1.长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14（Bifidobacterium longum subsp. Infantis）在制备抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品中的应用，所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的保藏号为CGMCC No.25762；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项。
2.长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂，其特征在于，所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂包括如下几项中的任意一项或多项：
1）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液；
2）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体重悬液；
3）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液；
4）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液；
5）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵培养液；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的保藏号为CGMCC No.25762。
3.根据权利要求2所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂，其特征在于，所述菌体重悬液、热灭活菌体重悬液和热灭活发酵培养液中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB3-14的浓度为1×104-9×1010cfu/mL。
4.根据权利要求2或3所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂，其特征在于，所述菌体重悬液和热灭活菌体重悬液的重悬剂包括双歧杆菌液体培养基。
5.权利要求2-4任一项所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14进行发酵培养，得到发酵培养液；
将所述发酵培养液进行固液分离，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液和长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体；
将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKUFB 3-14菌体重悬液；
将所述发酵培养液进行热灭活，得到热灭活发酵培养液；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液和长双歧杆菌婴儿亚种NKUFB 3-14热灭活菌体重悬液的制备方法包括如下两项中的任意一项：
1）将所述热灭活发酵培养液进行固液分离，分别得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液和热灭活的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体；
将所述热灭活的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液；
2）将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液进行热灭活，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液；
将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬后再进行热灭活，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述热灭活的条件包括：70-80℃加热5-10min。
7.权利要求2-4任一项所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或权利要求5或6所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂在食品和/或保健品中的应用。
8.权利要求2-4任一项所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或权利要求5或6所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂在制备抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品中的应用；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项。
9.根据权利要求1或8所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括抗氧化和/或清除自由基。
10.一种抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品，其特征在于，所述药品的有效成分包括长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14和/或长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂为权利要求2-4任一项所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或权利要求5或6所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂。

技术领域
[0001]本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB3-14及其后生元制剂在抗衰老和抗全身慢性炎症方面的应用。
背景技术
[0002]氧化衰老是基于自由基学说建立的一种致衰老形式。最新衰老的自由基学说认为，衰老发生的本质是体内氧化状态与还原状态的不平衡，通常是氧化状态＞还原状态。伴随着氧化自由基对衰老的诱导，诸如各种与年龄相关的应激反应、炎症反应、心肌纤维化、慢性肺炎、大脑认知功能下降等慢性疾病也相继发生。临床上治疗这些衰老带来的慢性疾病只能针对性靶向给药治疗。药物治疗虽然能单一缓解某项慢性疾病，但无法从根本上缓解机体的衰老程度。
[0003]以益生菌为基础制备得到的后生元作为一种可以避免益生菌过度增殖产生负面影响问题的新型益生物质引起了研究人员的广泛关注。不同益生菌的后生元制剂在清除氧化自由基、抗氧化衰老、抗衰老慢性疾病、缓解全身慢性炎症的应用上有不同的治疗机制。有些菌株的后生元制剂会改善肠道菌群的组成，有些则基于对肠道氧化应激状态的调节与缓解，通过肠-器官轴来调节、缓解各器官氧化应激状态，还有些益生菌的后生元制剂能够消除外源或内源的氧化自由基来减轻氧化应激程度。
[0004]长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14分离自婴儿粪便样本，经研究发现，长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14在缓解肥胖、调节体内脂肪代谢、缓解便秘以及在抑制肿瘤方面均具有较好的效果，但是尚未发现其在抗衰老和缓解慢性炎症方面的相关报道。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14及其后生元制剂在抗衰老和抗全身慢性炎症方面的应用，所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14及其后生元制剂均能够有效抗衰老和抗炎，且效果显著。
