1.一种刺梨多糖，其特征在于所述刺梨多糖RRTP2-1的结构如下所示：

2.如权利要求1所述的刺梨多糖RRTP2-1的制备方法，其特征在于，所述刺梨多糖RRTP2-1的结构如图8所示。
3.如权利要求1所述的刺梨多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1粉碎：将刺梨的干燥果实切成适当大小的块状，用水清洗干净、晾干；
S2水提：将步骤S1所得刺梨果实加入水中浸泡，加热提取，过滤，得提取液和药渣；
S3分级醇沉：
将步骤S2所得提取液减压浓缩，得浓缩液1；向浓缩液1中加入乙醇，至乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀和上清液，得粗多糖RRT1和上清液1；
将上清液1减压浓缩，得浓缩液2；向浓缩液2中加入乙醇，至乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，得粗多糖RRT2；
其中10≤a＜b＜100；
S4纯化：
一次纯化：
将步骤S3所得粗多糖RRT1、RRT2进行除蛋白，透析，冻干，得刺梨多糖；
二次纯化：
将一次纯化后的多糖RRT2进行离子交换柱层析，用0~2 M的NaCl进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分，浓缩、冷冻干燥得刺梨多糖RRT2-1；
将RRT2-1再进行凝胶柱层析，用水进行洗脱，利用苯酚-硫酸法检测洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩、冷冻干燥，得RRTP2-1。
4. 如权利要求3所述的刺梨多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中水的添加量为所述下刺梨果实重量的5~12倍，加热温度为80~100 ℃，提取时间1~10 h。
5. 如权利要求3所述的刺梨多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中减压浓缩温度为40~70 ℃，静置的时间为10~36 h。
6.如权利要求1-5所述的刺梨多糖的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
取刺梨多糖样品RRTP2-1，完全酸水解，水解产物液PMP衍生化后液相色谱检测；
取刺梨多糖样品RRTP2-1，干燥，压片，红外光谱检测；
取刺梨多糖样品RRTP2-1，甲基化，水解、还原，乙酰化，进行GC-MS检测；
取刺梨多糖样品RRTP2-1溶于D2O，进行核磁共振分析。
7.如权利要求1所述的刺梨多糖在制备激活免疫的抗肿瘤药物中的应用。

技术领域
[0001]本发明属于医药及保健食品技术领域，具体涉及一种刺梨多糖的制备方法、鉴定方法和应用。
背景技术
[0002]癌症是全球主要的死亡原因之一，尤其是肺癌。根据最新统计，于2022年估算的约970万例癌症病例中，肺癌为首要原因。在180万癌症死亡人数中，死于肺癌的人数约占18.7%。根据不同的生长和扩散模式，肺癌可分为两类：小细胞癌症（SCLC）和非小细胞癌症（NSCLC），后者约占病例的80%~85%，是更为常见与致命的形式。尽管传统癌症治疗方式有一定的治疗效果，但5年内NSCLC的存活率仍不到20%。因此，迫切需要探索更加有效的创新方法来治疗癌症。
[0003]2018年诺贝尔生理学或医学奖被授予James P.Allison和Tasuku Honjo以表彰他们在肿瘤免疫治疗领域的突破，标志着癌症治疗取得重大进展。在肿瘤微环境中，免疫功能处于抑制状态。检查点抑制剂以及免疫激动剂等具有激活先天或获得性免疫反应的功能，因此被用于肿瘤免疫治疗。其中免疫激动剂通过激活免疫细胞分泌各种细胞因子，从而参与识别肿瘤抗原和肿瘤分泌的有害因子，进一步杀死肿瘤。在临床实践中，免疫检查点抑制剂和免疫激动剂，如香菇多糖、灵芝多糖、pembrolizumab和atezolizumab，已被用于肿瘤治疗或肿瘤辅助治疗，以增强身体免疫力，从而获得令人满意的治疗结果。免疫调节剂在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用，需要进一步的研究来了解其机制。
