1.一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将目标蛋白的编码基因克隆到无抗生素介入细菌表达载体pExoS54(Ade)中，得到目标蛋白表达载体；所述目标蛋白为疫苗抗原；
将所述目标蛋白表达载体转化入腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)中，获得铜绿假单胞菌外源蛋白表达系统；
所述无抗生素介入细菌表达载体的构建方法，包括以下步骤：将大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭载体pExoS54中的氨苄青霉素抗性基因盒替换为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子；
所述磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述氨苄青霉素抗性基因盒的核苷酸序列GenBank:AAB40011.1；
所述腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)的构建方法，包括以下步骤：删除减毒铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK-JΔ6菌株的基因组中参与从头合成嘌呤核苷酸的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK，获得腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)；所述PAK-JΔ6菌株已完成保藏，保藏编号为CGMCC No.24851；所述参与从头合成嘌呤核苷酸的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的核苷酸序列的GenBank geneID：AAG08810.1-AAG08811.1。
2.利用权利要求1所述构建方法得到的无抗生素介入的细菌表达系统。
3.权利要求2所述无抗生素介入的细菌表达系统在疫苗制备中的应用。

技术领域
[0001]本发明属于原核表达技术领域，具体涉及一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法及应用。
背景技术
[0002]在遗传工程领域，准确控制基因的表达对于研究基因的功能以及生命体的生命活动均具有非常重要的意义。相对于真核细胞复杂的基因表达系统，原核细菌的基因表达系统则简单很多，因此常见多种细菌表达系统。细菌表达载体通常需要添加抗生素来保证表达载体的稳定存在，抗生素的引入会导致细菌发酵的成本的增加，不便于大规模的制备；若将基因整合到基因组上表达，虽然不再需要引入抗生素，但由于拷贝数低，限制了基因的大量的表达。
发明内容
[0003]本发明的目的在于提供一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法及应用，在质粒上引入其他筛选压力来替换抗生素的筛选，从而避免发酵过程中抗生素的使用，降低细菌大规模发酵的制备成本。
[0004]本发明还提供了一种腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)的构建方法，包括以下步骤：删除减毒铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK-JΔ6菌株的基因组中参与从头合成嘌呤核苷酸的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK，获得腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)；所述PAK-JΔ6菌株已完成保藏，保藏编号为CGMCCNo.24851。
[0005]优选的，所述参与从头合成嘌呤核苷酸的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的核苷酸序列的GenBank gene ID：AAG08810.1-AAG08811.1。
[0006]本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)。
[0007]本发明还提供了一种无抗生素介入细菌表达载体的构建方法，包括以下步骤：将大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭载体pExoS54中的氨苄青霉素抗性基因盒替换为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子；
[0008]所述磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]优选的，所述氨苄青霉素抗性基因盒的核苷酸序列GenBank:AAB40011.1。