[0006]本发明提供了长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14（Bifidobacterium longumsubsp. Infantis）在制备抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品中的应用，所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的保藏号为CGMCC No.25762；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项。
[0007]本发明还提供了长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂，所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂包括如下几项中的任意一项或多项：
1）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液；
2）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体重悬液；
3）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液；
4）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液；
5）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵培养液；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的保藏号为CGMCC No.25762。
[0008]优选的，所述菌体重悬液、热灭活菌体重悬液和热灭活发酵培养液中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的浓度为1×104-9×1010cfu/mL。
[0009]优选的，所述菌体重悬液和热灭活菌体重悬液的重悬剂包括双歧杆菌液体培养基。
[0010]本发明还提供了上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂的制备方法，包括如下步骤：
将长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14进行发酵培养，得到发酵培养液；
将所述发酵培养液进行固液分离，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液和长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体；
将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体重悬液；
将所述发酵培养液进行热灭活，得到热灭活发酵培养液；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液和长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液的制备方法包括如下两项中的任意一项：
1）将所述热灭活发酵培养液进行固液分离，分别得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB3-14热灭活发酵上清液和热灭活的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体；
将所述热灭活的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液；
2）将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液进行热灭活，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液；
将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬后再进行热灭活，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液。
[0011]优选的，所述热灭活的条件包括：70-80℃加热5-10min。
[0012]本发明还提供了上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂在食品和/或保健品中的应用。
[0013]本发明还提供了上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂在制备抗衰老和/或抗全身慢性炎症药品中的应用；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项。
[0014]优选的，所述抗衰老包括抗氧化和/或清除自由基。
[0015]本发明还提供了一种抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品，所述药品的有效成分包括长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14和/或长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂为上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂。
[0016]有益效果：
本发明提供了长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14及其后生元制剂在抗衰老和抗全身慢性炎症方面的应用，所述长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14的后生元制剂包括长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液、长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体重悬液、长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液、长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液和长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵培养液中的一项或多项，尤其热灭活的发酵上清液、热灭活菌体重悬液和热灭活发酵培养液拥有与长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14活菌具有差异性的生物活性物质，可显著缓解氧化衰老程度；改善氧化衰老导致的衰老慢性疾病；增加结肠绒毛长度；调节主要器官和血清脂质代谢水平；降低血清和主要器官的炎症水平；缓解主要器官的氧化应激水平；增加结肠紧密连接蛋白数量及增加肠屏障；调节肠道菌群。本发明所述长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14后生元可显著抗氧化、清除自由基和缓解全身慢性炎症，以达到抗衰老和抗炎的效果。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0018]图1为实施例1中硝酸盐还原酶活性实验结果；
图2为实施例1中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14溶血性试验结果；
图3为实施例1中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14耐酸能力试验结果；
图4为实施例1中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14耐胆盐能力试验结果；
图5为实施例1中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB3-14 DPPH清除能力试验结果；
图6为实施例3中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14羟基自由基、超氧阴离子清除能力结果；
图7为实施例4中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14活菌和灭活菌代谢物相对丰度结果；
图8为实施例4中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的上清液和加热上清液中代谢物相对丰度结果；
