1.一种检测SARS-CoV-2的电化学适配体传感器，其特征在于，包括：
SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体，激活剂链，CRISPR/Cas12a蛋白，crRNA，多聚腺苷酸-亚甲基蓝和金电极；
所述SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述激活剂链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述多聚腺苷酸-亚甲基蓝的结构为(A)nCCC-MB；其中，n表示A的数量，n=5-10，A表示腺苷酸，C表示胞苷酸，MB表示亚甲基蓝；
所述SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体和激活剂链杂交为拱形探针；
所述多聚腺苷酸-亚甲基蓝修饰于金电极表面。
2.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体和激活剂链的摩尔比为2:1-1:1；
所述CRISPR/Cas12a蛋白和crRNA的摩尔比为4:1-1:2；
所述激活剂链和crRNA的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述电化学适配体传感器还包括缓冲液，所述缓冲液的pH为7.0-7.6；
所述电化学适配体传感器还包括参比电极和对电极。
4.根据权利要求3所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述金电极以单电极型丝网印刷电极代替，
所述金电极和参比电极以双电极型丝网印刷电极代替，
所述金电极、参比电极和对电极以三电极型丝网印刷电极代替。
5.一种包含如权利要求1-4任一所述电化学适配体传感器的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白或重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的梯度溶液。
7.一种如权利要求1-4任一所述电化学适配体传感器或如权利要求5-6任一所述试剂盒在检测新型冠状病毒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将多聚腺苷酸-亚甲基蓝溶液滴加于金电极表面孵育，获得修饰多聚腺苷酸-亚甲基蓝的金电极；
（2）将SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体和激活剂链在缓冲液中杂交，获得拱形探针溶液；
（3）将拱形探针溶液分别和重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的梯度溶液或待测样品混合后孵育；
（4）CRISPR/Cas12a蛋白溶液和crRNA溶液混合后孵育；
（5）将步骤（3）和（4）的产物混合后孵育；
（6）将步骤（5）的产物滴加到修饰多聚腺苷酸-亚甲基蓝的金电极上孵育，加入参比电极和对电极采用差分脉冲伏安法测量电流信号变化；
（7）根据重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的梯度溶液的电流信号变化作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测样品电流信号变化计算浓度。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，孵育温度为25℃；步骤（4）、（5）和（6）中，孵育温度为37℃；
步骤（6）中，孵育时间不小于20min；所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为Pt电极；测量参数为：电位设置0~-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s。

技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒的电化学适配体传感器。
背景技术
[0002]冠状病毒（Coronavirus）是具有外套膜的正链单股RNA病毒，是感染人和脊椎动物的病原体，可引起多种急慢性疾病。到目前为止，能够使人类致病的冠状病毒一共有7种，包括SARS冠状病毒和MERS冠状病毒等。2019年起在全球爆发的新型冠状病毒，世界卫生组织命名为“2019新型冠状病毒（2019-nCoV）”，由这一病毒导致的疾病的正式名称为“COVID-19”。国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）宣布，新型冠状病毒（2019-nCoV）的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severeacute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。新型冠状病毒可以人传人，对比SARS冠状病毒，SARS-CoV-2致死率低，但传播较快，SARS-CoV-2感染者会出现急性、严重呼吸道疾病，伴有发热、咳嗽、气短及呼吸困难，严重的病例还会出现肾功能衰竭和死亡，当前并无有效的治疗药物。目前SARS-CoV-2感染肺炎的检测方法主要是实时逆转录酶聚合酶链检测方法（rRT-PCR）。首先，收集、加工样品和等待结果报告的时间相对较长。其次，RNA提取操作困难，需要昂贵的仪器、试剂和熟练的人员。再次，检测过程复杂，不能满足及时检测需求，且存在一定的漏检率。由于其成本高，发展中国家社会经济收入较低群体的个人无法负担，且SARS-CoV-2由于潜伏期具有传染性，为了排查很多无症状感染者，迫切需要发展现场、实时、便捷的家庭检测方法。
