a(+)-Tir的质粒图谱；
[0022]图3为实施例2中EHEC O157:H7菌体超声破碎上清的Westernblot测定结果图；
[0023]图4为实施例2中重组pET-32a(+)-Tir融合蛋白表达及亲和纯化的SDS-PAGE检测结果图；
[0024]图5为实施例3中间接ELISA法检测抗血清的效价图；
[0025]图6为实施例4中Tir抗体特异性Westernblot检测结果。
具体实施方式
[0026]本发明提供了一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体的制备方法，包括构建含有如SEQ ID NO.3所示Tir目的基因片段的重组表达载体，将所述重组表达载体转化宿主细胞获得重组菌；所述重组菌诱导表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白，获得的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白纯化后进行免疫处理，得到肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体。
[0027]本发明所述表达载体为将含有如SEQ ID NO.3所示Tir目的基因片段重组于pET-32a(+)载体的Nde I酶切位点和BamH I酶切位点之间得到的重组表达载体。本发明以肠出血性大肠杆菌O157:H7 EDL933的基因组为模板，进行PCR扩增，获得所述抗原多肽的编码基因，即肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段；优选地，扩增所述目的基因的特异性引物包括：Tir-F-Nde I，序列如SEQ ID NO.1所示：GGGAATTCCATATGATGCCTATTGGTAATCT TGG；Tir-R-BamH I，序列如SEQ ID NO.2所示：CGCGGATCCCGCAGT TTCAGTTGCACT。本发明所述宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞，所述大肠杆菌感受态细胞优选为E.coli BL21(DE3)。
[0028]进一步的，本发明进行诱导表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白时，将重组表达菌株扩大培养后，当600nm处的吸光值A值达到0.4-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并置于10-20℃，诱导培养15-18h表达肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白。
[0029]本发明诱导表达所述Tir融合蛋白样本的制备方法包括：收集菌体，超声破碎菌体，加入蛋白变性液溶解，离心沉淀，收集上清。具体的，收集菌体经过PBS洗涤两次之后，加入裂解液重悬细菌，并在样品中加入溶菌酶、PMSF进行冰浴，超声破碎菌体。优选地，所述裂解液包括50MmNaH2PO4，300mM NaCl，H2O；加入20mL裂解液重悬细菌；所述样品中加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶、1mM的PMSF。进一步的，将超声破碎的菌体进行超速离心，10000-14000转，4℃，20-40min，将离心上清去除，加入蛋白变性液溶解菌体，离心沉淀，并且将破碎菌体溶液置于4℃层析柜，旋转过夜进行变性处理；将过夜变性的样品进行离心，10000-14000转，4℃，20-40min，收集上清，所述上清即为诱导表达后Tir融合蛋白样本。优选地，所述蛋白变性液包括50MmNaH2PO4，300mM NaCl，8M CO(NH2)2，H2O。
[0030]进一步的，将上述诱导表达后Tir融合蛋白样本进行亲和纯化，包括以下步骤，将所述诱导表达后Tir融合蛋白样本和纯化树脂进行孵育，充分孵育之后，加入洗脱缓冲液I、洗脱缓冲液II洗涤杂蛋白，同时用考马斯亮蓝G250鉴定流出液中是否还有杂蛋白，洗涤至流出液无法使G250变蓝；然后使用变性洗脱液洗脱目的蛋白，洗脱至流出液无法使得G250变蓝。优选地，将所述诱导表达后Tir融合蛋白样本和纯化树脂进行孵育时，在纯化空柱中加入ddH2O并加入耐变性纯化His树脂。优选地，所述耐变性纯化His树脂为BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)；购买于碧云天，货号：P2233。优选地，所述洗脱缓冲液I包括50MmNaH2PO4，300mMNaCl，2mM咪唑，8M CO(NH2)2；所述洗脱缓冲液II包括50MmNaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，8M CO(NH2)2。所述变性洗脱液包括50MmNaH2PO4，300mMNaCl，60mM咪唑，8M CO(NH2)2。作为一种可实施方式，样本和纯化树脂进行孵育时，利用蠕动泵循环孵育，转速设为4-6mL/min，一共孵育3-8h。