图9为实施例5中ICR小鼠氧化衰老模型的建立的技术路线图；
图10为实施例5中小鼠体重相对值变化趋势结果图；
图11为实施例5中小鼠体重变化率结果图；
图12为实施例5中小鼠血清T-SOD、IL-6水平结果图；
图13为实施例5中K组和C组中小鼠心HE染色结果；
图14为实施例5中T1和T2组中小鼠心HE染色结果；
图15为实施例5中T3和T4组中小鼠心HE染色结果；
图16为实施例5中小鼠心肌异常计数统计结果；
图17为实施例5中小鼠心MDA、T-SOD、CAT水平测定结果；
图18为实施例5中小鼠心iNOS、TNF-α水平测定结果；
图19为实施例5中K组和C组中小鼠肺HE染色结果；
图20为实施例5中T1和T2组中小鼠肺HE染色结果；
图21为实施例5中T3和T4组中小鼠肺HE染色结果；
图22为实施例5中小鼠肺MDA水平测定结果；
图23为实施例5中小鼠肺T-SOD水平测定结果；
图24为实施例5中小鼠肺CAT水平测定结果；
图25为实施例5中小鼠肺iNOS、COX-2水平测定结果；
图26为实施例5中K组和C组中小鼠左海马CA1区HE染色结果；
图27为实施例5中T1和T2组中小鼠左海马CA1区HE染色结果；
图28为实施例5中T3和T4组中小鼠左海马CA1区HE染色结果；
图29为实施例5中小鼠左海马CA1区神经细胞层厚度；
图30为实施例5中小鼠脑MDA和T-SOD水平测定结果；
图31为实施例5中小鼠脑CAT水平测定结果；
图32为实施例5中小鼠脑iNOS水平和TNF-α水平测定结果；
图33为实施例5中K组和C组中小鼠肝脏HE染色结果；
图34为实施例5中T1和T2组中小鼠肝脏HE染色结果；
图35为实施例5中T3和T4组中小鼠肝脏HE染色结果；
图36为实施例5中小鼠肝脏MDA和T-SOD水平测定结果；
图37为实施例5中小鼠肝脏CAT水平测定结果；
图38为实施例5中小鼠肝脏iNOS水平和TNF-α水平测定结果；
图39为实施例5中K组、C组、T1组和T2组中小鼠结肠HE染色结果；
图40为实施例5中T3和T4组中小鼠结肠HE染色结果；
图41为实施例5中小鼠结肠绒毛长/隐窝深统计结果以及粘膜厚度测定结果；
图42为实施例5中小鼠结肠MDA和T-SOD水平测定结果；
图43为实施例5中小鼠结肠CAT水平测定结果；
图44为实施例5中小鼠结肠iNOS水平和TNF-α水平测定结果；
图45为实施例5中门水平物种丰度柱状图；
图46为实施例5中属水平物种丰度柱状图；
图47为实施例5中小鼠肠道微生物α-多样性结果；
图48为实施例5中K组和C组小鼠肠道微生物β多样性分析结果；
图49为实施例5中T1组和C组小鼠肠道微生物β多样性分析结果；
图50为实施例5中T2组和C组小鼠肠道微生物β多样性分析结果；
图51为实施例5中T3组和C组小鼠肠道微生物β多样性分析结果；
图52为实施例5中T3组和C组小鼠肠道微生物β多样性分析结果；
图53为实施例5中肠道微生物LEfSe差异分析结果。
具体实施方式
[0019]本发明提供了长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14（Bifidobacterium longumsubsp. Infantis）在制备抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品中的应用，所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的保藏号为CGMCC No.25762；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项。
[0020]本发明所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14在中国专利CN202310453211.X中已进行公开，且通过试验证明所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14为安全性菌株且具有较好的耐酸、耐胆盐和 DPPH清除能力，可用于人体和动物体。
[0021]本发明还提供了长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂，所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂包括如下几项中的任意一项或多项：
1）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液；
2）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体重悬液；
3）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液；
4）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液；
5）长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵培养液；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的保藏号为CGMCC No.25762。
[0022]本发明所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂优选包括热灭活发酵上清液、灭活菌体重悬液或热灭活发酵培养液。本发明所述菌体重悬液、热灭活菌体重悬液和热灭活发酵培养液中长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的浓度优选为1×104-9×1010cfu/mL，进一步优选为1×106-9×109cfu/mL，更优选为2×106-7×108cfu/mL。本发明所述菌体重悬液和热灭活菌体重悬液的重悬剂优选包括双歧杆菌液体培养基，更优选为BS液体培养基。
[0023]本发明还提供了上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂的制备方法，包括如下步骤：
将长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14进行发酵培养，得到发酵培养液；
将所述发酵培养液进行固液分离，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液和长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体；
将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体重悬液；
将所述发酵培养液进行热灭活，得到热灭活发酵培养液；
所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液和长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液的制备方法包括如下两项中的任意一项：
1）将所述热灭活发酵培养液进行固液分离，分别得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB3-14热灭活发酵上清液和热灭活的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体；
将所述热灭活的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液；
2）将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14发酵上清液进行热灭活，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活发酵上清液；
将所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体进行重悬后再进行热灭活，得到长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14热灭活菌体重悬液。
