1.多肽PYRAE，其结构式如下：。
2.多肽PYRAE的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将Fmoc-E(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
S2、用DMF洗涤多次，用20 %哌啶脱Fmoc，脱好后，再次用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-A(pbf)-OH、多肽缩合剂HBTU、HOBT、N-甲基吗啡啉、DMF继续固相合成反应；
S3、后采用DMF洗涤多次，用20 %哌啶脱Fmoc，脱好后，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-R(pbf)-OH、Fmoc-Y(tBu)-OH、Fmoc-P(Boc)-OH进行固相缩合，直到与最后一个P反应结束，脱FMOC后， 用95 %的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到多肽PYRAE。
3.权利要求1所述的多肽PYRAE，如下任一种应用：
（1）在制备BiP抑制剂药物中的应用；
（2）在制备抗乳腺癌药物中的应用。
4.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的多肽PYRAE以及药学上可接受的载体或赋形剂。
5.荧光探针Mca修饰的多肽PYRAE，其结构式如下：
。
6.权利要求5所述的荧光探针Mca修饰的多肽PYRAE的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将Fmoc-E(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
S2、用DMF洗涤多次，用20 %哌啶脱Fmoc，脱好后，再次用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-A(pbf)-OH、多肽缩合剂HBTU、HOBT、N-甲基吗啡啉、DMF继续固相合成反应；
S3、后采用DMF洗涤多次，用20 %哌啶脱Fmoc，脱好后，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-R(pbf)-OH、Fmoc-Y(tBu)-OH、Fmoc-P(Boc)-OH进行固相缩合；与Fmoc-Pro(Boc)-OH反应完毕后，在避光条件下与酰基载体蛋白Acp、Mca进行缩合，缩合结束后，脱FMOC后， 用95 %的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到荧光多肽Mca-PYRAE。
7.权利要求5所述的荧光探针Mca修饰的多肽PYRAE在制备乳腺癌肿瘤活细胞中示踪剂中的应用。

技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种多肽PYRAE、其制备方法及作为BiP抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
[0002]癌症已经成为世界上最可怕的疾病之一。尤其是癌症的发病率和多样性的增加，以及人类的老龄化，使得癌症的预防和治疗越来越困难。对癌症治疗的研究已经进行了几十年，但科学家们仍然没有能够针对许多类型的肿瘤开发出有效的治疗方法。
[0003]结合免疫球蛋白蛋白(BiP)，称为HSPA5或GRP78，是Hsp70家族的分子伴侣蛋白。大部分分布在于内质网(ER)中，很少部分分布在细胞核、细胞表面和细胞质中。作为UPR中的关键调节因子，BiP在ER蛋白平衡中发挥重要作用，以支持细胞存活和生长。未折叠或错误折叠的蛋白质通常发生在细胞中，如果不加以处理，可以形成有毒的蛋白质聚集物。特别是在癌细胞中，新蛋白质的合成更加疯狂，产生更多的未折叠或者错折叠蛋白质。所以癌细胞需要更强的UPR和BiP蛋白才能存活以及生长。抑制BiP可破坏UPR，破坏ER蛋白稳态，导致癌细胞死亡。BiP通过调节ER蛋白平衡和抑制细胞凋亡的能力促进癌细胞的耐药性。BiP具有ATPase活性并且BiP的功能就跟其ATPase活性有密切的关系。BiP失去其ATPase活性就不能发挥自己的分子伴侣作用。综上所述，抑制BiP能够抑制肿瘤生长，克服治疗耐药性。近年来，开发新型BiP抑制剂的研究已成为众多科学家关注的焦点。有几个属于化学分子的BiP抑制剂已经开发出来了，但抑制BiP的天然蛋白模拟肽尚未发现。