[0031]再进一步的，亲和纯化后收集这一步的所有流出液。将亲和纯化后获得的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白样本进行透析去除咪唑、尿素等小分子杂质，即为亲和纯化后获得的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白；用BCA法蛋白定量的方法测定蛋白浓度，保证蛋白浓度＞0.5mg/mL即可。
[0032]本发明免疫处理的方法包括：以复性后的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白进行免疫处理，得到肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体。作为一种可实施方式，所述免疫处理使用的免疫动物是小鼠，具体为购买于Beijing Vital River Laboratory AnimalTechnology Co.,Ltd六周左右的雌性小鼠(BALB/cmice)。本发明以所述Tir融合蛋白为免疫原进行四次免疫小鼠制备多克隆抗体；具体步骤如下：首先将Tir融合蛋白与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫，而后将Tir融合蛋白与非完全弗氏佐剂混合后进行第2-4次免疫。作为一种可实施方式：免疫处理的方法包括：(1)首次免疫：100μL完全弗氏佐剂与100μLTir融合蛋白，浓度1mg·mL-1，充分混合，超声破碎进行乳化，在小鼠腹部进行皮下多点注射。(2)二次免疫：首次免疫两周后进行，将100μL不完全弗氏佐剂与100μL Tir融合蛋白，浓度约1mg·mL-1，充分混合，超声破碎进行乳化，在小鼠腹部进行皮下多点注射。(3)三次免疫：二次免疫一周后，按照二次免疫方法进行免疫。(4)四次免疫：三次免疫一周后，按照二次免疫方法进行免疫。(5)四次免疫处理后一周进行抗血清的收集。
[0033]本发明中，所述免疫处理后得到的多克隆抗体进行纯化的方法包括：将得到的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白的多克隆抗体运用proteinA纯化珠进行IgG亚型抗体富集，得到特异性更高的纯化抗体。
[0034]本发明还提供了一种肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体，所述多克隆抗体是通过上述制备方法所制得；所述肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体的抗血清效价可达1:102400，效价更高、特异性更好。
[0035]本发明还提供了上述多克隆抗体在检测肠出血性大肠杆菌Tir蛋白中的应用；所述多克隆抗体的效价更高、特异性更好，能够更好的特异性识别肠出血性大肠杆菌Tir蛋白。
[0036]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；
[0038]所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0039]实施例1肠出血性大肠杆菌Tir蛋白重组表达菌株的构建
[0040]1.肠出血性大肠杆菌基因组模板的制备
[0041]将实验室保存的肠出血性大肠杆菌Wild-type EHEC O157:H7 EDL933(来源于ATCC:The Global Bioresource Center，以下简称肠出血性大肠杆菌)接种在LB液体培养基中，在温度为37℃条件下培养过夜得到细菌培养液，以此用市面上售卖的普通基因组试剂盒将肠出血性大肠杆菌的基因组提出。
[0042]2.特异性引物的制备
[0043]上述利用NCBI设计特异性引物Tir-F-Nde I、Tir-R-BamH I，采用引物稀释液进行稀释后，置于-20℃保存备用，避免反复冻融。
[0044]特异性引物：
[0045]Tir-F-Nde I：GGGAATTCCATATGATGCCTATTGGTAATCTTGG(SEQ ID NO.1)；
[0046]Tir-R-BamH I：CGCGGATCCCGCAGTTTCAGTTGCACT(SEQ ID NO.2)。
[0047]3.PCR反应体系的建立和扩增
[0048]以肠出血性大肠杆菌的基因组作为模板，采用上述的特异性引物进行PCR扩增。扩增程序为：预变性95℃，5min；(变性95℃，30S：退火55℃，30S；延伸72℃，1min)×35个循环；延伸72℃，5min。
[0049]通过PCR扩增获得肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段，即为用于诱导肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体的抗原多肽编码基因。
[0050]肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段，如下所示：