[0024]本发明所述发酵培养的温度优选为36-38℃，更优选为37℃；所述发酵培养的时间优选为15-20h，更优选为16-18h，即在所述发酵培养条件下优选培养至长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14的对数生长中期，更优选培养至OD值为2.0时。本发明所述热灭活的条件优选包括70-80℃加热5-10 min，更优选为80℃加热10min。本发明所述发酵培养优选为将长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14接种至液体培养基中进行培养，所述接种量优选为液体培养基体积的1%-3%，更优选为1%-2%；所述液体培养基优选为BS液体培养基。本发明所述固液分离的方式优选为离心，所述离心的转速优选为4000g，时间优选为10min。本发明在进行所述重悬之前，优选对固液分离得到的沉淀洗涤2-3次，所述洗涤的液体优选为重悬剂，所述重悬剂优选包括双歧杆菌液体培养基，更优选为BS液体培养基；所述洗涤的方式没有特殊限定，采用本领域中常规洗涤的方式即可。
[0025]本发明还提供了上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂在食品和/或保健品中的应用。
[0026]本发明还提供了上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂在制备抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品中的应用；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项。本发明通过将发酵培养液热灭活，可以使菌体释放出不同于长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14活菌或上清液中的物质，其抗衰老和抗全身慢性炎症的效果较长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14活菌和上清液更优。
[0027]本发明所述抗衰老优选包括抗氧化和/或清除自由基，更优选为抗氧化和清除自由基。
[0028]本发明还提供了一种抗衰老和/或抗全身慢性炎症的药品，所述药品的有效成分包括长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14和/或长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂；所述抗全身慢性炎症包括抗心脏、肺部、脑部和肝脏慢性炎症中的一项或多项；所述长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂为上述技术方案所述的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元制剂。本发明对所述药品中含有的其他辅料成分没有特殊限定，采用本领域药品中常用辅料即可。在本发明所述药品中，所述长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14或其后生元制剂的含量优选为1wt.%~99.9wt.%，优选为30wt.%~98wt.%。
[0029]为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0030]在本发明实施例中，MRS固体筛选培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，醋酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸锰0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂15.0g/L，吐温80 1.0g/L。
[0031]改良MRS液体培养基（MRSC）的配制如下：在半合成液体MRS培养基基础上添加0.05%（w/v）的L-半胱氨酸盐酸盐，即为改良MRS液体培养基。
[0032]BS液体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，硫酸亚铁0.3g/L，柠檬酸铋铵2.0g/L，亚硫酸钠6.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，葡萄糖5.0g/L。
[0033]下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0034]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]实施例1
[0036]长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14菌株安全性评价：
硝酸盐还原酶试验将长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14培养至三代稳定期，以空白硝酸盐培养基为阴性对照，按体积分数为1%接种量接种预先准备的硝酸盐培养基，每个接种管内添加适量无菌石蜡油，然后置于37℃厌氧培养48小时；然后依次滴加5%碘化钾溶液10滴、5%淀粉溶液10滴，涡旋混匀后观察并记录各培养管中的颜色变化。每个样品做三个平行，结果见图1。
[0037]由图1可以得出：长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14在硝酸盐还原酶活性测试中未发生颜色反应，不含具有活性的硝酸还原酶。
[0038]溶血性试验将长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14培养至三代稳定期，以金黄色葡萄球菌ATCC25923为阳性对照，在哥伦比亚血琼脂平板上划线，并置于37℃避光厌氧培养48小时，观察记录是否有溶血圈产生，细菌菌落周围出现的透明血液溶解区是β溶血，而细菌菌落周围出现绿色区域（α溶血）或无任何区域（γ溶血）被认为表明菌株是非溶血性的。每个样品做三个平行。结果见图2。图2中，右图为FB 3-14，左图为阳性对照。
[0039]由图2可知，长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14在哥伦比亚琼脂平板中生长是无溶血区域，为无溶血活性的γ溶血，表明该菌为安全性菌株。
[0040]3. 耐酸能力的测定
[0041]将长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14培养至三代稳定期，以体积分数为1%的接种量分别接种于pH值为3和4的MRSC液体培养基中，置于37℃厌氧培养箱中进行厌氧培养；分别取0时、3时的菌悬液并梯度稀释至原浓度的1×10-6，取200 μL稀释菌液于MRSC固体平板上，使用滚珠涂布的方式进行平板涂布，涂布完成的平板置于37℃厌氧培养箱中进行厌氧培养直至长出菌落，最后对平板菌落进行计数。结果见图3。
[0042]由图3可以得出：长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14在pH 4条件下培养3h后存活率为154.88%，在pH 3条件下培养3h后存活率为16.22%。
[0043]4. 耐胆盐能力的测定
[0044]长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14培养至三代稳定期，以体积分数为1%的接种量分别接种于胆盐浓度为0.05%以及0.1%的MRSC液体培养基中，置于37℃厌氧培养箱中进行厌氧培养；分别取0时、3时的菌悬液并梯度稀释至原浓度的1×10-6，取200 μL稀释菌液于MRSC固体平板上，使用滚珠涂布的方式进行平板涂布，涂布完成的平板置于37℃厌氧培养箱中进行厌氧培养直至长出菌落，最后对平板菌落进行计数。结果见图4。
[0045]由图4可以得出：在分别含有0.05%与0.1%胆盐的MRS培养基中培养3h后，存活率可达190.55%与1.32%。
[0046]5. DPPH清除能力的测定
[0047]0.2 mM DPPH无水乙醇溶液与待测样品以1:1（体积比）比例混匀，室温下黑暗中放置30min，然后，在8000×g离心10min后，在517 nm处测量分离的上清液的吸光度。DPPH自由基清除活性(%)计算如下：
DPPH清除率（%）=[1-((AS-AB))/AC] × 100%
[0048]式中：其中AS-样品的吸光度；
AB-样品和乙醇组成的空白的吸光度；
AC-DPPH溶液和去离子水组成的对照的吸光度。
[0049]待测样品的制备，制备了三种不同的样品，包括长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB3-14的细胞培养悬液，即图5中的细胞悬液；无细胞提取物，即图5中的无细胞提取物；无细胞上清液，即图5中的发酵上清液，进行测试，测试结果如图5所示。