[0004]近年来，具有抗肿瘤活性的天然生物活性肽药物引起了许多科学家们的兴趣。这些药物因有高靶向性、低细胞毒性、高渗透性而成为癌症治疗的潜在发展方向。该领域大致分为两个领域:从天然资源分离或者加工出来的生物活性肽和利用现代生物化学技术合成出来的模拟肽。天然来源的生物活性肽存在着来源有限、成本高、对技术和设备要求高等的缺点。由几个到几百个氨基酸合成的天然模拟肽因其适应症广、安全性高、疗效显著而成为近年来药物开发的重要热点之一，已在癌症、艾滋病、糖尿病、肝炎等疾病的治疗中受到了广泛的欢迎。随着现代技术和设备的飞速发展，模拟肽的生产成本大大降低，模拟肽药物也进入了黄金发展阶段。
发明内容
[0005]有鉴于此，为解决上述问题，本发明提出了一种能够抑制BiP的ATPase活性，减弱BiP的处理未折叠或错折叠蛋白的功能，导致内质网应急和细胞凋亡，抑制肿瘤生长的多肽PYRAE，并提供了其制备方法和其作为BiP抑制剂在制备抗癌药物中的应用；所述多肽PYRAE水溶性好，分子量小，容易进入细胞内部，不产生细胞毒性。
[0006]为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0007]本发明一方面提供了一种多肽PYRAE，其水溶性好，分子量小(634Da)，其结构式如下：
[0008]
[0009]本发明再一方面提供了一种多肽PYRAE的制备方法，包括如下步骤：
[0010]S1、在固相合成器中将Fmoc-E(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
[0011]S2、用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，脱好后，用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-A(pbf)-OH、多肽缩合剂HBTU、HOBT、N-甲基吗啡啉、DMF于固相合成器中固相合成反应；
[0012]S3、后采用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，脱好后，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-R(pbf)-OH、Fmoc-Y(tBu)-OH、Fmoc-P(Boc)-OH进行固相缩合，直到与最后一个P反应结束，脱FMOC后，用95％的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到多肽PYRAE。
[0013]本发明再一方面提供了所述的多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE如下任一种应用：
[0014](1)在制备BiP抑制剂药物中的应用；
[0015](2)在制备抗癌药物中的应用；
[0016](3)作为BiP抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
[0017]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE与BiP结合并抑制BiP的ATPase活性。
[0018]在本发明的一些更优选的应用的实施方式中，所述多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE与BiP结合，其Kd＝57.7μM。
[0019]在本发明的一些更优选的应用的实施方式中，所述多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE与BiP结合并抑制BiP的ATPase活性，其IC50＝92.33μM。
[0020]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE引起内质网蛋白聚集和应急，导致细胞凋亡，抑制肿瘤生长。
[0021]在本发明的一些更优选的应用的实施方式中，所述多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE在肿瘤细胞里的使用浓度为10～200μM。
[0022]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE抑制乳腺癌细胞的生长。
[0023]在本发明的一些更优选的应用的实施方式中，所述多肽PYRAE和所述的制备方法制备的多肽PYRAE对乳腺癌小鼠，瘤旁皮下给药浓度为10mg/kg。
[0024]本发明再一方面提供了一种药物组合物，包括所述的多肽PYRAE或所述的制备方法制备的多肽PYRAE，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