[0051]ATGCCTATTGGTAATCTTGGTCATAATCCCAATGTGAATAATTCAATTCCTCCTGCACCTCCATTACCTTCACAAACCGACGGTGCAGGGGGGCGTGGTCAGCTCATTAACTCTACGGGGCCGTTGGGATCTCGTGCGCTATTTACGCCTGTAAGGAATTCTATGGCTGATTCTGGCGACAATCGTGCCAGTGATGTTCCTGGACTTCCTGTAAATCCGATGCGCCTGGCGGCGTCTGAGATAACACTGAATGATGGATTTGAAGTTCTTCATGATCATGGTCCGCTCGATACTCTTAACAGGCAGATTGGCTCTTCGGTATTTCGAGTTGAAACTCAGGAAGATGGTAAACATATTGCTGTCGGTCAGAGGAATGGTGTTGAGACCTCTGTTGTTTTAAGTGATCAAGAGTACGCTCGCTTGCAGTCCATTGATCCTGAAGGTAAAGACAAATTTGTATTTACTGGAGGCCGTGGTGGTGCTGGGCATGCTATGGTCACCGTTGCTTCAGATATCACGGAAGCCCGCCAAAGGATACTGGAGCTGTTAGAGCCCAAAGGGACCGGGGAGTCCAAAGGTGCTGGGGAGTCAAAAGGCGTTGGGGAGTTGAGGGAGTCAAATAGCGGTGCGGAAAACACCACAGAAACTCAGACCTCAACCTCAACTTCCAGCCTTCGTTCAGATCCTAAACTTTGGTTGGCGTTGGGGACTGTTGCTACAGGTCTGATAGGGTTGGCGGCGACGGGTATTGTACAGGCGCTTGCATTGACGCCGGAGCCGGATAGCCCAACCACGACCGACCCTGATGCAGCTGCAAGTGCAACTGAAACTGCG(SEQ ID NO.3)。
[0052]肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段编码的肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，为用于诱导肠出血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体的抗原多肽：
[0053]MPIGNLGHNPNVNNSIPPAPPLPSQTDGAGGRGQLINSTGPLGSRALFTPVRNSMADSGDNRASDVPGLPVNPMRLAASEITLNDGFEVLHDHGPLDTLNRQIGSSVFRVETQEDGKHIAVGQRNGVETSVVLSDQEYARLQSIDPEGKDKFVFTGGRGGAGHAMVTVASDITEARQRILELLEPKGTGESKGAGESKGVGELRESNSGAENTTETQTSTSTSSLRSDPKLWLALGTVATGLIGLAATGIVQALALTPEPDSPTTTDPDAAASATETA(SEQ ID NO.4)。
[0054]4.构建重组表达载体
[0055]将所得到的肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段(834bp)与原核表达载体pET-32a(+)进行连接。具体方法为：将PCR得到的肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段(834bp)进行双酶切，酶切体系为：肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段取1000ng，Nde I酶1uL，BamH I酶1uL，10×buffer 5uL，其余用水补齐到50uL；反应参数：37℃，40min；4℃保存。
[0056]核酸凝胶电泳鉴定Tir酶切片段，如图1所示，其M代表为2000大小的marker；泳道1，为Tir酶切片段。
[0057]将原核表达载体pET-32a(+)进行双酶切，Tir表达载体酶切体系为：原核表达载体pET-32a(+)取1000ng，BamH I酶1uL，Nde I酶1uL，10×buffer5uL，其余用水补齐到50uL；反应参数：37℃，30min；4℃保存。
[0058]将肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段与原核表达载体pET-32a(+)进行连接；连接体系为：肠出血性大肠杆菌Tir目的基因片段取30ng，原核表达载体pET-32a(+)取100ng，T4 DNA连接酶1uL，其余用水补至10uL；反应参数为：22℃，16h；得到带有肠出血性大肠杆菌Tir目的基因的重组表达载体pET-32a(+)-Tir，所述重组表达载体pET-32a(+)-Tir的质粒图谱如图2所示。
[0059]5.构建诱导重组表达菌株
[0060]将所得的重组表达载体pET-32a(+)-Tir利用化学转化法导入大肠杆菌DH5α感受态中。反应过程为，取10uL重组表达载体pET-32a(+)-Tir加入到大肠杆菌DH5α感受态中，冰浴30min，接着42℃热激45s，冰浴5min后，加入1mL LB液体培养基，放在37℃，180rpm的摇床复苏1h。