[0050]长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14的细胞培养悬液、无细胞提取物以及无细胞上清液对DPPH自由基清除率可分别达43.45%、54.17%以及93.71%。
[0051]实施例2
[0052]长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元的制备：
将长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14按照体积分数2%的接种量接种于BS液体培养基中，接种后于37℃恒温培养箱中厌氧培养16~18h，至培养液OD值为2.0时，菌液浓度接近6.85×108CFU/mL。菌液于80℃水浴加热10min后得到长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14灭活菌体与加热后上清的混合液（即热灭活的发酵培养液），进一步将混合液4000g离心10min分离得到上清液与沉淀。上清液为加热后的长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14培养上清液；沉淀用适量BS液体培养基重悬后得到浓度为1×109CFU/mL的灭活长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14菌体。
[0053]实施例3
[0054]氧化自由基清除能力评价
[0055]实验评估长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14及其后生元制剂的抗氧化能力：
长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14菌体的制备：菌株于37℃厌氧培养箱培养至对数生长中期，离心（4000rpm, 4℃, 10 min）后取菌体经BS液体培养基洗涤后使用BS液体培养基重悬，得到具有生物活性的菌体重悬液，重悬液中的有效活菌浓度为1×109CFU/mL。
[0056]长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14后生元的制备：菌株于37℃厌氧培养箱培养至对数生长中期，离心（4000 rpm, 4℃, 10min）后取上清液80℃，10min水浴加热后作为无细胞上清液（对应后生元定义中的益生菌代谢产物），离心得到的菌体经BS液体培养基洗涤后使用BS液体培养基重悬，80℃水浴加热10min，得到无生物活性的菌体重悬液（对应后生元定义中的细胞壁片段、功能蛋白、细胞外多糖(EPS)、细胞裂解物、有机酸、抗氧化物质、肽聚糖衍生物等），重悬液中菌体的有效浓度为1×109CFU/mL。
[0057]羟基自由基清除能力测定H2O2/ Fe2+通过Fenton反应产生羟自由基，具有还原能力的长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14菌体、长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14后生元加入后抑制羟自由基将邻二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+的反应（羟自由基将邻二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+的反应导致536nm吸光度下降）。长双歧杆菌婴儿亚种 NKUFB 3-14菌体、长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14后生元对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了羟自由基的清除能力。
[0058]超氧阴离子清除能力测定AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO2－与对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，具有还原能力的长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14菌体、长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB3-14后生元加入后对超氧阴离子的清除会导致530nm吸光值下降，长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14菌体、长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14后生元造成的536nm吸光度下降程度，反映了超氧阴离子的清除能力。
[0059]将制备得到具有生物活性的菌体重悬液、灭活的菌体重悬液、菌体上清液、灭活的菌体与菌体上清的重悬液用于超氧阴离子清除试验与羟基自由基清除试验，得到清除能力如图6（在图6中，活菌体、灭活菌体和上清液分别表示的是菌体重悬液、灭活的菌体重悬液、菌体上清液）长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14活菌体对羟基自由基和超氧阴离子清除能力分别为5.88%，65.56%；灭活菌体对羟基自由基和超氧阴离子清除能力分别为7.81%，74.19%；上清液对羟基自由基和超氧阴离子清除能力分别为17.9%，91.25%；灭活的菌体与菌体上清的重悬液对羟基自由基和超氧阴离子清除能力分别为25.7%，93.47%。
[0060]实施例4
[0061]非靶向代谢测定长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14及其后生元制剂的主要活性成分
[0062]长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14菌体的制备：长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14于37℃厌氧培养箱培养至对数生长中期，离心（4000 rpm, 4℃, 10 min）后取菌体经BS液体培养基洗涤后使用BS液体培养基重悬，得到具有生物活性的菌体重悬液。
[0063]长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14后生元的制备：将长双歧杆菌婴儿亚种 NKUFB 3-14按照体积分数2%的接种量接种于BS液体培养基中，接种后于37℃恒温培养箱中厌氧培养16~18h，至培养液OD值为2.0时，菌液浓度接近6.85×108 CFU/mL。菌液于80℃水浴加热10min后得到长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14灭活菌体与加热后上清的混合液（即热灭活的发酵培养液），进一步将混合液4000g离心10min分离得到上清液与沉淀。上清液为加热后的长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14培养上清液；沉淀用适量BS液体培养基重悬后得到浓度为1×109CFU/mL灭活长双歧杆菌婴儿亚种 NKU FB 3-14菌体。
[0064]非靶向代谢组学分析在Acquity I-Class PLUS超高性能液体串联Waters XevoG2-XS QT上进行，配备Acquity UPLC HSS T3 （100×2.1 mm, 1.8µm;Waters, Milford,USA）使用（A） 0.1%甲酸水溶液和（B）甲醇。仪器参数设置为：喷雾电压3.5kV；鞘气流速35psi；辅助气流速:10L/min；离子传输管温度:320℃；离子导入射频电平:60；辅助气加热器温度:350℃。使用MassLynx V4.2收集的原始数据由Progenesis QI软件进行保留时间校正、峰提取和比对。然后通过综合公共图书馆和自建数据库对代谢物进行鉴定。得到的鉴定结果如图7和图8所示。
[0065]图7是活菌与灭活菌的代谢物相对丰度图，图中可以看出，相比于活菌，灭活菌出现了利于抗炎抗菌的7-羟基香豆素等活菌中未出现的活性物质，同时灭活菌中可抑制铁死亡的反式吲哚丙烯酸、可调节精神节律的DL-色氨酸等活性物质相对丰度上升；图8是未加热上清液与加热上清液的代谢物相对丰度图，两者的代谢物差异较小，但加热后的上清液中出现了更多种类的氨基酸如调节免疫力，缓解压力的缬氨酸等。
[0066]综合考量，从活性成分的角度，长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14的后生元制剂具有抗衰老、缓解全身慢性炎症方面的益生能力。