[0025]发明再一方面提供了荧光探针Mca修饰的多肽PYRAE，其水溶性好，分子量小(851.3Da)，1～2小时内能够进入肿瘤细胞内质网内部，其结构式如下：
[0026]
[0027]发明再一方面提供了荧光探针Mca修饰的多肽PYRAE的制备方法，包括如下步骤：
[0028]S1、在固相合成器中将Fmoc-E(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
[0029]S2、用DMF洗涤多次，然后用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，脱好后，再次用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-A(pbf)-OH、多肽缩合剂HBTU、HOBT、N-甲基吗啡啉、DMF于固相合成器中固相合成反应；
[0030]S3、后采用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，脱好后，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-R(pbf)-OH、Fmoc-Y(tBu)-OH、Fmoc-P(Boc)-OH进行固相缩合；与Fmoc-Pro(Boc)-OH反应完毕后，在避光条件下与酰基载体蛋白Acp，Mca进行缩合，缩合结束后，脱FMOC后，用95％的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到荧光多肽Mca-PYRAE。
[0031]发明再一方面提供了荧光探针Mca修饰的多肽PYRAE在肿瘤活细胞中示踪剂中的应用。
[0032]需要说明的是，本发明用到的氨基酸均为L构型的天然氨基酸。
[0033]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述荧光探针Mca修饰的多肽PYRAE在肿瘤活细胞中的使用浓度为10～100μM。
[0034]相对于现有技术，本发明所述的多肽PYRAE、其制备方法及作为BiP抑制剂在制备抗癌药物中的应用具有以下优势：
[0035](1)本发明所述的多肽PYRAE水溶性好，分子量小，容易进入细胞内部，实验验证荧光多肽Mca-PYRAE在加入细胞后的1-2小时，就能够进入肿瘤细胞的内质网内部；不产生细胞毒性，对正常细胞生长没有明显的抑制；
[0036](2)本发明所述的多肽PYRAE具有跟BiP结合并抑制它的ATPase活性的能力，导致内质网蛋白稳态破坏，引起内质网应急和细胞凋亡；
[0037](3)本发明所述的多肽PYRAE可作为BiP抑制剂发挥抗肿瘤活性，抑制肿瘤生长，具有较大的临床应用和开发价值。
附图说明
[0038]图1为多肽PYRAE，阴性对照多肽PAAAE、荧光多肽Mca-PYRAE的化学合成路线图；
[0039]图2为多肽PYRAE的质谱鉴定和纯度鉴定结果；
[0040]图3为阴性对照多肽PAAAE的质谱鉴定和纯度鉴定结果；
[0041]图4为荧光多肽Mca-PYRAE的质谱鉴定和纯度鉴定结果；
[0042]图5为多肽PYRAE有无已知类似化合物的鉴定；
[0043]图6为多肽PYRAE的理化性质分析；
[0044]图7为荧光多肽Mca-PYRAE进入肿瘤细胞内质网的荧光成像鉴定；
[0045]图8为多肽PYRAE、阳性对照HA15、阴性对照多肽PAAAE，与BiP结合体外鉴定，以及抑制BiP的ATPase活性鉴定；
[0046]图9为多肽PYRAE在细胞内跟BiP结合的荧光成像鉴定；
[0047]图10为多肽PYRAE导致蛋白聚集，引起内质网应急和凋亡的细胞实验鉴定；
[0048]图11为多肽PYRAE抑制肿瘤生长的动物实验鉴定。
具体实施方式
[0049]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0050]下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
[0051]实施例1多肽PYRAE的合成
[0052]采用固相合成法合成多肽PYRAE，合成路线如图1所示，合成步骤如下：
[0053](1)称量0.80mmol(746mg)二氯树脂，加入固相合成器中，加入20mL二氯甲烷(DCM)浸没树脂，溶胀树脂30分钟，抽干DCM溶剂，加入1mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH(425.5mg)的DCM溶液，加入800uL的N-甲基吗啡啉。固相合成反应2小时。之后用DCM洗6次，每次2分钟。用体积比DCM：甲醇：N-甲基吗啡啉＝17:2:1的封闭液，封闭30分钟。每次用DCM溶液20mL，洗涤6次，每次1分钟。每次用DMF溶液20mL，洗涤6次，每次2分钟。之后加入20mL20％哌啶的DMF溶液，反应30分钟，脱去Fmoc保护基，颜色为蓝色则脱完，暴露出下一步反应的氨基。