[0010]本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的无抗生素介入细菌表达载体pExoS54(Ade)。
[0011]本发明还提供了一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法，包括以下步骤：将目标蛋白的编码基因克隆到上述无抗生素介入细菌表达载体pExoS54(Ade)中，得到目标蛋白表达载体；
[0012]将所述目标蛋白表达载体转化入上述腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)中，获得铜绿假单胞菌外源蛋白表达系统。
[0013]优选的，所述目标蛋白包括转录因子、酶、疫苗抗原、结构蛋白、纳米抗体或毒力因子。
[0014]本发明还提供了利用上述构建方法得到的无抗生素介入的细菌表达系统。
[0015]本发明还提供了上述无抗生素介入的细菌表达系统在干细胞定向分化、细胞重编程、细胞基因编辑、蛋白质功能、疫苗开发或抗肿瘤制剂的制备中的应用。
[0016]有益效果：本发明提供了一种以减毒铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK-JΔ6菌株为基础菌，删除嘌呤合成关键基因purEK，获得腺嘌呤(Adenine)营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)。本发明构建得到的PAK-JΔ6(Ade)在不含有腺嘌呤的基本培养基上不能生长，也不能在体内环境存活，只有人为补加腺嘌呤才能使其繁殖。本发明通过引入携带purEK操纵子的质粒pExoS54(Ade)回补PAK-JΔ6(Ade)背景菌株的营养缺陷，使其可在无嘌呤的培养基中生长。本发明利用purEK操纵子替换掉质粒上原有的氨苄青霉素抗性(AmpR)基因盒，利用腺嘌呤营养限制作为pExoS54(Ade)质粒的维持压力，从而避免了抗生素的使用。利用表达载体pExoS54(Ade)可以在PAK-JΔ6(Ade)菌株中对外源蛋白进行重组表达，不需要在基本培养基(无嘌呤)中添加抗生素即可维持表达载体的稳定存在。
[0017]生物保藏信息
[0018]铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK-JΔ6，于2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.24851。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)的限制性生长；
[0021]图2为腺嘌呤互补表达载体pExoS54(Ade)的质粒图谱；
[0022]图3为回补菌株PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)在M9培养基中的生长；
[0023]图4为Western blotting检测重组蛋白S54-RBD的表达情况，泳道1：PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)-RBD菌株，泳道2：PAK-JΔ6::RBD菌株；
[0024]图5为活病毒中和实验；
[0025]图6为疫苗接种后小鼠的细胞免疫应答ELISPOT板斑点计数。
具体实施方式
[0026]本发明还提供了一种腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)的构建方法，包括以下步骤：删除减毒铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK-JΔ6菌株的基因组中参与从头合成嘌呤核苷酸的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK，获得腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)；所述PAK-JΔ6菌株已完成保藏，保藏编号为CGMCCNo.24851。
[0027]本发明所述PAK-JΔ6菌株的构建方法已在中国专利CN202110112107.5中进行公开，并在本发明中完成了生物保藏，且在生物保藏时，将所述菌株在CN202110112107.5中的名称(aPA-Δ6)正式命名为PAK-JΔ6。本发明以所述PAK-JΔ6菌株为背景菌株，优选利用同源重组的方法无痕删除purEK基因，从而构建得到所述PAK-JΔ6(Ade)。本发明所述purEK基因的核苷酸序列的GenBank gene ID优选为：AAG08810.1-AAG08811.1。