[0004]多糖是通过糖苷键连接单糖的生物聚合物。多糖在自然界中广泛分布，由于其多样性和显著的生物活性，如免疫调节、抗氧化特性、抗肿瘤作用、肠道微生物群的调节和抗病毒潜力，引起了人们的广泛关注。在这些活性中，免疫调节是多糖表现出的最突出的功能之一。研究表明，当肿瘤抗原或其他病原体入侵时，随后的多糖治疗可以激活人体防御系统内的免疫信号通路，并诱导各种免疫细胞因子的释放。这种激活可以有效地刺激免疫反应，调节免疫力，并消除病原体等有害因素。多糖的免疫调节特性在对抗肿瘤方面显示出有力的治疗效果。因此，某些多糖在临床实践中被用作抗癌剂或佐剂，用于增强机体免疫力。多糖在调节免疫方面具有独特的特性，在开发抗肿瘤新药方面具有重要的应用价值。
[0005]刺梨（Rosa roxburghii）属于蔷薇科植物，是一种珍贵的药食同源类植物。这种植物的果实富含维生素C，被认为具有极高的食用价值。刺梨果实可用于生产各种食品、饮料和保健品。刺梨果实在清除自由基、对抗癌症、免疫、预防动脉粥样硬化、治疗糖尿病和治疗其他疾病方面发挥着重要的药理作用。此外，刺梨中含有丰富的萜烯、单宁酸、有机酸、黄酮、多酚、多糖等有机化合物以及微量元素。其中刺梨多糖具有抗肿瘤效果，但是近年来国内外对刺梨果实中均一多糖的结构表征、抗肿瘤活性探索及机制研究较少。因此，期望将提取纯化得到的纯品刺梨多糖开发为具有免疫调节和抗肿瘤活性的药物。
发明内容
[0006]为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种刺梨多糖及其制备方法、鉴定方法和应用。本发明制备方法简单，反应条件温和，可用于放大生产；且本发明对得到的高纯度刺梨多糖化学结构进行了鉴定，明确了其成分并为其药理活性机制提供结构依据。同时，本发明得到的刺梨多糖为刺梨多糖药物、质量控制及深入研究其构效关系和作用机制奠定基础。
[0007]本发明提供了一种刺梨多糖RRTP2-1。发明人通过对刺梨多糖粗品提纯分离得到刺梨多糖RRTP2-1，且经结构分析得到其分子量范围为7000-10000 Da。
[0008]进一步地，所述刺梨多糖RRTP2-1的结构如图8所示。
[0009]同时，本发明也提供了一种刺梨多糖制备方法，包括以下步骤：
S1粉碎：将刺梨的干燥果实切成适当大小的块状，用水清洗干净、晾干；
S2水提：将步骤S1所得刺梨果实加入水中浸泡，加热提取，过滤，得提取液和药渣；
S3分级醇沉：
将步骤S2所得提取液减压浓缩，得浓缩液1；向浓缩液1中加入乙醇，至乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀和上清液，得粗多糖RRT1和上清液1；
将上清液1减压浓缩，得浓缩液2；向浓缩液2中加入乙醇，至乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，得粗多糖RRT2；
其中10≤a＜b＜100；
S4纯化：
一次纯化：
将步骤S3所得粗多糖RRT1、RRT2进行除蛋白，透析，冻干，得刺梨多糖；
二次纯化：
将一次纯化后的多糖RRT2进行离子交换柱层析，用0~2 M的NaCl进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分，浓缩、冷冻干燥得刺梨多糖RRT2-1；
将RRT2-1再进行凝胶柱层析，用水进行洗脱，利用苯酚-硫酸法检测洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩、冷冻干燥，得RRTP2-1。
[0010]本发明人通过研究发现刺梨果实块状的优选大小为1~5 cm3；同时，本发明采用热水浸提与分级醇沉法相结合，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对刺梨多糖进行初步分离，且高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的多糖与极性小、水溶性差的多糖分离，解决了传统水煮法提取多糖导致其后期分离繁杂、困难的问题。