[0067]实施例5
[0068]小鼠体内实验验证长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14对衰老的改善作用
[0069]通过构建D-半乳糖诱导的氧化衰老模型，并进行长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14后生元制剂的连续灌胃，验证其改善氧化应激导致的衰老的能力。
[0070]1.ICR小鼠氧化衰老模型的建立，技术路线如图9所示。
[0071]六周龄，雄性SPF级ICR小鼠购于维通利华生物技术公司，饲养于恒温25 ℃，相对湿度55 %，人工设置12 h光-暗循环的环境中。小鼠自由进食进水。一周适应环境期后，60只小鼠随机均分为6组：模型对照组（K组）、模型组（C组）、长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14灭活菌体加无细胞上清组（T1组，灭活菌体有效浓度为1×109CFU/mL，无细胞上清为热灭活后的上清）、长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14灭活菌体BS培养液重悬组（T2组，灭活菌体有效浓度为1×109CFU/mL）、长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14上清组（T3组）、长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14活菌体BS培养液重悬组（T4组，活菌体有效浓度为1×109CFU/mL）。
[0072]上述各组分的制备方法同实施例4。
[0073]适应性饲养1周后进入干预期。干预期持续6周，K组与C组每天灌胃0.4 mL BS液体培养基，T2组灌胃0.4mL BS重悬后的灭活菌体、T3组灌胃0.4mL上清液、T1组灌胃0.4mL灭活菌体与上清混合液、T4组灌胃0.4 mL重悬后的活菌体。第1周开始造模，K组、T1-T4组均皮下注射0.4mL 250mg/kg D-半乳糖溶液，模型对照组皮下注射0.4mL生理盐水。
[0074]2.小鼠体重变化趋势及小鼠体重变化率测定
[0075]造模周期内，每七日对小鼠体重进行测量记录，结果见图10-11。
[0076]由图10可知，模型组（C组）体重低于模型对照组（K组），表明D-半乳糖皮下注射导致了小鼠体重的降低。图11展现了各组小鼠每周的体重变化率。而不论体重变化趋势还是从体重变化率，上清+灭活菌体组（T1组），灭活菌体组（T2组），上清组（T3组），活菌组（T4组）均出现了正向调节，表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元能够缓解氧化衰老导致的体重降低，进而说明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元在缓解氧化衰老方面具有非常积极的作用。
[0077]3.试剂盒检测小鼠血清中氧化物质水平、促炎因子水平的测定
[0078]使用商用试剂盒（酶标）检测小鼠血清中总超氧化物歧化酶T-SOD水平。
[0079]使用商用试剂盒（酶标）测定血清中促炎因子IL-6水平。
[0080]小鼠血清T-SOD水平、IL-6水平见图12，图12中小鼠血清T-SOD水平，模型组（C组）显著低于模型对照组（K组）、T1组、T2组、T3组、T4组，说明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元可以通过提高血液种抗氧化酶活性来缓解全身的氧化应激状态；图中小鼠血清IL-6水平，模型组（C组）显著高于模型对照组（K组）、T1组、T2组、T3组、T4组。IL-6的水平高低反映炎症水平高低，同时IL-6是少数于炎症发展初期便出现含量变化的炎症因子。图中小鼠血清IL-6水平，模型组（C组）显著高于模型对照组（K组）、T1组、T2组、T3组、T4组。说明FB 3-14后生元可以在炎症发展的初期提供积极的缓解全身炎症的作用。
[0081]4.小鼠组织器官HE染色病理学分析测定
[0082]将各组小鼠解剖后取新鲜心、肺、脑、肝脏、远端结肠组织放入多聚甲醛固定液，浸泡后，过夜冲洗。将样品依次经体积分数为0％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入体积分数为95％、100％各脱水2次，每次20min。放入1/2体积纯酒精，1/2体积二甲苯等量混合液15min，多次放入纯二甲苯溶液中，每次15min至透明为止。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60min来除去透明剂。将处理好的样品进行包埋切片、展片、烤片、H&E染色与封片。
[0083]小鼠心脏HE染色结果见图13-15，图13-15中的标尺为100 μm。选取相同放大倍数下的视野，对心肌切片进行炎症浸润、细胞核固缩、心肌纤维紊乱等进行计数，统计各组的异常数目如图16。心肌细胞的炎症浸润、心肌纤维紊乱和心肌细胞肥大等异常与宏观的心肌炎、心律失常和心肌肥大相关联，模型组（C组）与模型对照组（K组）、T1组、T2组、T3组、T4组相比，异常出现的个数显著更多，表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元不仅具有针对心的抗衰老、炎症缓解作用，同时具备缓解常见的衰老导致的心脏慢性疾病的健康效益。
[0084]小鼠肺HE染色结果见图19-21，图19-21中的标尺为100 μm。光学显微镜下观察肺部组织切片。良好的肺泡形态是衡量肺部健康的重要指标，肺的正常运行依赖肺泡良好的生理状态，相比于模型对照组，模型组的肺泡出现明显皱缩，肺泡形态异常，部分可以观察到炎性浸润和纤维化。而与模型组（C组）相比，T1组、T2组、T3组、T4组四组的肺泡皱缩不明显，肺泡形态异常的出现减少，表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元具有针对肺的抗衰老、炎症缓解作用，同时能够对肺泡生理状态、肺部生理功能维持产生积极的影响。
[0085]小鼠脑HE染色结果见图26-28，图26-28中的标尺为100 μm。小鼠海马CA1区与记忆力衰减、阿兹海默症等关联紧密。正常的CA1区神经细胞层细胞形态正常，细胞层紧密，而衰老个体的CA1区出现大量神经细胞的形态异常与死亡，神经细胞层松散。光学显微镜下观察海马体CA1区的神经细胞层，与模型对照组（K组）相比，模型组（C组）表现出明显的神经细胞核固缩、排列松散等负面特征，而摄入长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14活菌及其后生元制剂的四组中，这种负面特征得到了显著的缓解。通过测量海马体CA1区的神经细胞层厚度可以将这种缓解表现更显著，在对各组海马体CA1区的神经细胞层厚度统计中，图29显示，模型组的神经细胞层厚度明显高于其他组别，表明模型组的神经细胞层中的神经细胞排列更为松散，而摄入NKU FB 3-14及其后生元制剂的四组中，神经细胞层的厚度显著降低。
[0086]上述结果表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元针对脑海马体的抗衰老、炎症缓解作用。于此基础上，对于衰老个体中常见的记忆力衰减、阿兹海默症等海马功能失调或下降引发的负面结果，长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元具备潜在的缓解能力。
[0087]小鼠肝脏HE染色结果见图33-35，图33-35中的标尺为100 μm。光学显微镜下观察肝组织 HE 染色切片，相比于模型对照组（K组），模型组（C组）的肝组织出现明显且数量较多的空泡，且模型组的肝小叶出现炎性浸润，肝小叶形态出现异常。而摄入长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14及其后生元制剂的T1组、T2组、T3组、T4组的四组中，可以发现空泡大小和数量明显减少，肝小叶形态正常。
[0088]以上结果表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元针对肝的抗衰老、缓解肝脏慢性炎症的作用。其对肝小叶形态和生理功能的维护作用也反映长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元对衰老个体肝功能下降以及肝慢性疾病具备潜在的调节改善能力。