[0028]本发明所述删除优选包括构建基因敲除质粒和构建基因敲除菌株，所述基因敲除质粒优选包括以PAK-JΔ6菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增purEK基因上下游1kb左右的同源臂片段，切胶回收同源臂DNA片段；将回收的同源臂DNA片段克隆到具有相应粘性末端的pEX18Tc质粒上，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂布在含四环素(Tc)和D型谷氨酸(D-Glu)的LB平板上筛选转化子，PCR和质粒酶切对转化子进行鉴定，得到基因敲除质粒。本发明构建得到所述基因敲除质粒后，进行基因敲除质粒的提取，使用化学转化的方法将所述基因敲除质粒转化到大肠杆菌S17感受态细胞中；运用接合转移的方法将S17中的基因敲除质粒转入到PAK-JΔ6菌株中，对基因组中的目标基因进行敲除。
[0029]本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)。
[0030]本发明所述PAK-JΔ6(Ade)在不含有腺嘌呤的基本培养基上不能生长，也不能在体内环境存活，只有人为补加腺嘌呤才能使其繁殖。如在本发明实施例中，PAK-JΔ6(Ade)在L-Broth(LB)中可正常生长，在基本培养基M9中无法生长，需要补加50μg/mL的腺嘌呤才能生长。
[0031]本发明还提供了一种无抗生素介入细菌表达载体的构建方法，包括以下步骤：将大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭载体pExoS54中的氨苄青霉素抗性基因盒替换为磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子；
[0032]所述磷酸核糖氨基咪唑羧化酶基因purEK的操纵子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0033]本发明优选通过PCR扩增purEK基因操纵子，克隆到大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭载体pExoS54中，获得表达载体pExoS54(Ade)，其质粒图谱如图2所示。本发明所述purEK基因操纵子包含purEK基因自身启动子，长度为1.9kb，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；且被替换掉的氨苄青霉素抗性基因盒的核苷酸序列的GenBank优选为:AAB40011.1。本发明所述大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭载体pExoS54已在文章中进行公开(Sci Rep.2015Oct 9；5:15014.doi:10.1038/srep15014.PMID:26449528；PMCID:PMC4598736.)。
[0034]本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的无抗生素介入细菌表达载体pExoS54(Ade)。
[0035]本发明构建得到的无抗生素介入细菌表达载体携带完整的purEK基因操纵子，可回补purEK突变株的腺嘌呤营养限制表型。如在本发明中，将目的基因克隆到表达载体pExoS54(Ade)的多克隆位点，与铜绿假单胞菌3型分泌系统(T3SS)信号肽序列(exoS1-162)融合表达可被细菌T3SS注入到真核细胞当中。
[0036]本发明还提供了一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法，包括以下步骤：将目标蛋白的编码基因克隆到上述无抗生素介入细菌表达载体pExoS54(Ade)中，得到目标蛋白表达载体；
[0037]将所述目标蛋白表达载体转化入上述腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌PAK-JΔ6(Ade)中，获得铜绿假单胞菌外源蛋白表达系统。
[0038]本发明所述目标蛋白优选包括转录因子、酶、疫苗抗原、结构蛋白、纳米抗体或毒力因子，实施例中以新型冠状病毒SARS-CoV-2的刺突蛋白中和表位(Spike-RBD)基因为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明将所述目标蛋白的编码基因克隆到pExoS54(Ade)的多克隆位点处，再将构建好的质粒pExoS54(Ade)转化入PAK-JΔ6(Ade)中，构建得到purEK基因回补株，回补株可以在无嘌呤的培养基中生长。
[0039]本发明还提供了利用上述构建方法得到的无抗生素介入的细菌表达系统。
[0040]本发明还提供了上述无抗生素介入的细菌表达系统在干细胞定向分化、细胞重编程、细胞基因编辑、蛋白质功能、疫苗开发或抗肿瘤制剂的制备中的应用。
[0041]为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种无抗生素介入的细菌表达系统的构建方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。在本发明实施例中，所用的试剂和材料如非特殊说明，均为常规市售产品。
[0042]1、本发明使用的菌种、质粒
[0043]减毒型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK-Δ6；