[0011]进一步地，所述步骤S2中水的添加量为所述刺梨果实重量的5~12倍，加热温度为80~100 ℃，提取时间1~10 h。
[0012]进一步地，所述步骤S3中减压浓缩温度为40~70 ℃，静置的时间为10~36 h。
[0013]另外，本发明还提供了一种刺梨多糖的鉴定方法，包括以下步骤：
取刺梨多糖样品RRTP2-1，完全酸水解，水解产物液PMP衍生化后液相色谱检测；
取刺梨多糖样品RRTP2-1，干燥，压片，红外光谱检测；
取刺梨多糖样品RRTP2-1，甲基化，水解、还原，乙酰化，进行GC-MS检测；
取刺梨多糖样品RRTP2-1溶于D2O，进行核磁共振分析。
[0014]本发明人为了进一步开发刺梨这一宝贵资源，发掘新药源，通过大量实验研究得到本发明：以刺梨果实为原料，采用水提醇沉法提取分离得到粗多糖，对提取的粗多糖进行脱蛋白，然后利用离子交换层析和凝胶柱层析方法纯化刺梨粗多糖，首次制备出一种新的刺梨多糖纯品，对此多糖纯品的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定，成功得出了刺梨多糖的结构信息，其中刺梨多糖RRTP2-1为由葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成的杂多糖，主链由→5)-α-l-Araf-(1→，→6)-α-d-Glcp-(1→，→2,5)-α-l-Araf-(1→，→4,6)-β-d-Galp-(1→，和→3)-α-l-Araf-(1→组成，末端由α-l-Araf-(1→组成。
[0015]本发明还涉及了刺梨多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。并通过细胞实验和斑马鱼实验对其免疫调节活性与抗肿瘤活性及机制进行探究。
[0016]与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明采用水提醇沉法，对刺梨多糖进行初步分离，效果显著，且本制备方法简单，反应条件温和，可用于放大生产；
本发明通过柱层析法对刺梨粗多糖进行二次分离纯化，效果显著，首次制备出一种新的刺梨多糖纯品；
本发明对纯化得到的多糖纯品的结构进行了鉴定，明确了各多糖组分的理化性质及结构，为探究其药理活性机制提供结构依据；
本发明得到的刺梨多糖纯品，组分保存完好，结构明确，可显著抑制斑马鱼体内肿瘤的增殖、迁移和血管生成。此外，刺梨多糖纯品促进了斑马鱼体内免疫系统的激活，为刺梨多糖在医药领域的进一步应用提供理论基础。
[0017]同时，本发明为刺梨多糖药物、质量控制及深入研究其构效关系和作用机制奠定基础。
附图说明
[0018]图1为RRTP2-1单糖组成的高效液相色谱图；
图2为RRTP2-1的红外图谱；
图3为RRTP2-1的1H NMR图谱；
图4为RRTP2-1的13C NMR图谱；
图5为RRTP2-1的HSQC图谱；
图6为RRTP2-1的HMBC图谱；
图7为RRTP2-1的1H-1H COSY图谱；
图8为RRTP2-1的一级结构；
图9为RRTP2-1对HepG2和A549细胞生长的影响；
图10为RRTP2-1对斑马鱼移植瘤模型中A549细胞增殖迁移；
图11为RRTP2-1对转基因斑马鱼血管形成的影响；
图12为RRTP2-1对斑马鱼体内ROS和NO生成水平的影响。
具体实施方式
[0019]下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，但并不因此而限制本发明。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
[0020]实施例1 刺梨多糖的制备方法
所述刺梨多糖的制备方法包括以下步骤：
S1剪切：将6 kg的刺梨干燥果实切成1~5 cm3，得刺梨果实块状；