[0003]新型冠状病毒（SARS-CoV-2）包含 4 种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白（N蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和刺突蛋白（S蛋白）。参考其它冠状病毒，已知N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中含量非常丰富，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。因此，核衣壳蛋白是良好的诊断标志物。
[0004]聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关系统(Cas)被认为是转录调节和基因组编辑的一项革命性技术。CRISPR/Cas12a系统是其中一种高效的生物传感器开发工具，已经在核酸相关检测中表现出优异的性能，具有显著的灵敏度。适配体的引入可以解决CRISPR/Cas12a在非核酸目标物的检测应用范围。
[0005]核酸适配体（aptamer）是指通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析、环境监测、基础医学、新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。基于核酸适配体的性质，新型冠状病毒结构蛋白的核酸适配体具有结构相对稳定、简单、易于修饰以及短期内可以人工合成的优势。然而目前基于CRISPR/Cas12a系统和电化学生物传感器平台的组合鲜有报道。
发明内容
[0006]针对现有技术中检测新冠病毒感染耗时长、成本高、操作繁琐等问题，本发明提供针对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)进行检测的电化学传感器，检测速度快，检测限低，特异性高。
[0007]本发明另一目的在于提供上述核酸适配体传感器的制备方法。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0009]一种检测SARS-CoV-2的电化学适配体传感器，包括：
[0010]SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体（简称N48），激活剂链（Activator Strand，简称AS），CRISPR/Cas12a蛋白，crRNA，多聚腺苷酸-亚甲基蓝（简称PolyA-MB）和金电极；
[0011]所述SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0012]所述激活剂链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0013]所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0014]所述多聚腺苷酸-亚甲基蓝的结构为(A)nCCC-MB；其中，n表示A的数量，n=3-15，A表示腺苷酸，C表示胞苷酸，MB表示亚甲基蓝。优选地，所述n=5-10。
[0015]优选地，所述SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体和激活剂链杂交为拱形探针。可选地，杂交步骤为：95℃孵育5 min，缓慢冷却至室温。
[0016]优选地，所述多聚腺苷酸-亚甲基蓝修饰于金电极表面。可选地，修饰步骤为：将多聚腺苷酸-亚甲基蓝溶液滴加于金电极表面37℃孵育。
[0017]优选地，所述金电极经抛光处理。可选地，抛光处理步骤为：将金电极依次在0.3和0.05µm的氧化铝浆中抛光处理至呈镜面。
[0018]优选地，所述SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体和激活剂链的摩尔比为2:1-1:1。
[0019]优选地，所述CRISPR/Cas12a蛋白和crRNA的摩尔比为4:1-1:2；更优选为1:1。
[0020]优选地，所述激活剂链和crRNA的摩尔比为1:1。
[0021]优选地，所述电化学适配体传感器还包括缓冲液，所述缓冲液的pH为7.0-7.6。可选地，所述缓冲液选自NEBuffer缓冲液或PBS缓冲液。
[0022]优选地，所述电化学适配体传感器还包括参比电极和对电极。更为优选地，所述金电极，金电极和参比电极，金电极、参比电极和对电极可以分别以单电极、双电极或三电极型丝网印刷电极（Screen-Printed Electrodes，SPE）代替。
[0023]一种包含上述电化学适配体传感器的试剂盒。