[0044]腺嘌呤营养缺陷型铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌营养缺陷株)PAK-JΔ6(Ade)(PAK-Δ6背景下敲除染色体上的purEK基因)；
[0045]大肠杆菌DH5α(Ade)(DH5α背景下敲除染色体上的purEK基因)用于分子克隆(已公开，Watanabe W,Sampei G,Aiba A,Mizobuchi K.Identification and sequenceanalysis of Escherichia coli purE and purK genes encoding 5'-phosphoribosyl-5-amino-4-imidazole carboxylase for de novo purine biosynthesis.JBacteriol.1989Jan；171(1):198-204.doi:10.1128/jb.171.1.198-204.1989.PMID:2644189；PMCID:PMC209573.)；
[0046]大肠杆菌S17-1/λpir用于接合转移；
[0047]基因敲除载体pEX18Tc，载体pExoS54；
[0048]2、本发明使用的实验动物
[0049]雌性C57BL/6N小鼠(6-8周大小)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证编号SYXK(津)2019-0003，SPF环境12h光照-黑暗循环，21℃，30％相对湿度下饲养。所有的程序和实验均遵循国际接受的实验动物饲养使用标准。
[0050]3、本发明使用的试剂
[0051]DNA Marker、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP来自于Takara公司；
[0052]T4 DNA连接酶(Promega)、酵母提取物物(Yeast extract)和胰蛋白胨(Tryptone)购自英国Oxoid公司；
[0053]蔗糖(Sucrose)为美国Sigma公司产品；
[0054]琼脂糖购自BIOWEST；
[0055]琼脂粉(Bacto-agar)、D-谷氨酸、四环素和卡那霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0056]腺嘌呤购自天津希恩思生化科技有限公司；
[0057]基因组提取试剂盒(EasyPureGenomic DNA ExtractionKit)为全氏金公司产品；
[0058]质粒小提试剂盒(PlasmidMiniPrep Kit)为美国Axygen公司产品；
[0059]DNA纯化试剂盒(DNA clean&Concentrator)和DNA胶回收试剂盒(Zymoclean GelDNA RecoveryKit)为美国Zymo research公司产品；
[0060]Anti-Flag抗体为Sigma公司产品。
[0061]实施例1
[0062]构建腺嘌呤营养缺陷型菌株
[0063]以铜绿假单胞菌PAK-JΔ6为背景菌株，利用同源重组的方法无痕删除purEK基因构建营养缺陷型菌株PAK-JΔ6(Ade)，具体如下：
[0064]1、基因敲除质粒的构建
[0065]以PAK-JΔ6菌株基因组DNA为模板，PCR扩增purEK基因上下游1kb左右的同源臂片段。在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物的大小及大致浓度，并切胶回收同源臂DNA片段。取上述PCR产物，克隆到pEX18Tc质粒的EcoRI和HindIII之间，连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂布在含10μg/mL四环素(Tc)和10mM D型谷氨酸(D-Glu)的LB平板上筛选转化子，PCR和质粒酶切对转化子进行鉴定，鉴定阳性即得到基因敲除质粒pEX18Tc-purEKdeletion。
[0066]purEK基因上游同源臂扩增引物：
[0067]Pur-UF(SEQ ID NO.2):5’-CGTCGAAGATCGGCGTCGGG-3’
[0068]Pur-UR(SEQ ID NO.3):5’-GTCCGGCGCGTCAGAAACCA-3’
[0069]purEK基因下游同源臂扩增引物：
[0070]Pur-DF(SEQ ID NO.4):5’-GGCGTGCTGGCCTTCGAGTT-3’
[0071]Pur-DR(SEQ ID NO.5):5’-GCCCGGATAGGGCACCAGGA-3’
[0072]PCR程序：94℃10min；94℃1min，60℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
[0073]体系：1μL基因组模板，正反向引物各1μL，4μL 5×缓冲液，2μL dNTP，0.5μL Fast-pfu DNA聚合酶，去离子水补足20μL体系。