S2水提：向步骤S1所得刺梨果实中加入其重量10倍的水，加热至90 ℃提取，提取3h，收集提取液，药渣晾干，得提取液和药渣；
S3分级醇沉：
将步骤S2所得提取液于60 ℃减压浓缩后，加入乙醇至乙醇体积浓度为50%，室温静置24 h后，离心，收集沉淀和上清液，得浓缩液1和上清液1；
上清液1于60 ℃减压浓缩后，加入乙醇至乙醇体积浓度为80%，室温静置24 h后，离心，收集沉淀，得浓缩液2；
S4 纯化：利用Sevag法分别将步骤S3所得浓缩液2进行除蛋白，除蛋白后粗多糖用透析袋（截留分子量为3500 Da）进行透析，冻干，得刺梨多糖RRT2。
[0021]实施例2 刺梨多糖RRTP2-1
所述刺梨多糖RRTP2-1是由实施例1所得刺梨多糖RRT2二次纯化所得，具体方法如下：
1）离子交换柱层析：取400 mg实施例1所得刺梨多糖RRT2，溶于10 mL的去离子水中，上样于DEAE-Sepharose FF柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现2个峰，其中洗脱峰为0.05 M的NaCl洗脱部分（洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分），将所得洗脱液浓缩，透析（截留分子量为3500 Da），冷冻干燥后，得到一种多糖RRT2-1；
2）凝胶柱层析：将上述冻干后的多糖样品，用水进行溶解，离心，取上清液，上Sephadex G-75柱，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，冷冻干燥，得刺梨多糖RRTP2-1。
[0022]实施例3 刺梨多糖RRTP2-1的结构表征
(一)试验材料：刺梨多糖RRTP2-1。
[0023](二)试验方法：
1. 单糖组成分析(PMP柱前衍生化法)
样品处理：
精确称取4 mg试验材料置于具塞试管中，加入2 M三氟乙酸（TFA）2 mL，置于油浴锅中在120 ℃油浴水解4 h。冷却至室温，重复加甲醇旋干，去除TFA。样品旋干后，向其中加入500μL超纯水溶解样品，取100μL至EP管中，加入100μL 0.3 M氢氧化钠溶液，100μL 0.5 MPMP甲醇溶液，70 ℃水浴30 min，冷却至室温后加入105μL 0.3 M HCl溶液中和。用氯仿萃取三次，取水层过0.45μm滤膜后供HPLC分析。
[0024]混合单糖标准品的制备：
用单糖标准品（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖）配制成浓度为2 M的溶液，然后各取50μL标品于10 mL的离心管中，并与氢氧化钠溶液（500μL，0.3 M）和PMP甲醇溶液（500μL，0.5 M）混合，于70 °C加热30 min，然后冷却至室温加入510μL的盐酸（0.3 mol/L）中止反应，用氯仿萃取，取水层过0.45μm滤膜供HPLC分析。
[0025]色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（406 × 25 mm，5μm）；流动相：0.1 M磷酸盐（pH 6.9）‒乙腈（83:17）；检测波长：250 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：20μL。
[0026]2. 红外光谱检测
将干燥的试验材料2 mg与KBr研磨后，压片，用Perkin EImer FT/IR-100在4000‒400 cm-1范围内进行扫描。
[0027]3. 甲基化/GC-MS分析
称取干燥的试验材料4 mg于反应瓶中，加入无水DMSO 3 mL，再加入干燥的氢氧化钠600 mg，超声30 min，冰浴条件下，避光加入碘甲烷3 mL，分三次加入，每次冰浴超声30min，最后一次超声延长至1.5 h，反应结束后加入2 mL的蒸馏水分解残留的碘甲烷，并加入1 mL的氯仿萃取，离心取氯仿层。
