1.TNFSF15蛋白在制备用于在体外促进髓系细胞分化为周细胞的药物中的用途，所述髓系细胞为髓系CD11b+细胞。
2.一种应用TNFSF15蛋白促进体外培养的髓系细胞向周细胞分化的方法，其特征在于：所述方法中，髓系CD11b+细胞在包含TNFSF15蛋白的条件培养基中进行培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述TNFSF15蛋白在条件培养基中的浓度为3μg /mL。
4.根据权利按要求2所述的方法，其特征在于：所述方法具体为：1）磁珠分选髓系CD11b+细胞；2）检测髓系CD11b+细胞的分选效率与分选纯度；3）髓系CD11b+细胞在包含TNFSF15蛋白的条件培养基中培养，髓系CD11b+细胞向周细胞分化。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：取磁珠分选后的髓系CD11b+细胞于含有EGM2、10%FBS、3μg/mLTNFSF15的培养基中重悬，调整细胞浓度，加入细胞培养板中，于细胞培养箱中培养，培养条件为37℃，5%CO2，在培养的1、3、5、7天时，检测周细胞标志物的表达变化，隔天换液，加入新鲜含有TNFSF15的条件培养基，髓系细胞向周细胞分化。
6.TNFSF15蛋白在制备用于在体外保护髓系细胞和促进髓系细胞扩增和分化的药物中的用途，所述髓系细胞为髓系CD11b+细胞。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：TNFSF15蛋白促进髓系CD11b+细胞比例和数量的增多。

技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种TNFSF15蛋白促进髓系细胞分化为周细胞的方法及其用途。
背景技术
[0002]周细胞又称Rouget细胞，广泛分布于全身的毛细血管和微血管的管壁，紧贴于微血管内皮细胞外而被基底膜包被；血管周细胞与动、静脉的血管平滑肌细胞相连接，和内皮细胞一起构成了微血管和组织间隙的屏障，是维持内环境稳定的重要因素。同时，血管周细胞是一种多能干细胞，能够起到维持集体稳定、修复生理功能及再生器官的作用，再不同的条件下，血管周细胞可分化为成骨细胞系、软骨细胞系、脂肪细胞系、成纤维细胞系、成牙质细胞系、平滑肌细胞系、神经细胞系等细胞。周细胞的胚胎起源是异质的。中枢神经系统、胸腺、肺、心脏、肝脏和肠中的周细胞来源于外胚层，而大多数其他器官中的周细胞来源于中胚层。成人人体组织中，周细胞或来源于血循环中的单核细胞而骨髓来源的多能干细胞也能分化发育成周细胞。
[0003]周细胞缺失与心脑血管病、糖尿病性视网膜病变、原发性神经退行性疾病、癌症等多种疾病相关；研究发现，向tMCAO裸鼠缺血侧基底节注射PDGFR-β(+)早期周细胞能够减小梗死区域并促进神经功能恢复(7天)，同时又有研究人员发现，体外培养的人多能干细胞来源的周细胞移植可有效治疗缺血性脑卒中，周细胞疗法应用于脑部疾病治疗具有较大潜力，利用其干细胞特性来促进再生和修复；还有研究人员将间充质干细胞(MSC)移植到两名帕金森病患者的面部组织中，帮助两位帕金森患者缓解了病情，而研究表明组织内部分间充质干细胞来源于血管周细胞，血管周细胞是一类具有良好前景的MSC前体源；此外，周细胞有助于骨骼肌的形成，将周细胞移植到宿主肌肉中使其于成肌细胞融合形成肌管，有助于在损伤或者坏死的情况下再生肌肉，体外培养的周细胞可以用来治疗肌肉营养不良。综上研究结果足以表明，周细胞疗法的有效性，可以为再生医学提供广阔的应用前景，所以，周细胞的分化与分离、培养和测试功能的过程对于其作为细胞疗法的成功至关重要，而目前对周细胞体外分化与培养方面的研究还很少。
[0004]肿瘤坏死因子超家族成员15(tumor necrosis factor superfamily,TNFSF15),可以有效的抑制血管新生和抑制肿瘤生长，也具有活化T细胞、促进炎症因子分泌等生理活性，在免疫调节及炎症性疾病中发挥重要作用；越来越多的研究结果显示，TNFSF15在维持血管通透性功能性中发挥着重要的作用，周细胞的招募是血管成熟稳定的重要一步，周细胞与内皮细胞之间的连接交流对维持血管稳定和血管通透性至关重要，目前，尚未有TNFSF15对周细胞的影响的研究。
