1.多肽KWQRKSIRH，其结构式为：

2.多肽KWQRKSIRH的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将Fmoc-H(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
S2、用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，脱好后，再次用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-R(pbf)-OH，多肽缩合剂HBTU，HOBT，N-甲基吗啡啉，DMF继续固相合成反应；
S3、后采用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，脱好后，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-I-OH，Fmoc-S(tBu)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH，Fmoc-R(pbf)-OH，Fmoc-Q(Trt)-OH，Fmoc-W(Boc)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH进行固相缩合，直到与最后一个K反应结束，脱FMOC后，用95％的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到多肽KWQRKSIRH。
3.权利要求1所述的多肽KWQRKSIRH或权利要求2所述的制备方法制备的多肽KWQRKSIRH的如下应用：在制备DNA损伤增敏剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备肿瘤放化疗增敏药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌。
6.一种药物组合物，其特征在于：包括具有增敏肿瘤对放化疗诱导的DNA损伤敏感性作用的多肽KWQRKSIRH。
7.荧光探针FITC修饰的多肽KWQRKSIRH，其结构式为：

8.权利要求7所述的荧光探针FITC修饰的多肽KWQRKSIRH的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将Fmoc-H(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
S2、用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，脱好后，再次用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-R(pbf)-OH，多肽缩合剂HBTU，HOBT，N-甲基吗啡啉，DMF继续固相合成反应；
S3、后采用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，脱好后，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-I-OH，Fmoc-S(tBu)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH，Fmoc-R(pbf)-OH，Fmoc-Q(Trt)-OH，Fmoc-W(Boc)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH，Acp进行固相缩合，直到最后在避光条件下与FITC缩合结束，脱FMOC，用95％的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到荧光多肽FITC-KWQRKSIRH。
9.荧光探针FITC修饰的多肽KWQRKSIRH在制备肿瘤活细胞示踪剂中的应用。

技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种多肽KWQRKSIRH，制备方法及其在增敏致DNA损伤类肿瘤疗法中的应用。