[0061]将复苏完全的大肠杆菌DH5α涂布在含有氨苄青霉素(Ampicillin,Amp,50ng/mL)的固体平板上，37度培养，挑取单菌落利用pET-32a(+)鉴定引物进行PCR鉴定，所用的pET-32a(+)鉴定引物为32a-JD-F：TAATACGACTC ACTATAGGG(SEQ ID NO.5)；32a-JD-R：GCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO.6)。再将鉴定成功的菌落置于含有Amp抗生素的LB液体培养基，37℃过夜培养，第二天按照提质粒试剂盒提取质粒。
[0062]将带有肠出血性大肠杆菌Tir目的基因的蛋白表达载体pET-32a(+)-Tir进行电转导入E.coli BL21(DE3)菌株中，并加入900uL的LB液体培养基，37℃复苏1h，并将其涂在含有Amp抗生素的固体平板上，37℃过夜培养；挑取单菌落利用上述pET-32a(+)鉴定引物进行鉴定，得到重组表达菌株并接种在LB培养基中，进行保菌，-80℃保存。
[0063]实施例2肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的诱导、纯化
[0064](1)从保菌管中将重组表达菌株接种到20mL含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，并以1：100的比例接种在200mL含有Amp抗生素的LB液体培养基进行扩大培养；当600nm处的吸光值A值达到0.5时，加入终浓度为0.1M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并置于16℃，诱导培养16h。收集菌体，经过PBS洗涤两次之后，加入20mL裂解液(50Mm NaH2PO4，300mM NaCl，H2O)重悬细菌，并在样品中加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶、1mM的PMSF进行冰浴，超声破碎菌体。
[0065](2)将超声破碎的菌体进行超速离心，12000转，4℃，30min，将离心上清去除，加入蛋白变性液(50Mm NaH2PO4，300mM NaCl，8M CO(NH2)2，H2O)溶解离心沉淀，并且将破碎菌体溶液置于4℃层析柜，旋转过夜进行变性处理；将过夜变性的样品进行离心(参数：12000rpm，30min，4℃)，收集上清，所述上清即为诱导表达后Tir融合蛋白样本。
[0066]所述pET-32a(+)载体为带有6×His标签的原核表达载体，因此将重组表达载体pET-32a(+)-Tir转化至E.coli BL21(DE3)中，经过IPTG诱导后，从而获得带有6×His标签的融合蛋白。
[0067]通过Westernblot对EHEC O157:H7菌体超声破碎上清进行测定，结果如图3所示：其中左侧纵坐标标注蛋白质标准分子质量；右侧孔道：Tir多克隆抗体的孵育，Tir多克隆抗体的孵育即为诱导表达后Tir融合蛋白样本。由图3可见，在约48KD处看到有Tir多克隆抗体的孵育蛋白的表达，与预计蛋白大小相一致，表明本申请成功诱导表达Tir融合蛋白。
[0068](3)将诱导表达后Tir融合蛋白样本进行亲和纯化，在纯化空柱中加入ddH2O并加入5mL耐变性纯化His树脂BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)，购买于碧云天，货号：P2233，在4℃层析柜中过夜沉积树脂；用蛋白变性液平衡纯化柱，蠕动泵的转速设为6mL/min冲洗30min；将诱导表达后Tir融合蛋白样本加入纯化柱中，使样本和纯化树脂进行孵育，利用蠕动泵循环孵育，转速设为6mL/min，一共孵育5h；在充分孵育之后，加入洗脱缓冲液I(50MmNaH2PO4,300mM NaCl,2mM咪唑，8M CO(NH2)2)洗涤杂蛋白，同时用考马斯亮蓝G-250鉴定流出液中是否还有杂蛋白，洗涤至流出液无法使G250变蓝。在纯化柱中加入洗脱缓冲液II(50Mm NaH2PO4,300mM NaCl,20mM咪唑，8M CO(NH2)2)竞争洗涤杂蛋白，洗脱至流出液无法使G250变蓝；在纯化柱中加入变性洗脱液(50Mm NaH2PO4,300mM NaCl,60mM咪唑，8M CO(NH2)2)，洗脱目的蛋白，洗脱至流出液无法使得G250变蓝。收集这一步的所有流出液。将获得的肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白样本进行透析去除咪唑、尿素等小分子杂质，得到最终亲和纯化后获得肠出血性大肠杆菌Tir融合蛋白；用BCA法蛋白定量的方法测定蛋白浓度，保证蛋白浓度＞0.5mg/mL即可，并进行分装(50μL/每管)，置于-80℃冰箱保存，取出使用时避免反复冻融。
[0069]通过Western杂交检测重组pET-32a(+)-Tir融合蛋白(简称Tir融合蛋白)表达及亲和纯化结果。结果表明，上述实施例中的Tir融合蛋白成功表达，所述重组pET-32a(+)-Tir融合蛋白表达及亲和纯化的检测结果如图4所示。其中，横坐标中M为蛋白质标志物；横坐标l为异丙基-β-D-硫代半乳糖昔(IPTG)诱导后沉淀蛋白；2为洗脱缓冲液I；3为洗脱缓冲液II；4-8为变性洗脱液。