发明内容
[0005]有鉴于此，针对上述现有技术的不足，本发明提出了一种TNFSF15蛋白促进髓系细胞分化为周细胞的方法及其用途，所述TNFSF15蛋白能保护髓系细胞，促进髓系细胞的增多，并促进髓系细胞在体外培养条件下向周细胞的分化，为外源给药的周细胞疗法医治血管疾病提供理论基础和治疗方案。
[0006]为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0007]本发明的第一方面提供了TNFSF15蛋白在制备用于促进髓系细胞分化为周细胞的药物中的用途。
[0008]优选地，所述髓系细胞为髓系CD11b+细胞。
[0009]本发明的第二方面提供了一种应用TNFSF15蛋白促进体外培养的髓系细胞向周细胞分化的方法，所述方法中，髓系CD11b+细胞在包含TNFSF15蛋白的条件培养基中进行培养。
[0010]优选地，所述TNFSF15蛋白在条件培养基中的浓度为3μg/mL。
[0011]优选地，所述方法具体为：1)磁珠分选髓系CD11b+细胞；2)检测髓系CD11b+细胞的分选效率与分选纯度；3)髓系CD11b+细胞在包含TNFSF15蛋白的条件培养基中培养，髓系CD11b+细胞向周细胞分化。
[0012]优选地，取磁珠分选后的髓系CD11b+细胞于含有EGM2、10％FBS、3μg/mLTNFSF15的培养基中重悬，调整细胞浓度，加入细胞培养板中，于细胞培养箱中培养，培养条件为37℃，5％CO2，在培养的1、3、5、7天时，检测周细胞标志物的表达变化，隔天换液，加入新鲜含有TNFSF15的条件培养基，髓系细胞向周细胞分化。
[0013]优选地，所述步骤3)中还包括预先的处理阶段，在细胞培养皿中铺设整联蛋白FN，4℃过夜处理，再将其至于37℃细胞培养箱中孵育后，弃去FN上清液，再加入培养基和髓系CD11b+细胞。
[0014]优选地，铺设的整联蛋白FN的浓度为10μg/mL。
[0015]本发明的第三方面提供了一种周细胞作为活性成分在制备治疗血管疾病、原发性神经退行性疾病或癌症的药物中的用途，所述周细胞是通过TNFSF15蛋白促进髓系细胞分化而来的。
[0016]优选地，所述血管疾病为心脑血管病、糖尿病性视网膜病变；所述原发性神经退行性疾病为阿尔兹海默症。
[0017]本发明的第四方面提供了TNFSF15蛋白在制备用于保护髓系细胞和促进髓系细胞扩增和分化的药物中的用途。
[0018]优选地，所述髓系细胞为髓系CD11b+细胞。
[0019]优选地，TNFSF15蛋白促进髓系CD11b+细胞比例和数量的增多。
[0020]本发明的第五方面提供了TNFSF15蛋白在制备髓源性抑制细胞介导的免疫抑制疾病的药物中的用途。
[0021]优选地，所述髓源性抑制细胞介导的免疫抑制疾病为肿瘤、炎症、白血病。
[0022]本发明的第六方面提供了一种应用TNFSF15蛋白促进小鼠髓系细胞增殖与分化的方法，采用TNFSF15蛋白进行腹腔注射处理。
[0023]优选地，注射的所述TNFSF15蛋白的浓度为5mg/kg。
[0024]本发明的第期方面提供了一种用于体外培养周细胞的条件培养基，所述条件培养基中含有TNFSF15蛋白。
[0025]优选地，所述条件培养基中TNFSF15蛋白的浓度为3μg/mL。
[0026]优选地，所述条件培养基的组成为：EGM2+10％FBS+3μg/mLTNFSF15蛋白。
[0027]相对于现有技术，本发明所述的TNFSF15蛋白促进髓系细胞分化为周细胞的方法及其用途具有以下优势：
[0028](1)TNFSF15蛋白可以促进体外培养的髓系CD11b+细胞向周细胞分化，实现体外获取周细胞，为外源给药的周细胞疗法医治血管疾病提供了更多可能，实现应用于外源性周细胞移植疗法治疗血管疾病、原发性神经退行性疾病、癌症等疾病的目的；
[0029](2)TNFSF15蛋白能保护髓系细胞，并促进小鼠骨髓中CD11b+细胞比例和数量的增多，可应用于髓源性抑制细胞介导的免疫抑制疾病。
附图说明
[0030]图1为TNFSF15蛋白腹腔注射处理小鼠后，骨髓中CD11b+细胞的比例和数量变化情况。
[0031]图2为与Littermate组相比，TNFSF15高表达转基因小鼠骨髓中CD11b+细胞的比例和数量情况。