背景技术
[0002]肿瘤是全世界面临的一个严重的重大公共卫生问题。放化疗是指化疗和放疗相结合的一种抗癌治疗方法，可以改善局部肿瘤控制和患者生存，同时不需要手术器官切除，目前已成为许多局部晚期实体肿瘤的标准治疗方法。虽然化疗初期有效，但往往伴随高频率的化疗耐药问题，导致肿瘤患者临床治疗的失败和预后不良现象的存在。放射治疗是人类癌症的主要治疗手段，主要机制是引起DNA损伤，但是放疗抗性也是众所周知的治疗难题之一。因此，寻找和研发能够提高肿瘤化放疗敏感性，降低肿瘤抗性的候选药物迫在眉睫。
[0003]近年来，来源于蛋白的多肽已经成为一种创新的方法来开发更有选择性的候选药物，因为这些多肽固有的构象刚性和灵活性适合结合蛋白-蛋白相互作用涉及的界面，使它们具有令人满意的亲和力和特异性，从而破坏或调节细胞内的蛋白与蛋白之间的相互作用，而不产生细胞毒性和副作用。来自蛋白的多肽药物通常以α-螺旋最为广泛。但是目前尚未报道水溶性好，生物相容性好，同时能够增敏肿瘤对放化疗诱导的DNA损伤敏感性的多肽类药物报道。
发明内容
[0004]有鉴于此，为解决上述问题，本发明提出了一种能够增敏肿瘤化放疗诱导的DNA损伤敏感性，提高肿瘤化放疗效果的多肽KWQRKSIRH，并提供了其制备方法，及其在增敏致DNA损伤类肿瘤疗法中的应用；所述多肽KWQRKSIRH水溶性好，容易进入细胞内部，不产生细胞毒性，能够抑制肿瘤细胞DNA损伤修复响应，增强和改善化放疗对肿瘤的治疗效果。
[0005]为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0006]本发明一方面提供了一种多肽KWQRKSIRH，其具有良好的水溶性，其结构式为：
[0007]
[0008]本发明再一方面提供了一种多肽KWQRKSIRH的制备方法，包括如下步骤：
[0009]S1、在固相合成器中将Fmoc-H(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
[0010]S2、用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-R(pbf)-OH、多肽缩合剂HBTU、HOBT、N-甲基吗啡啉、DMF于固相合成器中固相合成反应；
[0011]S3、后采用DMF洗涤多次，用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-I-OH，Fmoc-S(tBu)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH，Fmoc-R(pbf)-OH，Fmoc-Q(Trt)-OH，Fmoc-W(Boc)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH进行固相缩合，直到与最后一个K反应结束，脱FMOC后，用95％的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到多肽KWQRKSIRH。
[0012]本发明再一方面提供了所述的多肽KWQRKSIRH和所述的制备方法制备的多肽KWQRKSIR如下任一种应用：
[0013](a)在制备DNA损伤增敏剂中的应用；
[0014](b)在制备肿瘤放化疗增敏药物中的应用；
[0015](c)作为DNA损伤增敏剂在制备肿瘤放化疗药物中的应用。
[0016]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述的多肽KWQRKSIRH或所述的制备方法制备的多肽KWQRKSIR增敏紫外诱导的肿瘤细胞的DNA损伤，抑制体外肿瘤细胞生长。
[0017]在本发明的一些更优选的应用的实施方式中，多肽KWQRKSIRH在肿瘤细胞里的使用浓度为10～500nM。
[0018]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述的多肽KWQRKSIRH或所述的制备方法制备的多肽KWQRKSIR抑制Ku80依赖性的DNA损伤修复因子的响应。