[0054](2)加入1mmolFmoc-Ala(pbf)-OH(311.3mg)，1ml的N-甲基吗啡啉，1mmol多肽缩合剂HBTU(380mg)，HOBT(135mg)，反应2小时，用20mL DMF溶液，洗涤6次，每次2分钟。加入20mL含20％哌啶的DMF溶液，反应30分钟，脱去Fmoc保护基，暴露出下一步反应的氨基。
[0055](3)重复(2)的实验步骤，只需要更换下次需要加入的Fmoc保护的氨基酸即可，依次加入的氨基酸顺序为：Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Pro(Boc)-OH。将氨基酸依次链接在树脂上；最后一个加入的封端基团为：萘乙酸。
[0056](4)反应完毕之后，用20mLDMF溶液，洗涤6次，每次2分钟。每次用含20％哌啶的DMF溶液20mL，洗涤6次，每次1分钟。颜色为蓝色则脱完Fmoc，用95％的三氟乙酸TFA(TFA:H2O:TIS＝95％:2.5％:2.5％)切割2小时，用1％的TFA的二氯甲烷溶液20mL洗两遍，将收集到的总切割液蒸干即可得到粗品，粗品再用高效液相分离纯化，冻干即得到多肽PYRAE。
[0057]对合成的多肽PYRAE进行质谱鉴定和纯度鉴定，结果见图2。
[0058]对比例1阴性对照多肽PAAAE的合成
[0059]采用固相合成法合成多肽PAAAE，合成路线如图1所示，合成步骤如下：
[0060](1)(2)与实施例1的步骤(1)(2)一致。
[0061](3)重复(2)的实验步骤，但需要更换下次需要加入的Fmoc保护的氨基酸，依次加入的氨基酸顺序为：Fmoc-Ala(pbf)-OH，Fmoc-Ala(pbf)-OH，Fmoc-Pro(Boc)-OH。将氨基酸依次链接在树脂上；最后一个加入的封端基团为：萘乙酸。
[0062](4)与实施例1的步骤(4)一致。
[0063]对合成的多肽PAAAE进行质谱鉴定和纯度鉴定，结果见图3。
[0064]实施例2荧光多肽Mca-PYRAE的合成
[0065]采用固相合成法合成荧光多肽Mca-PYRAE合成路线如图1所示，合成步骤如下：
[0066](1)(2)(3)与实施例1的步骤(1)(2)(3)一致。
[0067](4)与Fmoc-Pro(Boc)-OH反应完毕后，在避光条件下与酰基载体蛋白Acp，Mca进行缩合。将氨基酸依次链接在树脂上；最后一个加入的封端基团为：萘乙酸。
[0068](5)与实施例1的步骤(4)类似，但是需要在避光条件下进行，最后冻干即得到荧光多肽Mca-PYRAE。
[0069]对合成的荧光多肽Mca-PYRAE进行质谱鉴定和纯度鉴定，结果见图4。
[0070]实施例3多肽PYRAE有无已知类似化合物的鉴定
[0071]使用SCIFinder，PeptideAtlas，TumorHoPe检索类似PYRAE结构的化合物或者多肽，具体步骤如下：
[0072](1)使用SCIFinder的检索数据库，输入多肽PYRAE的化学结构，进行检索即可得到类似该多肽结构的已知化合物或者多肽；
[0073](2)使用PeptideAtlas数据库，输入多肽PYRAE的氨基酸序列，进行检索即可检索到该序列的多肽；
[0074](3)使用TumorHoPe数据库，输入多肽PYRAE的氨基酸序列，进行检索即可检索到该序列的多肽；
[0075](4)结果显示，该多肽无一样的结构或者氨基酸序列的已知化合物或多肽，该多肽具有化学结构上的新颖性，属于未知结构的新多肽化合物；
[0076]本实施例的鉴定结果可参考图5。
[0077]实施例4多肽PYRAE的理化性质分析
[0078]使用ExPASy–ProtParamtool分析多肽PYRAE的理化性质，具体步骤如下：
[0079](1)多肽PYRAE物理性状为水溶性的白色粉末；
[0080](2)使用ExPASy–ProtParamtool，插入多肽PYRAE序列，显示该多肽的理化性质；
[0081](3)结果显示，PYRAE是白色的粉末，具有良好的水溶性，极小的分子量(634.69Da)，半衰期20小时以上，稳定指数-25.82，说明该多肽是很稳定半衰期也比较长的水溶性白色粉末的多肽。
[0082]本实施例的鉴定结果可参考图6。
[0083]实施例5鉴定荧光多肽Mca-PYRAE在肿瘤活细胞内的定位
[0084]使用荧光探针Mca标记多肽PYRAE和内质网探针DIOC6(3)，350nm和488nm激发光下观察蓝色和绿色荧光，可确认多肽PYRAE在肿瘤细胞内的分布情况，具体步骤如下：