[0024]优选地，所述试剂盒还包括重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白或重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的梯度溶液。
[0025]一种上述电化学适配体传感器或试剂盒在检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）中的应用。
[0026]上述电化学适配体传感器或试剂盒的应用，包括以下步骤：
[0027]（1）将多聚腺苷酸-亚甲基蓝溶液滴加于金电极表面孵育，获得修饰多聚腺苷酸-亚甲基蓝的金电极；
[0028]（2）将SARS-CoV-2核衣壳蛋白适配体和激活剂链在缓冲液中杂交，获得拱形探针溶液；
[0029]（3）将拱形探针溶液分别和重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的梯度溶液或待测样品混合后孵育；
[0030]（4）CRISPR/Cas12a蛋白溶液和crRNA溶液混合后孵育；
[0031]（5）将步骤（3）和（4）的产物混合后孵育；
[0032]（6）将步骤（5）的产物滴加到修饰多聚腺苷酸-亚甲基蓝的金电极上孵育，加入参比电极和对电极采用差分脉冲伏安法测量电流信号变化；
[0033]（7）根据重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的梯度溶液的电流信号变化作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测样品电流信号变化计算浓度。
[0034]优选地，步骤（3）中，孵育温度为25℃；步骤（4）、（5）和（6）中，孵育温度为37℃。
[0035]优选的，步骤（6）中孵育时间不小于20min。
[0036]优选地，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为Pt电极。
[0037]优选地，测量参数为：电位设置0~-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06s。
[0038]本发明的机理如下：
[0039]如图1所示，本发明的电化学传感器基于核酸适配体作为识别元件，CRISPR/Cas12a和PolyA-MB修饰的电极作为转换元件。
[0040]本发明中一共用到了4条寡核苷酸，其中，N48是N蛋白核酸适配体序列，5’端碱基和3’端碱基分别与Activator Strand（简称AS）两端互补，可形成拱形探针。PolyA-MB可以在金电极表面通过PolyA尾端类似Au-S键形式完成自组装。PolyA平铺于电极表面，可以使得MB靠近电极表面，进行高效的电子传递，产生强大的电信号。
[0041]当检测物存在时，N蛋白与N48的特异性识别，AS获得释放。AS能与准备好的CRISPR/Cas12a和crRNA形成的二元复合物紧密结合，形成Cas12a-crRNA-AS的三元复合物，从而激活Cas12a对单链DNA反式切割功能。借助反式切割功能引发了金电极表面PolyA-MB的切割，使得MB远离电极表面，从而监测到随着N蛋白浓度的增加电信号由强到弱。
[0042]本发明具有以下优点：
[0043]本发明利用了核酸适配体与AS结合形成拱形探针，在有无目标物存在情况下实现了对电信号“switch on”或者“switch off”的控制，进而实现对N蛋白的特异性检测；利用CRISPR/Cas12a的高效反式切割能力，放大了荧光信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物新冠病毒N蛋白的高灵敏性检测；该传感器的反应条件温和，反应速度快；针对新冠病毒的早期感染筛查，基于电化学法，本发明较之前的RT-PCR方法，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制备方法简单，性能稳定，电化学检测的重复性好，适用于新冠病毒感染早期的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，可以将金电极换成丝网印刷电极（SPE），适用于工业化生产，迎合产业化中价廉的要求。
附图说明
[0044]图1是本发明的原理图；
[0045]图2是不同PolyA-MB腺嘌呤长度的检测体系中电信号变化；
[0046]图3是不同PolyA-MB浓度的检测体系中电信号变化；
[0047]图4是不同CRISPR/Cas12a和crRNA浓度及比例的检测体系中电信号变化；
[0048]图5是不同CRISPR/Cas12a与PolyA-MB孵育时间的检测体系中电信号变化；
[0049]图6是N蛋白系列标准溶液浓度对ΔI的标准曲线。
具体实施方式
[0050]下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
[0051]实施例1 不同PolyA-MB腺嘌呤长度对检测核衣壳蛋白的影响
[0052]1. 按照以下配方或方法配置缓冲液或试剂：
[0053]1×PBS缓冲液：将商业购买的20×PBS (NaCl 136.89 mM；KCl 2.67 mM；Na2HPO48.1mM；KH2PO4 1.76mM pH7.4)由RNase-free水稀释20倍获得。