[0019]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述的多肽KWQRKSIRH或所述的制备方法制备的多肽KWQRKSIR与阿霉素、电离辐射、曲妥珠单抗或他莫昔芬联用，增敏阿霉素、电离辐射、曲妥珠单抗或他莫昔芬对肿瘤的治疗效果，抑制肿瘤生长。
[0020]在本发明的一些更优选的应用的实施方式中，对乳腺癌小鼠，多肽KWQRKSIR的瘤旁有效给药浓度为10mg/kg，阿霉素腹腔有效给药浓度为3mg/kg，电离辐射有效剂量为5Gy，曲妥珠单抗腹腔有效给药浓度为4mg/kg，他莫昔芬腹腔有效给药浓度为25mg/kg。
[0021]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述的多肽KWQRKSIRH或所述的制备方法制备的多肽KWQRKSIR对来源于不同物种的RHBDF1蛋白具有高度特异性和专一性。
[0022]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述的多肽KWQRKSIRH或所述的制备方法制备的多肽KWQRKSIR具有PKC激酶的磷酸化底物识别位点。
[0023]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌。
[0024]在本发明的一些更优选的应用的实施方式中，多肽KWQRKSIRH能够抑制小鼠乳腺癌生长，多肽KWQRKSIR的瘤旁有效给药浓度为10mg/kg。
[0025]本发明再一方面提供了一种药物组合物，包括具有增敏肿瘤对放化疗诱导的DNA损伤敏感性作用的多肽KWQRKSIRH。
[0026]发明再一方面提供了荧光探针FITC修饰的多肽KWQRKSIRH，其具有良好的水溶性，1～6小时内能够进入肿瘤细胞内部，其结构式为：
[0027]
[0028]发明再一方面提供了荧光探针FITC修饰的多肽KWQRKSIRH的制备方法，包括如下步骤：
[0029]S1、在固相合成器中将Fmoc-H(Trt)-OH连接在2-氯三苯甲基氯树脂上，用二氯甲烷作为溶剂进行固相合成反应，后抽干二氯甲烷；
[0030]S2、用DMF洗涤多次，然后用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，用DMF洗涤多次，接着投放Fmoc-R(pbf)-OH，多肽缩合剂HBTU，HOBT，N-甲基吗啡啉，DMF于固相合成器中固相合成反应；
[0031]S3、后采用DMF洗涤多次，然后用20％哌啶脱Fmoc，颜色为蓝色则脱好，用DMF洗涤多次，后依次与Fmoc-I-OH，Fmoc-S(tBu)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH，Fmoc-R(pbf)-OH，Fmoc-Q(Trt)-OH，Fmoc-W(Boc)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH，Acp进行固相缩合，直到最后在避光条件下与FITC缩合结束，脱FMOC，用95％的三氟乙酸切割液把制备的多肽从树脂上分离切割2-3小时，并将所得粗品用高效液相色谱仪进行分离纯化，冻干即得到荧光多肽FITC-KWQRKSIRH。
[0032]发明再一方面提供了荧光探针FITC修饰的多肽KWQRKSIRH在肿瘤活细胞中示踪剂中的应用。
[0033]在本发明的一些优选的应用的实施方式中，所述荧光探针FITC修饰的多肽KWQRKSIRH在活细胞内的使用浓度为1～10nM。
[0034]需要说明的是，本发明用到的氨基酸均为L构型的天然氨基酸。
[0035]相对于现有技术，本发明所述的多肽KWQRKSIRH，制备方法及其在增敏致DNA损伤类肿瘤疗法中的应用具有以下优势：
[0036](1)本发明制备得到的多肽KWQRKSIRH和荧光多肽FITC-KWQRKSIRH具有良好的水溶性，模拟为α-螺旋结构，在加入肿瘤细胞后的1～6小时内就能够进入肿瘤细胞内部；不产生细胞毒性，对细胞生长没有明显的抑制；
[0037](2)本发明所述的多肽KWQRKSIRH能够增敏肿瘤化放疗诱导的DNA损伤敏感性，提高肿瘤化放疗效果；