[0074]2、基因敲除菌株的构建
[0075]提取保存在大肠杆菌DH5a中的基因敲除质粒，使用化学转化的方法将该质粒转化到大肠杆菌S17感受态细胞中，得S17/pEX18Tc-purEK deletion细胞。运用接合转移的方法将S17/pEX18Tc-purEK deletion细胞中的基因敲除质粒转入到PAK-JΔ6菌株中，对基因组中的目标基因进行敲除。具体操作如下：
[0076]挑取新鲜划线培养的S17/pEX18Tc-purEK deletion单菌落，接种于3mL含有5μg/mLTc的新鲜无菌LB液体培养基培养基中，37℃，180rpm振荡过夜培养；同时，挑取新鲜划线培养的PAK-JΔ6单菌落，接种于3mL新鲜无菌LB液体培养基培养基中，37℃，180rpm振荡过夜培养；
[0077]次日分别以1:50的比例，转接过夜培养的S17/pEX18Tc-purEK deletion和PAK-JΔ6到3mL含有5μg/mL Tc和不含有抗生素的LB液体培养基培养基中，S17/pEX18Tc-purEKdeletion于37℃，180rpm振荡培养至对数期(OD600＝0.6～0.8)，PAK-JΔ6于42℃振荡培养到对数期(OD600＝0.8～1.0)；使用紫外分光光度计，测定并记录S17/pEX18Tc-purEKdeletion和PAK-JΔ6的OD600的数值；分别将S17/pEX18Tc-purEK deletion和PAK-JΔ6培养液，使用1.5mL离心管于16000g离心1min，收集菌体，弃去上清。加入1mL LB液体培养基，使用移液器吹散，于16000g离心1min，弃去上清，收集菌体，重复一次，然后将菌体重悬到1mL LB液体培养基中；将S17/pEX18Tc-purEK deletion和PAK-JΔ6以细菌个数比为10:1-5:1的比例混合，调整总菌量少于3×109CFU；
[0078]连接好膜结合用真空抽滤装置，向装置中加满75％的酒精杀菌，待所有酒精过滤到真空装置中的锥形瓶后，再次向装置中加满75％的酒精洗涤一次。最后向装置中加满无菌水洗涤两次，待无菌水全部真空过滤到锥形瓶后，用无菌镊子取一张0.45μm孔径的无菌的硝酸纤维素膜，小心地置于该装置的装膜位置，重新安装好真空抽滤装置；使用移液器将混合菌液转移到真空过滤装置中，真空过滤菌液到锥形瓶中，使混合好的S17/pEX18Tc-purEK deletion和PAK-JΔ6存留在硝酸纤维素膜上；用无菌镊子小心地将硝酸纤维素膜存有混合菌的一面朝上放于Nutrient Agar培养基平板上，将培养皿正置于37℃培养箱，静置培养7～16h；使用无菌镊子将硝酸纤维素膜小心地转移到一个11mm的无菌试管中，向试管中加入1mL LB液体培养基，漩涡振荡洗涤硝酸纤维素膜；将硝酸纤维素膜的洗脱培养基转移到1.5mL的无菌离心管中，使用无菌的LB液体培养基系列稀释到10-2；分别从原始洗下的菌液，稀释到10-1和10-2的离心管中各取100μL涂布于含有适当抗生素的平板上(50μg/mLTc，25μg/mL卡那霉素Kan)，于37℃培养箱静置培养24～48h；
[0079]挑取抗生素平板上长出的可能的单交换的单菌落，接种到1mL无抗生素的LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养8h左右，使其浓度达到109CFU/mL；使用新鲜无菌无抗生素的LB培养基，以1:10的比例，系列稀释上述培养液到细菌细胞浓度为104CFU/mL；分别从104，105，106CFU/mL离心管中各取100μL菌液，涂布到包含和不包含终浓度为7.5％蔗糖的L-Agar培养基(添加10mM D型谷氨酸)平板上，于37℃培养箱静置过夜培养；次日比较含有蔗糖的培养基平皿和不含有蔗糖的培养基平皿上的菌落数，含有蔗糖的平皿上出现的菌落数应该明显少于不含有蔗糖平板上的菌落数。
[0080]从含有7.5％蔗糖的培养基平皿上挑选单菌落，进一步于终浓度为7.5％蔗糖的L-Agar培养基平皿上纯化；将筛选到的双交换菌落，分别以单交换菌落和野生型菌株的培养液为对照，进行菌液PCR验证和抗生素抗性检测。
[0081]purEK基因敲除菌株(PAK-JΔ6(Ade))在LB液体培养基中可正常生长，在基本培养基M9中无法生长，需要补加50μg/mL的腺嘌呤才能生长(图1)。
[0082]实施例2
[0083]构建pExoS54(Ade)表达载体
[0084]PCR扩增purEK基因操纵子(1.9kb，包含purEK基因自身启动子)，克隆到大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭载体pExoS54中的NdeI酶切位点，获得表达载体pExoS54(Ade)，其质粒图谱如图2所示。
[0085]PCR扩增引物：
[0086]PurEK-F(SEQ ID NO.6):5’-ACAACCAGTCTGGCCGCTCG-3
[0087]PurEK-R(SEQ ID NO.7)：5’-CGCTCACGCCTCGATCAGCG-3’