[0028]甲基化完全后样品置于具塞试管中用2 M的TFA在120 ℃恒温油浴水解4 h，减压蒸发至干，再重复多次加入甲醇旋干至pH为中性，然后用20 mg的NaBD4在40 ℃下反应30min还原水解产物。再使用100μL的冰醋酸终止反应，样品在低压下旋干，然后加入2 mL的乙酰酐和吡啶用来乙酰化。保持95 ℃磁力搅拌反应2 h。然后反复加甲醇3次，旋干，用1 mL氯仿溶解，再用等体积的蒸馏水洗涤3次，除去水层，最后用无水硫酸钠干燥氯仿层，再过滤除去硫酸钠固体，减压浓缩蒸干，供GC-MS分析。
[0029]4. 核磁共振分析
取刺梨多糖样品冻干，取60 mg溶于0.6 mL D2O中，置于核磁管中，用400 MHz核磁共振仪Bruker AV-400记录其1H NMR、13C NMR、HSQC，HMBC、1H-1H COSY等图谱。
[0030](三)试验结果：
刺梨多糖RRTP2-1结构分析
1. 单糖组成分析
如图1所示，由HPLC图谱可知，RRTP2-1含有葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖。（色谱峰顺序：1：甘露糖，2：鼠李糖，3：葡萄糖醛酸，4：半乳糖醛酸，5：葡萄糖，6：半乳糖，7：木糖，8：阿拉伯糖，9：岩藻糖）。
[0031]2. 红外光谱分析
如图2所示，由RRTP2-1红外光谱图可知，RRTP2-1含有多糖的特征吸收峰：3421cm-1处为多糖中羟基的特征吸收峰，2932 cm-1处为C—H伸缩振动引起的吸收峰，1647 和1026 cm−1是多糖中结合水以及C—O—C伸缩振动引起的，在872以及621 cm-1附近处有吸收表明RRTP2-1中有α型的吡喃糖环。
[0032]3. 甲基化/GC-MS分析
RRTP2-1甲基化分析，经过水解，还原乙酰化后，GC-MS检测，与PMAA标准图谱对比可知，RRTP2-1含有→5)-α-l-Araf-(1→，→6)-α-d-Glcp-(1→，→2,5)-α-l-Araf-(1→，→4,6)-β-d-Galp-(1→，→3)-α-l-Araf-(1→，以及α-l-Araf-(1→等糖残基。
[0033]4. 核磁共振分析
本试验通过1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC对RRTP2-1的糖残基的碳原子和氢原子的化学位移进行归属，然后用HMBC确认其连接顺序。图3-7为RRTP2-1的1HNMR、13C NMR、HSQC、HMBC和1H-1H COSY图谱。
[0034]根据图3-7的核磁图谱，RRTP2-1碳氢归属如下表1所示。
[0035]表1 RRTP2-1核磁共振分析结果

[0036]n.d.：no detected.
综上所述：RRTP2-1是一种由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成的杂多糖，从GC-MS图谱可知说明其含有→5)-α-l-Araf-(1→，→6)-α-d-Glcp-(1→，→2,5)-α-l-Araf-(1→，→4,6)-β-d-Galp-(1→，→3)-α-l-Araf-(1→，以及α-l-Araf-(1→等糖残基，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出RRTP2-1的结构如图8所示。
[0037]实施例4刺梨多糖RRTP2-1体内抗肿瘤活性研究
(一)实验材料：刺梨多糖RRTP2-1。
[0038](二)实验对象：斑马鱼肿瘤细胞异种移植模型。
[0039](三)实验方法：
实验设计与分组：
本发明采用斑马鱼模型，设置空白组，阳性药组及刺梨多糖给药组，其中刺梨多糖RRTP2-1的浓度为100μg/mL，200μg/mL和400μg/mL，阳性药为香菇糖 (LNT)，浓度为400μg/mL。
[0040]对斑马鱼胚胎的毒性筛选：
首先将野生型AB品系斑马鱼交配产卵。胚胎受精24 h后，使用胰酶辅助斑马鱼胚胎脱膜，脱膜后斑马鱼胚胎继续放入培养箱进行培养。然后选择健康的斑马鱼胚胎，并用不同浓度的RRTP2-1（100、200和400µg/mL）处理48 h后。