[0070]实施例3肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的多克隆抗体的制备
[0071]使用复性后实施例2的蛋白对六周左右的雌性小鼠(BALB/c mice，购买于BeijingVital River LaboratoryAnimal Technology Co.,Ltd)进行四次免疫制备多克隆抗体，具体步骤如下；
[0072](1)首次免疫：100μL完全弗氏佐剂与100μL Tir融合蛋白(浓度约1mg·mL-1)充分混合，超声破碎进行乳化，在小鼠腹部进行皮下多点注射。
[0073](2)二次免疫：首次免疫两周后进行，将100μL不完全弗氏佐剂与100μLTir融合蛋白(浓度约1mg·mL-1)充分混合，超声破碎进行乳化，在小鼠腹部进行皮下多点注射。
[0074](3)三次免疫：二次免疫一周后，按照二次免疫方法进行免疫。
[0075](4)四次免疫：三次免疫一周后，按照二次免疫方法进行免疫。
[0076](5)四次免疫处理后一周进行抗血清的收集，利用眼球摘除法将小鼠血样收集到1.5mL离心管中，4℃倾斜放置过夜。4000g，4℃，15min，收集上层血清并少量分装，-80℃保存备用。
[0077]通过间接ELISA法测抗血清效价：
[0078]按照常规步骤，使用碧云天的试剂盒进行检测，所述试剂盒为SignalUpTMELISA超敏检测试剂盒(HRP荧光法)，货号：P0205S。
[0079]以包被液稀释6×His-Tir抗原，至终浓度为20μg/mL，在96孔酶标板每孔加入100μL进行包被，放入湿盒中，4℃过夜。次日，去除板内液体，PBS洗涤3次后，封闭液封闭，每孔加入200μL封闭液封闭，37℃静置2h，后用PBS洗涤3次。抗血清从200倍开始稀释，稀释比例为1：200～1：102400；空白对照为PBS，阴性对照为稀释后的抗血清，阴性对照一开始的孔并没有包被抗原，均为100μL/well；37℃条件下静置1h，PBS洗涤3次，加入PBS稀释的20000倍鼠源二抗，100μL/well，37℃条件下静置1h，PBS洗涤3次。每孔加入100μL显色液，37℃反应30min后，加入50μL的终止液。每孔取10μL液体以PBS稀释5倍，最后在波长450nm处测吸光值，做好记录和折线图；抗血清的效价图如图5所示。由图5可看出，抗血清效价达到1:102400。
[0080]进一步，肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的多克隆抗体还经过以下处理：
[0081]将得到的肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的多克隆抗体运用proteinA纯化珠进行IgG亚型抗体富集，得到特异性更高的抗体。
[0082]IgG亚型抗体富集的步骤：将体积比为1：10的Tir蛋白多克隆抗体与结合缓冲液混合，加入预先平衡好含有proteinA填料的结合柱子，4℃结合4h后，用洗涤缓冲液漂洗至G-250不变色为止，最后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集管提前加入中和液，得到纯度更高的肠出血性大肠肝Tir蛋白的多克隆抗体。其中，结合缓冲液的配方为Tris-buffered salinecontaining 0.05％Tween-20 Detergen；洗涤缓冲液的配方为Tris-buffered salinecontaining 0.05％Tween-20 Detergen；洗脱缓冲液配方为0.1M甘氨酸，pH 2.0；中和液配方为1MTris，pH 7.5-9。
[0083]实施例4Tir抗体特异性检测
[0084]对本发明中实施例3提供的肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的多克隆抗体与免疫前EHEC O157:H7血清样品分离的Tir蛋白进行Westernblot检测。在Tir抗体特异性检测中，抗体以1：10000的比例，用5％的脱脂奶粉稀释，5％的脱脂奶粉为5g脱脂奶粉+100ml的TBST。
[0085]测定结果如图6所示。其中，图6左侧纵坐标标注为蛋白质标准分子量，Pre-immuune为免疫前血清检测肠出血性大肠杆菌Tir蛋白(阴性对照)，ProteinApurified为ProteinA纯化后血清检测出肠血性大肠杆菌Tir蛋白。
[0086]图6检测结果表明：抗血清可与肠血性大肠杆菌Tir蛋白发生特异性结合，特异性条带在58.03kDa处。表明所制备的肠血性大肠杆菌Tir蛋白多克隆抗体特异性良好。
[0087]综合上述结果，本发明肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的多克隆抗体的抗血清效价可达1:102400，特异性较好，可用于肠出血性大肠杆菌Tir蛋白的检测以及后续以肠出血性大肠杆菌Tir蛋白为线索感染宿主细胞的机制的研究，为进一步研究Tir蛋白在相关疾病发生机制中的作用奠定了基础。
[0088]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。