[0038](3)本发明所述的多肽KWQRKSIRH能够体外抑制紫外刺激后的肿瘤细胞生长，增敏紫外对肿瘤细胞的DNA损伤，抑制Ku80依赖性的DNA损伤修复因子的响应；
[0039](4)本发明所述的多肽KWQRKSIRH能够抑制肿瘤的生长，能与阿霉素，电离辐射，曲妥珠单抗，他莫昔芬联合使用，增敏阿霉素，电离辐射，曲妥珠单抗，他莫昔芬对肿瘤的治疗效果。
附图说明
[0040]图1为多肽KWQRKSIRH、荧光多肽FITC-KWQRKSIRH的化学合成路线图；
[0041]图2为多肽KWQRKSIRH的质谱鉴定和纯度鉴定结果；
[0042]图3为荧光多肽FITC-KWQRKSIRH的质谱鉴定和纯度鉴定结果；
[0043]图4为多肽KWQRKSIRH序列比对的结果；
[0044]图5为多肽KWQRKSIRH的物理性状和模拟得到的α-螺旋结构；
[0045]图6为荧光多肽FITC-KWQRKSIRH的物理性状以及进入肿瘤细胞的荧光成像鉴定；
[0046]图7为多肽KWQRKSIRH抑制紫外刺激后的肿瘤细胞生长，以及半数抑制浓度；
[0047]图8为多肽KWQRKSIRH抑制紫外刺激后的肿瘤细胞DNA损伤修复蛋白因子；
[0048]图9为多肽KWQRKSIRH单独治疗小鼠肿瘤的给药方案，以及联合阿霉素、电离辐射、曲妥珠单抗、他莫昔芬治疗小鼠肿瘤的给药方案；其中，PBS代表PBS处理，KWQRKSIRH代表KWQRKSIRH给药，DOX代表阿霉素给药，IR代表电离辐射治疗，TRA代表曲妥珠单抗给药，TAM代表腹腔给药；
[0049]图10为多肽KWQRKSIRH单独治疗小鼠肿瘤的效果，以及联合阿霉素、电离辐射、曲妥珠单抗、他莫昔芬治疗小鼠肿瘤的效果。
具体实施方式
[0050]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0051]下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
[0052]实施例1多肽KWQRKSIRH的合成
[0053]采用固相合成法合成多肽KWQRKSIRH，合成路线如图1所示，合成步骤如下：
[0054](1)称量0.80mmol(746mg)二氯树脂，加入固相合成器中，加入20mL二氯甲烷(DCM)浸没树脂，溶胀树脂30分钟，抽干DCM溶剂，加入1mmol(837mg Fmoc-H(Trt)-OH的DCM溶液，加入800uL的N-甲基吗啡啉，固相合成反应2小时；之后用DCM洗6次，每次2分钟；用体积比DCM：甲醇：N-甲基吗啡啉＝17:2:1的封闭液，封闭30分钟；每次用DCM溶液20mL，洗涤6次，每次1分钟；每次用DMF溶液20mL，洗涤6次，每次2分钟；之后加入20mL 20％哌啶的DMF溶液，反应30分钟，脱去Fmoc保护基，颜色为蓝色则脱完，暴露出下一步反应的氨基。
[0055](2)加入1mmol Fmoc-R(pbf)-OH(648mg)，1ml的N-甲基吗啡啉，1mmol多肽缩合剂HBTU(380mg)，HOBT(135mg)，反应2小时，用20mL DMF溶液，洗涤6次，每次2分钟；加入20mL含20％哌啶的DMF溶液，反应30分钟，脱去Fmoc保护基，暴露出下一步反应的氨基。
[0056](3)重复(2)的实验步骤，只需要更换下次需要加入的Fmoc保护的氨基酸即可，依次加入的氨基酸顺序为：Fmoc-I-OH，Fmoc-S(tBu)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH，Fmoc-R(pbf)-OH，Fmoc-Q(Trt)-OH，Fmoc-W(Boc)-OH，Fmoc-K(Boc)-OH；将氨基酸依次链接在树脂上；最后一个加入的封端基团为：萘乙酸。
[0057](4)反应完毕之后，用20mL DMF溶液，洗涤6次，每次2分钟；每次用含20％哌啶的DMF溶液20mL，洗涤6次，每次1分钟；颜色为蓝色则脱完Fmoc，用95％的三氟乙酸TFA(TFA：H2O：TIS＝95％:2.5％:2.5％)切割2小时，用1％的TFA的二氯甲烷溶液20mL洗两遍，将收集到的总切割液蒸干即可得到粗品，粗品再用高效液相分离纯化，冻干即得到多肽KWQRKSIRH。
[0058]对合成的多肽KWQRKSIRH进行质谱鉴定和纯度鉴定，结果见图2。