[0041]以评估RRTP2-1对斑马鱼胚胎发育的影响。治疗后每24 h记录一次畸形率和死亡率。
[0042]使用斑马鱼肿瘤异种移植物的体内抗肿瘤实验：
首先准备荧光标记的A549细胞。收集、离心并重悬细胞，加入终浓度为2μM的CM-DiI染液后，先37 ℃孵育5 min，再4 ℃孵育15 min，即染色完成，除去染液并用PBS洗涤两次，加无血清DMEM培养基调整细胞密度为1×107个细胞/mL，备用。然后，将准备好的胚胎随机挑选正常健康的胚胎用三卡因麻醉，再用2%羧甲基纤维素钠固定，用显微注射系统将上述准备好的荧光标记的肿瘤细胞依次显微注射到卵黄囊中，注射的细胞悬液的量约为每个胚胎5 nL，将建立好的斑马鱼肿瘤异种移植模型放置回生化培养箱。6 h后，随机挑选胚胎转移到12孔板，每孔20个，加入待测化合物处理48 h。以香菇多糖（LNT）为阳性对照。在共聚焦显微镜下观察并拍照，用ImageJ统计荧光强度和转移灶点。
[0043](四)实验结果
将荧光标记的A549细胞显微注射到斑马鱼胚胎中，从而构建了斑马鱼异种移植模型。其中红色荧光的强度和灶点分别代表肿瘤的增殖和迁移。如图9所示，用RRTP2-1（100、200和400µg/mL）处理后，红色荧光的相对强度和转移灶点显著降低。通过ImageJ软件进一步定量分析显示，与对照组相比，荧光强度分别降低了31.5%（100μg/mL），49.8%（200μg/mL），和79.2%（400μg/mL）。同时，斑马鱼的红色荧光灶点数量分别降至对照组的8.2%（100μg/mL），42.5%（200μg/mL），以及67.1%（400μg/mL），表明RRTP2-1能有效抑制肿瘤的增殖和转移。
[0044]实施例5刺梨多糖RRTP2-1的体外抗肿瘤活性研究
(一)实验材料：刺梨多糖RRTP2-1。
[0045](二)实验对象：HepG2与A549细胞(由中国科学院上海细胞库提供)。
[0046](三)实验方法：
1. 实验设计与分组：
本发明采用人源肿瘤细胞HepG2和A549细胞为模型，设置空白组，刺梨多糖给药组，其中刺梨多糖RRTP2-1的给药浓度为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL， 和200μg/mL。
[0047]2. 母液的配置及细胞计数
取RRTP2-1样品20 mg，溶于1 mL的PBS缓冲盐中，将配制完的母液过0.22μm的滤膜并且紫外照射30 min灭菌，然后置于-20 ℃冰箱中待用。将培养皿置于超净工作台中，移除旧培养基，加入3 mL的PBS缓冲液清洗细胞两次，清洗完细胞后移除PBS缓冲液并向培养皿中加入3 mL胰蛋白酶，消化细胞2 min后再加入细胞培养液，反复吹打使其成为均匀的单细胞悬液。取20μL上述单细胞悬液加入180μL培养液中，反复吹打后取10μL于细胞计数板中计数，将细胞稀释为相应密度，铺板。
[0048]3. 给药
将HepG2或A549细胞接种到96孔板（1×104个/孔）或者6孔板（2×105个/孔）中，培养24 h后加入待测样品，刺梨多糖RRTP2-1给药浓度分别为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL。给药后将孔板置于CO2培养箱中培养48 h。
[0049]细胞活力测试
给药结束后，每孔加入5 mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液20μL，于CO2培养箱中培养4 h。4 h后移除96孔板中的MTT溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜(分析纯)溶解甲瓒结晶，用酶标仪检测492 nm下吸光度值(OD值)。计算样品对各个肿瘤细胞的增殖的抑制作用，实验重复三次。
[0050](四)实验结果
细胞活力检测：