[0085](1)肿瘤细胞的准备：将肿瘤细胞从液氮里取出复苏后，用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞传代至35mm×10mm的共聚焦培养皿中，细胞密度在50～80％之间；
[0086](2)荧光多肽Mca-PYRAE物理性状为水溶性的橘黄色粉末；
[0087](3)待细胞生长6～12小时后，避光环境下用DEPC水溶解荧光多肽Mca-PYRAE，配置成10-100μM浓度加入到细胞中，轻轻混匀细胞培养基，37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中继续培养1-2小时；
[0088](4)内质网探针DIOC6(3)，配置成5μM浓度加入到细胞中，轻轻混匀细胞培养基，37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中继续培养5分钟；
[0089](5)将细胞培养基吸弃，用室温的PBS轻洗3次，每次5分钟，加入2mL无血清的DMEM或RPMI1640培养基；
[0090](6)将含有肿瘤细胞的共聚焦培养皿置于LSM800莱卡激光共聚焦显微镜下，为了Mca-PYRAE在350nm激发光下，为了DIOC6(3)在488nm激发光下观察，拍摄；
[0091](7)Mca蓝色荧光和DIOC6(3)绿色荧光成像结果显示荧光多肽Mca-PYRAE在肿瘤细胞内质网内部均有分布；
[0092](8)结果显示，多肽PYRAE1～2小时内能够进入到细胞内质网里。
[0093]本实施例的鉴定结果可参考图7。
[0094]实施例6鉴定多肽PYRAE(或者HA15，PAAAE)能否与BiP结合使用表面等离子共振检测(Bioacore(SPR)assay)方法，以及多肽PYRAE(或者HA15，PAAAE)和纯BiP蛋白，检测是否能够结合，具体步骤如下：
[0095](1)BiP蛋白芯片的准备：在仪器上插入一个新的BIAcoreCM-5葡聚糖芯片，用PBS作为工作液以持续流动系统平衡系统，在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的情况下通过注入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化葡聚糖羧酸酯，在低pH的乙酸钠缓冲液中注入BiP蛋白，使得葡聚糖上存在足够的蛋白量，同做几个平行实验，在这些平行实验中变化葡聚糖上BiP蛋白的密度，以获得呈现产生清楚的结合反应的足够的分子表面，并且充分稀释以测量应该恒定的解离率常数；
[0096](2)配置运行缓冲液和溶剂校正曲线：运行缓冲液选用5％DMSO的PBS-P，取52.5ml10×PBS-P用去离子水稀释到500ml，配成1.05×PBS-P，加入DMSO配成运行缓冲液(5％DMSO)和校正曲线母液(4.5％和5.8％DMSO)，混合4.5％和5.8％DMSO母液配置5％DMSO浓度校正曲线；
[0097](3)多肽样品准备：用1.05×PBS-P10mM多肽PYRAE(或者HA15，PAAAE)母液稀释20倍，得到500μM在5％DMSO中的多肽，之后用5％DMSO运行缓冲液将分析物浓度稀释到5μM作为最高进样浓度，向下对半稀释至少5个浓度递度(2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.156μM)，间隔设置一个重复浓度，增加一个0浓度；
[0098](4)选用多循环检测：打开BioacoreS200controlsoftware里点开Template中的Kinetics/affinity，然后双击打开Fragment/LMW下的LMW Kinetics/affinitymulti-cycle；
[0099](5)结果显示，多肽PYRAE能够与BiP结合，其亲和力为Kd＝57.7μM(阳性对照HA15的Kd＝43.3μM，阴性对照多肽PAAAE没有与BiP结合)；
[0100]本实施例的鉴定结果可参考图8。
[0101]实施例7鉴定多肽PYRAE(或者HA15，PAAAE)能否抑制BiP的ATPase活性
[0102]使用ADP-GloTMKinaseassaykit(Promega,V7001)试剂盒和多肽PYRAE(或者HA15，PAAAE)，检测多肽PYRAE是否能够抑制BiP的ATPase活性，具体步骤如下：
[0103](1)生成ATP到ADP转换的标准曲线：混合1mMATP(试剂盒提供)和1mMADP(试剂盒提供)溶液(100:0，80:20，60:40，40:60，20:80，10:90，5:95，4：96，3:97，2:98，1:99，0:100)放入到96孔板的A1至A12孔里，再从每个A1-A12孔里取10μl转移到B1-B12孔里，每个B1-B12孔里取5μl放入到384孔板里，后面与(5),(6)一致；