[0059]实施例2荧光多肽FITC-KWQRKSIRH的合成
[0060]采用固相合成法合成荧光多肽FITC-KWQRKSIRH，合成路线如图1所示，合成步骤如下：
[0061](1)(2)(3)与实施例1的步骤(1)(2)(3)一致。
[0062](4)与Fmoc-K(Boc)-OH反应完毕后，在避光条件下与酰基载体蛋白Acp，FITC进行缩合；将氨基酸依次链接在树脂上；最后一个加入的封端基团为：萘乙酸。
[0063](5)与实施例1的步骤(4)类似，但是需要在避光条件下进行，最后冻干即得到荧光多肽FITC-KWQRKSIRH。
[0064]对合成的荧光多肽KWQRKSIRH进行质谱鉴定和纯度鉴定，结果见图3。
[0065]实施例3多肽KWQRKSIRH的序列比对及有无已知类似化合物的鉴定
[0066]使用NCBI数据库进行生物来源蛋白的KWQRKSIRH序列比对，使用SCIFinder检索类似KWQRKSIRH结构的化合物，具体步骤如下：
[0067](1)使用NCBI-BLAST的protein-proteinbalst功能模块，输入氨基酸序列KWQRKSIRH，进行检索即可得到来源于不同物种的含有KWQRKSIRH序列的蛋白，结果显示该多肽生物学来源只对RHBDF1蛋白具有唯一的特异性与专一性；
[0068](2)使用SCIFinder的检索数据库，输入多肽KWQRKSIRH的化学结构，进行检索即可得到类似该多肽结构的已知化合物或者多肽，结构显示该多肽无类似的已知化合物或多肽，该多肽具有化学结构上的新颖性，属于未知结构的新多肽化合物。
[0069]本实施例的鉴定结果可参考图4。
[0070]实施例4多肽KWQRKSIRH的二级结构模拟
[0071]使用GPS5.0，DistanceP-1.0数据库分析多肽KWQRKSIRH的三级结构类型，使用NetworKIN数据库分析KWQRKSIRH是否为功能蛋白序列，具体步骤如下：
[0072](1)多肽KWQRKSIRH物理性状为水溶性的白色粉末；
[0073](2)使用GPS5.0的secondary structure and surface accessibility功能模块，输入RHBDF1氨基酸序列，根据检索得到的分数可分析来源于RHBDF1的多肽KWQRKSIRH的氨基酸表面亲和性，氨基酸的暴露情况，显示该多肽二级结构为α-螺旋；
[0074](3)使用DistanceP-1.0数据库，输入多肽KWQRKSIRH序列，进行检索即可得到该多肽氨基酸之间的距离约束情况，进一步证明该多肽的二级结构属于α-螺旋；
[0075](4)使用NetworKIN数据库分析肽KWQRKSIRH序列，显示该多肽是具有PKC激酶底物识别序列的功能序列。
[0076]本实施例的鉴定结果可参考图5。
[0077]实施例5荧光多肽FITC-KWQRKSIRH在肿瘤活细胞的定位
[0078]使用荧光探针FITC标记多肽KWQRKSIRH，488nm激发光下观察绿色荧光，可确认多肽KWQRKSIRH在肿瘤细胞内的分布情况，具体步骤如下：
[0079](1)肿瘤细胞的准备：将肿瘤细胞从液氮里取出复苏后，用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞传代至35x10mm的共聚焦培养皿中，细胞密度在50～80％之间；
[0080](2)荧光多肽FITC-KWQRKSIRH物理性状为水溶性的橘黄色粉末；
[0081](3)待细胞生长6～12小时后，避光环境下用DEPC水溶解荧光多肽FITC-KWQRKSIRH，配置成1-10nM浓度加入到细胞中，轻轻混匀细胞培养基，37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中继续培养1-6小时；
[0082](4)将细胞培养基吸弃，用室温的PBS轻洗2-3次，加入2mL无血清的DMEM或RPMI1640培养基；
[0083](5)将含有肿瘤细胞的共聚焦培养皿置于TCS SP8 Leical莱卡激光共聚焦显微镜下，在488nm激发光下观察，拍摄；
[0084](6)FITC绿色荧光成像结果显示荧光多肽FITC-KWQRKSIRH在肿瘤细胞内部均有分布.