[0088]将构建好的质粒pExoS54(Ade)转化入营养缺陷菌PAK-JΔ6(Ade)中，构建得到purEK基因回补株[PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)]，回补株可以在基本培养基M9中正常生长(图3)。
[0089]实施例3重组表达新型冠状病毒Spike-RBD抗原表位
[0090]将新型冠状病毒SARS-CoV-2的刺突蛋白中和表位(Spike-RBD，NCBI ReferenceSequence:YP_009724390.1)基因(SEQ ID NO.8)克隆于表达载体pExoS54(Ade)的SacI和HindIII位点上，获得Spike-RBD重组表达载体pExoS54(Ade)-RBD。
[0091]将pExoS54(Ade)-RBD转化入铜绿假单胞菌营养缺陷型菌株PAK-JΔ6(Ade)中，获得PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)-RBD菌株，在M9基本培养基中37℃，180rpm振荡培养，在终浓度为5mM的EGTA条件下诱导培养至OD600＝1.0，收集菌体进行制样；用抗Flag标签的抗体检测重组蛋白S54-RBD的表达；RpoA为细菌内参。
[0092]Western blot检测PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)-RBD菌株中外源蛋白RBD的表达情况(图4中泳道1)。同时利用mini-Tn7载体将S54-RBD基因整合到PAK-JΔ6菌株基因组上，通过Westernblot对比基因组整合表达与质粒表达RBD的差别，结果显示，由于在基因组上表达拷贝数低，大大限制了RBD的大量表达(图4中泳道2)，说明了在质粒上对抗原进行表达的必要性。
[0093]实施例4 PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)-RBD菌株作为疫苗可激活小鼠产生中和抗体
[0094]1、动物免疫
[0095]将PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)-RBD菌株简称为Δ6(Ade)-RBD疫苗。将小鼠随机分为三组：生理盐水对照组、空载体组[PAK-JΔ6(Ade)/pExoS54(Ade)]和Δ6(Ade)-RBD疫苗组，每组5只小鼠；以5×107CFU菌量进行鼻内接种，间隔两周一次，末次免疫后一周，摘眼球采血，室温静置2～4小时后，5000rpm离心5分钟，收集血清；取5-mL无菌试管12支，用1×PBS稀释小鼠血清，待用。
[0096]2、新冠病毒SARS-CoV-2中和实验
[0097]新冠病毒中和试验在BSL-3实验室中进行。来自免疫小鼠的血清与相同体积的SARS-CoV-2混合。将100mL病毒血清混合物转移到96孔板中的Vero-E6细胞中。轻轻晃动培养板混匀后于37℃，5％CO2培养箱中孵育1h。期间每20min轻轻晃动一次培养板。1h后，吸去培养上清，用200μL 1×PBS清洗两次，每孔更换为200μL含羧甲基纤维素、2％胎牛血清和2％双抗的DMEM培养液。于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h。吸去培养基，用1×PBS洗2次后，加入4％PFA，固定过夜。吸掉4％PFA，1×PBS洗2次，5min/次，0.2％Triton透膜10min，1×PBS洗2次。抗SARS-CoV-2(2019-nCoV)Nucleocapsid Antibody抗体(一抗；SinoBiologicalcat:40588-T62)50μL/孔，室温孵育2h，扣掉后1×PBS洗2次，Goat-anti-Rabbit IgG H&L(HRP)二抗(abcam)50μL/孔，室温孵育0.5h，扣掉后1×PBS洗2次。Western Blot底物(KPL)50μL/孔，室温孵育10min，扣掉后1×PBS洗2次。用软棉垫加吸水纸包住96孔板彻底拍干残留1×PBS，上机扫描计数。结果判定：病毒对照孔(VC)中细胞的发光着色面积应达到80％～95％，未感染的细胞对照(CC)应无发光病灶。如图5所示，Δ6(Ade)-RBD均能刺激小鼠产生中和抗体，阻止新冠病毒侵染Vero-E6细胞，而生理盐水组(sham)和空载菌组(vehicle)无中和抗体产生。
[0098]实施例5Δ6(Ade)-RBD疫苗可激活小鼠的T细胞免疫反应
[0099]Δ6(Ade)-RBD疫苗第一次加强免疫后7天(Day 21)，取免疫后小鼠的脾细胞，分离得到小鼠淋巴细胞，用RBD蛋白刺激16～24h后，通过ELISPOT检测淋巴细胞细胞因子的分泌情况，并对产生IFN-γ的斑点形成细胞(SFCs)进行计数。结果显示RBD抗原可刺激Δ6-RBD疫苗组小鼠的淋巴细胞产生IFN-γ，说明该疫苗可激发机体的T细胞免疫应答(图6)，具备长效性。
[0100]尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。