[0104](2)384孔板中A2-A12孔里放入2μl激酶反应缓冲液(试剂盒提供)，A1孔里4μl含300μM多肽PYRAE(或者HA15，PAAAE)的激酶反应缓冲液，从A1取2μl转移到A2，轻轻混匀，再从A2取2μl转移到A3，反复到A12孔，最后从A12孔里取掉2μl；
[0105](3)A1-A12每个孔里加入2μl含100μMBiP的1×激酶反应缓冲液；
[0106](4)A1-A12每个孔里加入1μl含100μMATP的1×激酶反应缓冲液，混匀后放在室温1h；
[0107](5)每个孔里加入5μlADP-GloTM试剂(试剂盒提供)，放在室温里40分钟；
[0108](6)每个孔里加入10μl激酶检测试剂(试剂盒提供)，放弃在室温1小时，用多功能微孔板检测仪(TECAN)以每个孔当0.25s积分时间检测发光度；
[0109](7)结果显示，多肽PYRAE能够抑制BiP的ATPase活性，其IC50＝92.33μM(阳性对照HA15的IC50＝60.08μM，阴性对照多肽PAAAE没有抑制BiP的ATPase活性)。
[0110]本实施例的鉴定结果可参考图8。
[0111]实施例8鉴定荧光多肽Mca-PYRAE和BiP在细胞内的共定位
[0112]使用荧光探针Mca标记多肽PYRAE，内质网探针PDI抗体，和BiP抗体，350nm，488nm，和568nm激发光下观察蓝色，绿色，和红色荧光，可确认多肽PYRAE在肿瘤细胞内质网里跟BiP的共定位，具体步骤如下：
[0113](1)肿瘤细胞的准备：将肿瘤细胞从液氮里取出复苏后，用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞传代至里面放好玻璃薄片的24孔板中，细胞密度在50～80％之间；
[0114](2)荧光多肽Mca-PYRAE物理性状为水溶性的橘黄色粉末；
[0115](3)待细胞生长6～12小时后，避光环境下用DEPC水溶解荧光多肽Mca-PYRAE，配置成10-100μM浓度加入到细胞中，轻轻混匀细胞培养基，37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中继续培养1-2小时；
[0116](4)用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，吸掉PBS后加入500ml4％多聚甲醇，固定30分钟，用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，吸掉PBS后加入500ml0.5％TritonX-100(PBS配制)通透在室温15分钟；
[0117](5)用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，吸掉PBS后加入500ml5％牛血清(BSA)，封闭1小时；
[0118](6)加入BiP抗体(1:300,PBST配制)和PDI抗体(1:300,PBST配制)，4℃孵育12～16小时，用PBST浸洗玻片3次，每次3分钟，吸掉PBST后避光条件下加入兔和鼠来源的二抗(1:200)，室温孵育1小时，用PBST浸洗玻片3次，每次3分钟，用吸水纸吸干液体后，用含抗荧光淬灭剂的封片夜封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像；
[0119](7)结果显示，多肽PYRAE能够在细胞内质网里跟BiP结合。
[0120]本实施例的鉴定结果可参考图9。
[0121]实施例9鉴定多肽PYRAE(或者PAAAE)是否引起内质网蛋白聚集，导致内质网应急和细胞凋亡
[0122]将多肽PYRAE(或者PAAAE)加入到肿瘤细胞里，用Aggresomaldetectionkit(ENZ-51035-K100,ENZO)检测细胞内蛋白聚集体，提取细胞总蛋白用westernblot检测内质网应急的标签蛋白水平，具体步骤如下：
[0123](1)肿瘤细胞准备：将肿瘤MCF-7，MDA-MB-231细胞从液氮里取出复苏后，用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞铺匀至6孔板的细胞培养皿中，细胞数量为每孔3×105/孔；
[0124](2)配制不同浓度的多肽PYRAE和PAAAE：称取6.4mg的多肽PYRAE(PAAAE的话4.6mg)，溶解于1mL的DEPC水中，配制成的母液浓度为10mM。再将母液用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)分别稀释为：10μM，100μM，200μM的浓度；