[0054]2. 按照下表合成序列或探针（相同下划线互补）：
[0055]。
[0056]3. 按照以下方法对金电极进行预处理：
[0057]将金电极依次在0.3和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理至呈镜面，然后分别用PBS和RNase-free水冲洗，备用。
[0058]4. 重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的制备：
[0059]根据NCBI登录号为YP_009724397.2的28274-29533位序列制备获得N蛋白重组质粒(NFPS-p10034 Pet28a-N)，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，进行诱导表达：在0.1 mM IPTG，16℃，中指数期过表达并诱导18个小时，离心收获细胞破碎裂解并获得上清液。然后采用Ni-NTA树脂(5mL，Cytiva)经AKTA蛋白纯化仪 (Cytiva，AKTA Pure)进行梯度洗脱(缓冲液A：50mM Tris-HCl pH7.5，300 mM NaCl，30mM咪唑；缓冲液B：50 mM Tris-HCl pH7.5，300 mMNaCl，500 mM咪唑)。通过S-200凝胶层析(Cytiva，SuperddexTM200 Increase 10/300GL)进一步纯化N蛋白。采用12% SDS-PAGE测定N蛋白的纯度，并使用Bradford Kit(SangonBiotech)检测蛋白质浓度，稀释至500ng/mL，4℃储存备用。
[0060]5. 按照以下方法筛选PolyA-MB的腺苷酸长度：
[0061]（1）将腺苷酸长度为3-15的PolyA-MB分别配制成1μM的溶液，取10μL滴加于直径2mm的金电极表面37℃下孵育4h，孵育结束后用RNase-free水冲洗，获得修饰PolyA3-15-MB的金电极，于4℃中储存备用；
[0062]（2）将6μL浓度为10μM的N48溶液和3μL浓度为10μM的AS溶液加入3μL的10×PBS缓冲液和18μL RNase-free水，震荡混合，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，得到杂交成拱形探针；
[0063]（3）将30μL拱形探针溶液和500ng/mL重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白溶液40μL混合后25℃孵育30 min；
[0064]（4）将200nM的CRISPR/Cas12a蛋白溶液和200nM的crRNA溶液等比例混合后37℃孵育40min，获得Cas12a-crRNA复合物的溶液共30μL；
[0065]（5）将步骤（3）和（4）的产物混合后37℃孵育40min，得到Cas12a-crRNA-AS三元复合物溶液100μL；
[0066]（6）7μL Cas12a-crRNA-AS三元复合物溶液滴加到修饰多聚腺苷酸-亚甲基蓝的金电极上37℃孵育20min，以RNase-free水漂洗3次，然后在1×PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极、以Pt为对电极采用差分脉冲伏安法测量ΔI，电位0~-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06s；
[0067]以PolyA-MB的腺苷酸的长度为横坐标，以ΔI和I为双纵坐标，作修饰不同腺苷酸长度的PolyA-MB金电极测定的电信号曲线图，如图2所示。由图3可知，检测到的ΔI和I均随着PolyA-MB中鸟嘌呤长度的浓度在3-7区间内增大而增大，当浓度超过7后，ΔI和I均下降；数量在5-10之前时，ΔI的变化率在60%以上。
[0068]实施例2 不同PolyA-MB浓度对检测核衣壳蛋白的影响
[0069]按照实施例1中的方法筛选PolyA-MB最佳浓度，不同在于：步骤（1）中，PolyA-MB中腺苷酸的长度为7，即PolyA7-MB，浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1μM，1.2μM，1.4μM。
[0070]以PolyA-MB浓度为横坐标，以ΔI为纵坐标，作修饰不同浓度PolyA-MB的金电极测定的电信号曲线图，如图3所示。由图3可知，检测到的ΔI随着PolyA-MB的浓度在0.4-1μM区间内增大而增大，当浓度超过1μM后，ΔI趋于稳定。
[0071]实施例3 不同Cas12a和crRNA浓度及其比例对检测的影响
[0072]按照实施例1中的方法筛选最佳Cas12a和crRNA浓度及其比例，不同在于：
[0073]步骤（1）中，PolyA-MB中腺苷酸的长度为7；
[0074]步骤（4）中，将100 nM CRISPR/Cas12a蛋白溶液和50nM crRNA溶液，200nMCRISPR/Cas12a蛋白溶液和50 nM crRNA溶液，100 nM CRISPR/Cas12a蛋白溶液和100 nMcrRNA溶液，200nM CRISPR/Cas12a蛋白溶液和100nM crRNA溶液，100nM CRISPR/Cas12a蛋白溶液和200nM crRNA溶液，200nM CRISPR/Cas12a蛋白溶液和200nM crRNA溶液等比例混合后孵育，获得Cas12a-crRNA复合物。