[0089]小鼠结肠HE染色、绒毛长/隐窝深统计结果以及结肠外粘膜厚度统计结果见图39-41，图39-41中的标尺为100 μm。由HE染色可知，模型组（C组）与模型对照组（K组）相比，模型组肠粘膜显示杯状细胞、上皮细胞坏死性丢失和腺体稀疏排列，而长双歧杆菌婴儿亚种NKUFB 3-14及其后生元制剂组中这一负面情况得到显著缓解，长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14及其后生元制剂组中杯状细胞数量明显上升、上皮细胞具有更规则的形态。此外，FB 3-14 及其后生元组与模型组相比，结肠外粘膜厚度显著上升；FB 3-14 及其后生元组与模型对照组相比，小鼠的绒毛长/隐窝深升高，说明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元不仅对结肠良好生理结构的维持产生积极作用，同时可以缓解结肠的衰老程度和结肠慢性炎症。
[0090]5.试剂盒检测小鼠器官中氧化物质水平、促炎因子水平的测定
[0091]5.1使用MDA检测试剂盒、总超氧化物歧化酶T-SOD活力检测试剂盒、过氧化氢酶CAT活力检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测小鼠心MDA含量、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力，评估衡量各组小鼠心的氧化程度。
[0092]使用试剂盒（酶标）检测小鼠心炎症标记物iNOS（一氧化氮合成酶）、TNF-α水平，以此衡量小鼠心的炎症与衰老水平。
[0093]小鼠心MDA水平、T-SOD水平、CAT水平见图17，图中小鼠心MDA水平，模型组（C组）显著高于模型对照组（K组）、T1组、T2组、T4组；小鼠心T-SOD水平和CAT水平模型组（C组）显著低于模型对照组（K组）、T1组、T2组、T3组，表明FB 3-14后生元可以通过降低心组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解心的氧化应激状态；小鼠心iNOS水平、TNF-α水平见图18，图中小鼠心iNOS水平，模型组（C组）显著高于模型对照组（K组）、T1组、T2组、T3组、T4组；TNF-α水平，模型组（C组）显著高于模型对照组（K组）、T1组、T2组、T4组。表明FB 3-14后生元可以缓解心的慢性炎症。进一步的，结合切片的结果，上述数据从小分子生化标志物的角度表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元一方面降低心组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解心的氧化应激状态，另一方面缓解炎症，以实现心抗衰老、抗氧化、清除自由基、缓解心慢性炎症的益生目的。
[0094]5.2使用MDA检测试剂盒、总超氧化物歧化酶T-SOD活力检测试剂盒、过氧化氢酶CAT活力检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测小鼠肺MDA含量、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力，评估衡量各组小鼠肺的氧化程度。
[0095]使用试剂盒（酶标）检测小鼠肺炎症标记物iNOS（一氧化氮合成酶）、COX-2水平，以此衡量小鼠心的炎症与衰老水平。
[0096]小鼠肺MDA水平、T-SOD水平、CAT水平见图22-24，图中小鼠肺MDA水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组；小鼠心T-SOD水平，模型组（C组）显著低于模型对照组K、T1组；CAT水平模型组（C组）显著低于模型对照组K、T1组、T2组、上清组T3组，表明FB 3-14后生元可以通过降低肺组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解肺的氧化应激状态；小鼠肺iNOS水平、COX-2水平见图25，图中小鼠肺iNOS水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组、T2组；COX-2水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组。表明FB 3-14后生元可以缓解肺的慢性炎症。进一步的，结合切片的结果，上述数据从小分子生化标志物的角度表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元一方面降低肺组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解肺的氧化应激状态，另一方面缓解炎症，以实现肺抗衰老、抗氧化、清除自由基、缓解肺慢性炎症的益生目的。
[0097]5.3使用MDA检测试剂盒、总超氧化物歧化酶T-SOD活力检测试剂盒、过氧化氢酶CAT活力检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测小鼠脑MDA含量、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力，评估衡量各组小鼠脑的氧化程度。
[0098]使用试剂盒（酶标）检测小鼠脑炎症标记物iNOS（一氧化氮合成酶）、TNF-α水平，以此衡量小鼠脑的炎症与衰老水平。
[0099]小鼠脑MDA水平、T-SOD水平、CAT水平见图30-31，图中小鼠脑MDA水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组、T4组；小鼠脑T-SOD水平和CAT水平模型组（C组）显著低于模型对照组K、T1组、T2组、T3组、T4组，表明FB 3-14后生元可以通过降低脑组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解脑的氧化应激状态；小鼠脑iNOS水平、TNF-α水平见图32 ，图中小鼠脑iNOS水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组；TNF-α水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组、T2组、T4组。长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元可以缓解脑的慢性炎症。进一步的，结合切片的结果，上述数据从小分子生化标志物的角度表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元一方面降低脑组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解脑的氧化应激状态，另一方面缓解炎症，以实现脑抗衰老、抗氧化、清除自由基、缓解脑慢性炎症的益生目的。
[0100]5.4使用MDA检测试剂盒、总超氧化物歧化酶T-SOD活力检测试剂盒、过氧化氢酶CAT活力检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测小鼠肝MDA含量、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力，评估衡量各组小鼠肝脏的氧化程度。
[0101]使用试剂盒（酶标）检测小鼠肝脏炎症标记物iNOS（一氧化氮合成酶）、TNF-α水平，以此衡量小鼠肝脏的炎症与衰老水平。
[0102]小鼠肝脏MDA水平、T-SOD水平、CAT水平见图36-37，图中小鼠肝脏MDA水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组、T2组、T3组、T4组；小鼠肝脏T-SOD水平和CAT水平模型组（C组）显著低于模型对照组K、T1组、T2组、T3组、T4组，表明FB 3-14后生元可以通过降低肝脏组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解肝脏的氧化应激状态；小鼠肝脏iNOS水平、TNF-α水平见图38，图中小鼠肝脏iNOS水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组，T2组；TNF-α水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组、T2组。表明FB 3-14后生元可以缓解肝脏的慢性炎症。进一步的，结合切片的结果，上述数据从小分子生化标志物的角度表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元一方面降低肝组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解肝的氧化应激状态，另一方面缓解炎症，以实现肝抗衰老、抗氧化、清除自由基、缓解肝慢性炎症的益生目的。