[0125](3)蛋白聚集检测：铺板细胞6h后加入多肽(100μM，200μM)，继续培养24h，收细胞之前给一个孔里加入蛋白酶体抑制剂(MG132)5μM(阳性对照)；
[0126](4)用胰蛋白酶/EDTA溶液(ThermoFisherScientific，R001100)收集细胞，离心400rpm5分钟，加入1mlPBS洗一次，离心500rpm5分钟，小心去除PBS，剩约200μl的PBS；
[0127](5)加入1ml4％甲醛溶液，轻松混匀，放在室温30分钟，离心800rpm10分钟，用PBS洗一次，再离心800rpm10分钟，小心去除PBS，剩约200μl的PBS；
[0128](6)加入1ml透化夜(0.5％TritonX-100，3mMEDTA，PH8.0)，轻轻混匀，放在冰浴30分钟，离心800rpm10分钟，去除上清液，用PBS把细胞转移到BD管里(BD#352235)，离心800rpm10分钟，小心去除上清液；
[0129](7)加入500μl蛋白聚集检测试剂(试剂盒提供)，轻轻混匀，放在室温30分钟，用流式细胞仪的FL3频道检测荧光强度；
[0130](8)westernblot分析：加入多肽一定的时间后，吸去培养基，每孔用300μl含有蛋白酶抑制剂的非变性裂解液在冰上裂解细胞，裂解12分钟，裂解液中加入75μL5×蛋白上游缓冲液混匀，100℃煮样10分钟；
[0131](9)各取样品20μl，上样于10％或12％SDS-PAGE电泳，ATF4抗体(1:1000)，CHOP抗体(1:1000)，cl-PARP抗体(1:1000)，LC3B抗体(1:1000)，鼠源二抗和兔源二抗(1:4000)，凝胶成像仪曝光成像；
[0132](10)MTT实验：正常生长状态的肿瘤细胞铺匀至96孔板的细胞培养皿中，细胞数量为每孔3～5×103/孔，37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养6～12小时；
[0133](11)加入多肽，至少6个浓度递度(320μM，160μM，80μM，40μM，20μM，10μM)，继续培养48小时；
[0134](12)避光条件下用DEPC水配制5mg/ml的MTT溶液，取20μl加入到96孔板的每个孔中，轻轻混匀，放回37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)继续培养4小时；
[0135](13)倒弃96孔板里的培养基，加入150μlDMSO，置于缓慢的摇床上10分钟，立即在酶标仪的570nm下测量MTT值；
[0136](14)结果显示，多肽PYRAE引起蛋白聚集，也引起内质网应急和凋亡，抑制肿瘤细胞的生存活力。
[0137]本实施例的鉴定结果可参考图10
[0138]实施例10多肽PYRAE抑制乳腺癌4T1BALB/c雌鼠的肿瘤生长
[0139]将多肽PYRAE瘤旁皮下注射于乳腺癌4T1BALB/c雌鼠，检测能否抑制肿瘤生长，具体步骤如下：
[0140](1)4T1BALB/c雌鼠准备：PBS组和多肽PYRAE组各5只，周龄6-8周，饲养一个星期后备用；
[0141](2)肿瘤细胞准备：将肿瘤4T1细胞从液氮里取出复苏后，用RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞传至20cm细胞培养皿中，继续培养至细胞长满，胰酶消化后用PBS稀释成1×106/100μl。
[0142](3)多肽PYRAE准备：称取多肽5mg溶于1mlPBS中，避光保存于-20℃；
[0143](4)4T1细胞注射：将4T1细胞1×106/100μl皮下注射于小鼠右腹部位，此后每隔一天观察肿瘤生长情况，在第6天长出瘤结，记录小鼠肿瘤大小，体重；
[0144](5)小鼠给药：第10天分别瘤旁皮下注射PBS和多肽PYRAE(10mg/kg/只)各100μl，此后每隔一天给药一次，同时记录肿瘤大小，肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2)；
[0145](6)第26天处死小鼠并解剖取出肿瘤，记录肿瘤大小，小鼠体重，肿瘤重量；
[0146](7)结果显示，小鼠的体重PBS组和PYRAE组之间没有差异，而且没有下降，说明多肽PYRAE对正常细胞没有毒性，以及多肽PYRAE组小鼠肿瘤明显小于PBS对照组肿瘤，说明多肽PYRAE能够抑制小鼠肿瘤生长。
[0147]本实施例的鉴定结果可参考图11。
[0148]在上述实验中，正常细胞的生长没有受到抑制，多肽PYRAE不产生细胞毒性。
[0149]所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。