如图10所示，不同浓度的刺梨多糖RRTP2-1对HepG2细胞的抑制率分别为4.1%（25μg/mL）、12.0%（50μg/mL）、16.5%（100μg/mL）和22.4%（200μg/mL），对A549细胞的抑制率分别为14.0%（25μg/mL）、23.5%（50μg/mL）、32.1%（100μg/mL）和35.5%（200μg/mL），表明RRTP2-1对肿瘤细胞增殖有轻微抑制作用。
[0051]实施例6刺梨多糖RRTP2-1的体内免疫调节活性研究
(一)实验材料：刺梨多糖RRTP2-1。
[0052](二)实验对象：斑马鱼胚胎。
[0053](三)实验方法：
1. 实验设计与分组：
本发明采用斑马鱼胚胎模型，设置空白组，刺梨多糖给药组，其中刺梨多糖RRTP2-1的给药浓度为100μg/mL，200μg/mL，和400μg/mL。
[0054]2. 斑马鱼胚胎的获取
成年斑马鱼在装有淡水的3L水槽中保持在28.5 ℃。采用NaCl和碳酸氢钠（NaHCO3）将淡水的电导率和pH分别保持在525 μs/cm和7.2。紫外线杀菌器用于淡水杀菌。斑马鱼每天喂食两次，并在14小时的光照/10小时的黑暗周期中饲养。繁殖后，收集、洗涤胚胎，并将其保存在胚胎缓冲液中，用于后续实验。
[0055]从成年斑马鱼身上取胚胎，将其放置在繁殖室过夜，混合30分钟以产生受精卵。胚胎在Holt缓冲液（NaCl 59.9 mM、KCl 0.7 mM、NaHCO30.3 mM和CaCl20.9 mM）中培养用于进一步实验。3. 给药
在受精后7-8小时（hpf），选择合适的胚胎（15个胚胎/组）并放入培养板（12孔）中，然后用不同浓度的RRTP80-1（100、200和400μg/mL）处理24小时。孵育后，每24小时将胚胎培养基更换为新鲜培养基，直到受精后3天（dpf）。然后将胚胎转移到24孔板中，并与DCFH-DA溶液（20μg/mL）孵育1小时（用于ROS检测）或DAF-FM DA（5μM）孵育2小时（用于NO检测）。孵育后，用新鲜胚胎培养基冲洗胚胎，然后用三卡因（0.02%）麻醉。使用共聚焦激光显微镜（Leica TCS SP8，Leica，Germany）捕获染色胚胎的照片。ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）用于量化单个斑马鱼胚胎的荧光强度。
[0056](四)实验结果
斑马鱼体内ROS和NO的分泌呈剂量依赖性增加。在100、200和400μg/mL下，ROS的生成水平增加了0.1、1.6和4.5倍，而NO的表达水平增加了0.03、0.4和0.5倍。结果表明，RRTP80-1可以激活体内的免疫调节功能。
[0057]实施例7刺梨多糖RRTP2-1体内抗血管生成活性研究
(一)实验材料：刺梨多糖RRTP2-1。
[0058](二)实验对象：转基因斑马鱼模型。
[0059](三)实验方法：
利用转基因斑马鱼模型进行抗血管活性研究
使用转基因斑马鱼Tg(fli1:EGFP)模型评估血管生成抑制作用。将一条转基因成年雌性斑马鱼和两条成年雄性斑马鱼用隔板隔开置于缸中，放置在28.5 ℃恒温生化培养箱中过夜。第二天早上光照半小时，取下隔板，等待30 min后取出，收集胚胎。胚胎在已灭菌的Holt buffer中培养，及时挑出不健康的胚胎，避免影响健康胚胎。胚胎培养6 h后，用把不同浓度的化合物处理斑马鱼胚胎，并持续孵育48 h。孵育结束后，用0.02%三卡因麻醉胚胎，并通过共焦显微镜观察节段间血管（ISV）的发育。ISV的长度通过ImageJ软件进行量化。
[0060](四)实验结果
斑马鱼体内血管生成抑制实验显示RRTP2-1以浓度依赖性的方式抑制血管生成，抑制率分别为11.1%（100μg/mL），20.8%（200μg/mL）和23.6%（400μg/mL）。
[0061]综上所述，本发明制备的刺梨多糖RRTP2-1通过抑制斑马鱼幼鱼体内肿瘤细胞的增殖和迁移以及血管形成发挥抗肿瘤作用。RRTP2-1对HepG2、A549细胞具有轻微的抑制效果。同时，RRTP2-1促进斑马鱼体内ROS与NO水平的生成来上调体内的免疫反应。因此，RRTP2-1可能成为开发新的抗肿瘤免疫药物的潜在资源。