[0085]本实施例的鉴定结果可参考图6。
[0086]实施例6多肽KWQRKSIRH增敏紫外诱导的肿瘤细胞DNA损伤
[0087]使用不同浓度的多肽KWQRKSIRH培养肿瘤细胞，检测是否能够增敏紫外对肿瘤细胞的DNA损伤，具体步骤如下：
[0088](1)肿瘤细胞的准备：将不同类型的肿瘤细胞从液氮里取出复苏后，用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞铺匀至96孔板细胞培养皿中，细胞数量在3000～5000个/每孔；
[0089](2)配制不同浓度的多肽KWQRKSIRH：称取12.4mg的多肽KWQRKSIRH，溶解于1mL的DEPC水中，配制成的母液浓度为10uM。再将母液用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)分别稀释为：20nM，40nM，80nM，160nM，320nM的浓度；
[0090](3)96孔板肿瘤细胞在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)生长6～8小时，确认细胞均匀贴壁后，加入不同浓度的多肽KWQRKSIRH，继续培养24小时；
[0091](4)紫外365nm辐照：将96孔板从细胞培养箱中取出，置于UV(AnalytikJena CL-1000-365nm,UVP,USA)仪器中2000mJ/cm2辐照2-5分钟；96孔板辐照完放回37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中继续培养24小时；
[0092](5)MTT实验：避光条件下用DEPC水配制5mg/ml的MTT溶液，取20uL加入到96孔板中，轻轻混匀，放回37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)继续培养6小时；
[0093](6)倒弃96孔板里的培养基，加入75uL DMSO，置于缓慢的摇床上10分钟，立即在570nm下测量MTT值；
[0094](7)测量结果显示，多肽KWQRKSIRH显著增敏紫外诱导的肿瘤细胞DNA损伤，抑制肿瘤细胞的生长；
[0095]本实施例的鉴定结果可参考图7。
[0096]实施例7多肽KWQRKSIRH体外抑制紫外刺激的肿瘤细胞DNA损伤修复蛋白因子
[0097]将多肽KWQRKSIRH加入到肿瘤细胞里，紫外刺激细胞后，提取细胞总蛋白，用western blot检测DNA损伤修复蛋白因子的蛋白水平，具体步骤如下：
[0098](1)肿瘤细胞准备：将肿瘤MCF-7，4T1，MDA-MB-231细胞从液氮里取出复苏后，用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞铺匀至6孔板的细胞培养皿中，细胞数量为每孔3×105/每孔；
[0099](2)配制不同浓度的多肽KWQRKSIRH：称取12.4mg的多肽KWQRKSIRH，溶解于1mL的DEPC水中，配制成的母液浓度为10μM。再将母液用DMEM(含10％FBS)或RPMI1640(含10％FBS)分别稀释为：40nM，80nM的浓度；
[0100](3)紫外365nm辐照：将细胞培养箱中取出，置于UV(AnalytikJena CL-1000-365nm,UVP,USA)仪器中1000mJ/cm2辐照10分钟；
[0101](4)辐照完的细胞，加入不同浓度的多肽KWQRKSIRH，继续培养1小时；
[0102](5)细胞总蛋白提取：吸去培养基，每孔用250μL含有蛋白酶抑制剂的非变性裂解液在冰上裂解细胞，裂解12分钟；
[0103](6)裂解液中加入75μL 4×蛋白上游缓冲液混匀，100℃煮样15分钟；
[0104](7)westernblot分析：各取样品20uL，上样于10％或12％SDS-PAGE电泳，rH2AX抗体(1:1000)，P53抗体(1:1000)，鼠源二抗和兔源二抗(1:4000)，凝胶成像仪曝光成像；
[0105](8)结果分析：多肽KWQRKSIRH能够抑制紫外刺激的肿瘤细胞DNA损伤修复蛋白因子rH2AX和P53的蛋白水平。
[0106]本实施例的鉴定结果可参考图8
[0107]实施例8多肽KWQRKSIRH抑制乳腺癌4T1 BALB/c雌鼠的肿瘤生长