[0103]5.5使用MDA检测试剂盒、总超氧化物歧化酶T-SOD活力检测试剂盒、过氧化氢酶CAT活力检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测小鼠结肠MDA含量、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力，评估衡量各组小鼠结肠的氧化程度。
[0104]使用试剂盒（酶标）检测小鼠结肠炎症标记物iNOS（一氧化氮合成酶）、TNF-α水平，以此衡量小鼠结肠的炎症与衰老水平。
[0105]小鼠结肠MDA水平、T-SOD水平、CAT水平见图42-43，图中小鼠结肠MDA水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组、T2组、T3组、T4组；小鼠结肠T-SOD水平和CAT水平模型组（C组）显著低于模型对照组K、T1组、T2组、T3组、T4组，表明FB 3-14后生元可以通过降低结肠组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解结肠的氧化应激状态；小鼠结肠iNOS水平、TNF-α水平见图44，图中小鼠结肠iNOS水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组，T2组、T4组；TNF-α水平，模型组（C组）显著高于模型对照组K、T1组、T2组、T3组、T4组。表明FB3-14后生元可以缓解结肠的慢性炎症。进一步的，结合切片，上述数据从小分子生化标志物的角度表明长双歧杆菌婴儿亚种NKU FB 3-14后生元一方面降低结肠组织氧化因子水平，提高抗氧化酶活性来缓解结肠的氧化应激状态，另一方面缓解炎症，以实现结肠抗衰老、抗氧化、清除自由基、缓解结肠慢性炎症的益生目的。
[0106]7. 16S rRNA基因微生物测序
[0107]盲肠总DNA提取使用QIAamp DNA粪便minikit试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）依照生产厂家的说明书。总DNA含量标准化到1ng/μL。16S rRNA的V3-V4区进行扩增，上游引物是341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'（SEQ ID NO.1)，下游引物是802R：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'（SEQ ID NO.2）。PCR反应程序如下：10ng的纯的DNA，15μL的高保真DNA聚合酶和PCR预混液，200nmol/L的上游引物和下游引物，无核酸酶的水，最终体积是30μL。PCR循环条件为98℃，1min，单个循环包括（1）变性：对双链DNA模板进行加热，使其解离；（2）退火：被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合；（3）延伸：DNA聚合酶沿着模板链将引物3'端进行延伸，30个循环98℃ 10s，50℃ 30s，72℃ 5min。PCR产物被定量，然后纯化，使用Illumina MeSeq平台测序，测序深度至少每个样品20000条序列。
[0108]QIIME分析软件使用FLASH过程将序列合并。双末端加入的序列使用GreenGenes数据集和UPARSE算法以97 %序列相似性归并为一个操作分类单元（OTUs）。每个OTU的代表序列被比对，然后RDP classifier用来注释每个代表序列的分类学信息。分析包括每个分类学水平（如门，纲，目，科，属等）。In-house Perl脚本用来分析样品内的α多样性和样品间的β多样性。主坐标分析（PCoA）使用Unweighted unifrac方法用来评估实验样品之间的差异。所有样品都用来计算α多样性包括丰度（richness）和多样性（diversity）。使用UCLUST版本1.2.22分析16S rRNA基因序列信息的分类学信息针对Silva119 16S rRNA数据集使用90 %置信区间。PICRUSt分析用来预测微生物功能，标注的OTUs的丰度使用LEfSe网上工具明晰不同处理组的高代表性菌群。
[0109]肠道微生物的丰度和多样性分析结果见图45-53。
[0110]图45为门水平物种丰富柱状图，模型对照组（K）小鼠菌群结果显示降低了疣微菌门（Verrucomicrobiota）和厚壁菌门（Firmicutes）的丰度；显著增加了脱硫弧菌门（Desulfovibrio）丰度。相比空白模型组（C），T1组显著增加了拟杆菌门（Bacteroidota）的丰度，轻微降低了厚壁菌门（Firmicutes）的丰度，显著降低了疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度；T2组则显著增加了疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度；T3组增加了厚壁菌门（Firmicutes）的丰度，轻微降低了疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度；T4组显著增加了拟杆菌门（Bacteroidota）的丰度，轻微降低了疣微菌门（Verrucomicrobiota）丰度。
[0111]进一步分析，图46为属水平物种丰富柱状图，模型对照组（K）显著增加了粘螺菌属（Mucispirillum）；减少了阿克曼菌属（Akkermansia）、拟杆菌属（Bacteroides）和普雷沃氏菌属（Alloprevotella）；T1组显著增加了另枝菌属（Alistipes）、理研菌属（Rikenellacea）和布劳特氏菌属（Blautia）；减少了普雷沃氏菌属（Alloprevotella）和拟杆菌属（Bacteroides）；T2组显著增加了阿克曼菌属（Akkermansia）和另枝菌属（Alistipes）；减少了拟杆菌（Bacteroides）和颤螺旋菌属（Oscillospiraceae）；T3组显著增加了普拉梭菌属（Faecalibaculum）和普雷沃氏菌属（Alloprevotella）；减少了阿克曼菌属（Akkermansia）；T4组显著增加了普雷沃氏菌属（Alloprevotella）和布劳特氏菌属（Blautia）；减少了拟杆菌属（Bacteroides）和颤螺旋菌属（Oscillospiraceae）。
[0112]图47为小鼠肠道微生物的α-多样性分析结果，Chao1和shannon指数用于微生物丰度和多样性分析。六个组在Chao1和shannon指数上并无明显差异。
[0113]图48-52为小鼠肠道微生物的β-多样性分析结果，不同样品间（模型对照组K、空白模型组C、T1组、T2组、T3组、T4组）使用PCA（Principal Components Analysis）即主成分分析，进行肠道微生物的系统发生学差异分析（β多样性），算法采用标准主成分分析算法。空白模型组C、T1组、T2组、T3组、T4组与模型对照组K相比，具有一定的偏离，说明D-半乳糖对小鼠肠道微生物结构产生影响，同时说明灌胃上清+灭活菌、上清、活菌能够在D-半乳糖的影响下对小鼠肠道微生物结构产生影响，进而推测上清+灭活菌、上清、活菌可能通过改变肠道微生物结构来对缓解衰老、调节衰老导致的慢性疾病产生积极影响，而灭活菌组对小鼠的肠道微生物结构影响并不大，其可能通过其他途径来对缓解衰老、调节衰老导致的慢性疾病产生积极影响。
[0114]图53为小鼠肠道微生物的LefSe分析图，通过LefSe分析图可以确定由长双歧杆菌婴儿亚种FB 3-14处理改善代谢条件的相关微生物。LefSe图表明，空白模型组（C）在颤杆菌属（Oscillospiraceae）明显高丰度；T1组在副拟杆菌种（Parabacteroides）明显高丰度；T2组在血尿杆菌属（Turicibacter）明显高丰度；T3组在普拉梭菌属（Faecalibaculum）和普雷沃氏菌属（Alloprevotella）明显高丰度；模型对照组K在粘螺菌属（Mucispirillum）明显高丰度；活菌组T4未出现明显高丰度的菌属。
[0115]尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。