[0075]以CRISPR/Cas12a蛋白溶液和crRNA溶液浓度及其比例为横坐标，以ΔI纵坐标，作不同CRISPR/Cas12a蛋白溶液和crRNA溶液浓度及其比例测定的电信号曲线图，如图4所示。由图4可知，检测到的ΔI均在两者比例为1:1时高于其他比例，在两者浓度同为200 nM 时最大。
[0076]实施例4 Cas12a-crRNA-AS三元复合物与金电极的孵育时间对检测的影响
[0077]按照实施例1中的方法筛选最佳孵育时间，不同在于：步骤（1）中，PolyA-MB中腺苷酸的长度为7；
[0078]步骤（6）中，Cas12a-crRNA-AS三元复合物滴加到修饰多聚腺苷酸-亚甲基蓝的金电极上37℃孵育5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min。
[0079]以孵育时间为横坐标，以ΔI纵坐标，作不同孵育时间电信号曲线图，如图5所示。由图5可知，ΔI随着孵育时间在0-20 min区间内增大而增大，当孵育时间超过20 min后，ΔI趋于平缓。
[0080]实施例5 传感器对SARS-CoV-2的检测
[0081]（1）将PolyA7-MB配制成1μM的溶液，取10μL滴加于金电极表面37℃下孵育4h，孵育结束后用RNase-free水冲洗，获得修饰PolyA7-MB的金电极，于4℃中储存备用；
[0082]（2）将6μL浓度为10μM的N48溶液和3μL浓度为10μM的AS溶液加入3μL的10×PBS缓冲液和18μL RNase-free水，震荡混合，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，得到杂交成拱形探针；
[0083]（3）将30μL拱形探针溶液和40μL重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白溶液（0-100ng/mL）或待测溶液混合后25℃孵育30 min；
[0084]（4）将200nM的CRISPR/Cas12a蛋白溶液和200nM的crRNA溶液等比例混合后37℃孵育40min，获得Cas12a-crRNA复合物的溶液共30μL；
[0085]（5）将步骤（3）和（4）的产物混合后37℃孵育40min，得到Cas12a-crRNA-AS三元复合物的溶液100μL；
[0086]（6）7μL Cas12a-crRNA-AS三元复合物溶液滴加到修饰多聚腺苷酸-亚甲基蓝的金电极上37℃孵育20min，以RNase-free水漂洗3次，然后在1×PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极、以Pt为对电极采用差分脉冲伏安法测量ΔI%，电位0~-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率0.06s；
[0087]（7）根据重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白的梯度溶液的电流信号变化作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测样品电流信号变化计算浓度。
[0088]根据不同N蛋白标准溶液浓度的得到ΔI%作标准曲线，如图6所示，计算回归方程为ΔI% =29.3571+20.2035lgCN蛋白 (ng/mL)，相关系数为0.996；同时，我们在50 pg/mL的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于50 pg/mL时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为16.7pg/mL。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种基于CRISPR/Cas12a检测SARS-CoV-2的电化学适配体传感器
<130> 20211011
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N48
<400> 1
gtgttggctg gatgtcgctt acgacaatat tccttagggg caccgctaca ttgacacatc 60
cagccttctc 70
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AS
<400> 2
gagaaggctg gatgtcatcc agccaacac 29
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<211> 41
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crRNA
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uguguuggcu ggaugacauc c 41