[0108]将多肽KWQRKSIRH瘤旁皮下注射于乳腺癌4T1 BALB/c雌鼠，检测能否抑制肿瘤生长，具体步骤如下：
[0109](1)4T1 BALB/c雌鼠准备：PBS组和多肽KWQRKSIRH组各5只，周龄6-8周，饲养一个星期后备用；
[0110](2)肿瘤细胞准备：将肿瘤4T1细胞从液氮里取出复苏后，用RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞传至20cm细胞培养皿中。胰酶消化后用PBS稀释成1×106/0.1mL；
[0111](3)多肽KWQRKSIRH准备：称取多肽2mg溶于1mL PBS中，避光保存于-20℃；
[0112](4)4T1细胞注射：将4T1细胞1×106/100μL皮下注射于小鼠右腹部位，此后每隔一天观察肿瘤生长情况，在第10天长出瘤结，记录小鼠肿瘤大小，体重；
[0113](5)小鼠给药：第10天分别瘤旁皮下注射PBS和多肽KWQRKSIRH(10mg/kg)各100μL，此后每隔一天给药一次，同时记录肿瘤大小，肿瘤体积(mm3)＝长x宽2/2)；
[0114](6)第26天处死小鼠并解剖取出肿瘤，记录肿瘤大小，小鼠体重，肿瘤重量；
[0115](7)结果分析：多肽KWQRKSIRH组小鼠肿瘤明显小于PBS对照组肿瘤，说明多肽KWQRKSIRH能够抑制小鼠肿瘤生长。
[0116]本实施例的鉴定结果可参考图9，图10。
[0117]实施例9多肽KWQRKSIRH增敏阿霉素，电离辐射，曲妥珠单抗，他莫昔芬对乳腺癌4T1 BALB/c雌鼠的治疗效果
[0118]将多肽KWQRKSIRH与阿霉素，电离辐射，曲妥珠单抗，他莫昔芬联合给药，检测多肽能否增强阿霉素，电离辐射，曲妥珠单抗，他莫昔芬对乳腺癌4T1 BALB/c雌鼠的治疗效果，具体步骤如下：
[0119](1)4T1 BALB/c雌鼠准备：小鼠周龄6-8周，阿霉素(DOX)+PBS组和阿霉素(DOX)+多肽KWQRKSIRH组各5只；电离辐射(IR)+PBS组和电离辐射(IR)+多肽KWQRKSIRH组各6只；曲妥珠单抗(TRA)+PBS组和曲妥珠单抗(TRA)+多肽KWQRKSIRH组各5只；他莫昔芬(TAM)+PBS组和他莫昔芬(TAM)+多肽KWQRKSIRH组各6只；饲养一个星期后备用；
[0120](2)肿瘤细胞准备：将肿瘤4T1细胞从液氮里取出复苏后，用RPMI1640(含10％FBS)培养基在37℃细胞培养箱(含5％二氧化碳)中进行培养并传代2-3次，待细胞生长状态正常后，将细胞传至20cm细胞培养皿中，胰酶消化后用PBS稀释成1×106/0.1mL；
[0121](3)多肽KWQRKSIRH，阿霉素，电离辐射，曲妥珠单抗，他莫昔芬准备：称取多肽2mg溶于1mL PBS中；称取阿霉素0.6mg溶于1mL DEPC水中；称取曲妥珠单抗0.8mg溶于1mL DEPC水中；称取他莫昔芬5mg溶于1mL甲醇中；避光保存于-20℃；
[0122](4)4T1细胞注射：将4T1细胞1×106/100μL皮下注射在小鼠右腹部位，此后每隔一天观察肿瘤生长情况，在第10天长出瘤结，记录小鼠肿瘤大小，体重；
[0123](5)小鼠给药：所有小鼠在第10天分别瘤旁皮下注射PBS和多肽KWQRKSIRH(10mg/kg)各100uL，第二天腹腔注射阿霉素(3mg/kg)，曲妥珠单抗(4mg/kg)，他莫昔芬(25mg/kg)此后每隔一天给药一次，同时记录肿瘤大小，肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2)；
[0124](6)小鼠电离辐射：第10天给予小鼠肿瘤局部电离辐射5Gy，此后每隔一天记录小鼠肿瘤大小，小鼠体重，一周后再给予第二次电离辐射5Gy；
[0125](7)第26天处死小鼠并解剖取出肿瘤，记录肿瘤大小，小鼠体重，肿瘤重量；
[0126](8)结果分析：联合多肽KWQRKSIRH给药组小鼠肿瘤明显小于单独治疗组肿瘤，多肽KWQRKSIRH能够增敏阿霉素，电离辐射，曲妥珠单抗，他莫昔芬对小鼠肿瘤的治疗作用。
[0127]本实施例的鉴定结果可参考图9，图10。
[0128]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。