[0032]图3为不同TNFSF15蛋白浓度的处理对体外培养的髓系CD11b+细胞的凋亡情况的影响。
[0033]图4为TNFSF15蛋白处理对体外培养的髓系CD11b+细胞的凋亡情况的影响。
[0034]图5为TNFSF15处理体外培养的髓系CD11b+细胞后，周细胞分子表型蛋白的表达变化，其中，A为流式细胞术的方法检测周细胞分子表型蛋白的表达变化，B为免疫荧光的方法检测周细胞分子表型蛋白的表达变化。
[0035]图6为TNFSF15处理体外培养的髓系CD11b+细胞后，细胞呈周细胞样细胞形态的变化，其中，A为普通显微镜下，细胞形态的变化，B为微分干涉(DIC)显微镜下，细胞形态的变化。
具体实施方式
[0036]除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0037]下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
[0038]实施例1TNFSF15蛋白对小鼠骨髓中CD11b+细胞的影响。
[0039]1.人重组蛋白TNFSF15处理野生型C57小鼠
[0040](1)分组:将10只6周龄健康且生长状态无差别的C57BL/6J小鼠随机分成两组，每组各5只小鼠。
[0041](2)给药：给一组小鼠腹腔注射5mg/kg的人重组蛋白TNFSF15，另一组小鼠腹腔注射相应体积的Vehicle，做好组别标记；隔天给药处理，共给三次人重组蛋白TNFSF15处理；最后一次给药处理后，隔天取小鼠骨髓细胞进行流式检测。
[0042]2.转基因SPC-TNFSF15小鼠鉴定
[0043](1)小鼠组织基因组DNA样品获取：用医用剪刀剪取待检测转基因小鼠的脚趾组织，做好标记，将组织放入1.5mL离心管中，轻甩将组织样品甩入管底。
[0044](2)向离心管中加入100μL 25mM NaOH(含0.2mM EDTA)pH12溶液，95℃金属浴煮20min。
[0045](3)样品煮后经短暂离心后，加入100μL 40mM Tris-HclpH5溶液，涡旋混匀后，12000r/min，6min。
[0046](4)样品离心后，吸取上清至一新的1.5mL离心管儿，做好标记，即为对应样品的基因组DNA,多功能微孔板检测仪检测DNA浓度，负二十度冰箱保存。
[0047](5)样品组织PCR扩增：配置20μL PCR扩增体系，在相应扩增程序中进行扩增。
[0048](6)1％核酸胶配置：用ddH2O将50×TAE稀释至1×，称取1g琼脂糖核酸胶加入到稀释好的100mL 1×TAE溶液中，混匀后，放入微波炉里加热2min，煮沸后，摇晃混匀，再次放入微波炉中加热30s后取出，直至溶液透明清亮，稍微冷却后加入10μLGelRed混匀，倒入水平凝胶电泳槽中，注意避免产生气泡，插入梳子室温冷却凝固。
[0049](7)DNA样品核酸电泳：将DNA样品中加入6×DNA loading Buffer至终浓度为1×；琼脂糖核酸凝胶冷凝后，拔出梳子，向电泳槽中加入适量1×TAE电泳液；取20μL DNA样品加入样品孔中，100v电压电泳40min后，取出电泳完的核酸凝胶，于凝胶成像系统中观察电泳条带及拍照。
[0050]3.小鼠骨髓细胞提取
[0051](1)准备：实验前将镊子等手术器械与裁剪好为六层的白纱布与200目尼龙筛网等材料121℃高温灭菌20min后，烘干备用。
[0052](2)4％水合氯醛100μL腹腔注射麻醉小鼠后，颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠完全淹没浸入75％酒精中浸泡5min，全身初步灭菌。
[0053](3)取出在75％酒精浸泡过的小鼠，移至超净工作台中，在铺好方巾纸的干净无菌的手术板上，用针头固定好小鼠四肢，用镊子捏起腹部皮肤，剪刀将腹部剪开直至后腿指尖处，取出小鼠后腿的股骨和胫骨，置于在冰上放好备用的六厘米细胞培养皿中，全程注意无菌操作。
[0054](4)在超净工作台中，用六层无菌的白纱布小心捻弃骨头上的肌肉，将肌肉从骨头上剥离干净，将骨头置于冰上预冷的PBS中(2％FBS+1％PS),用吸满了预冷的PBS的1mL注射器的针头插入骨头的关节处，将骨髓吹冲如15mL离心管中，全部骨髓吹冲完全后，小心反复吹吸冲出来的骨髓，使其完全分散成单细胞悬液，将15mL离心管中的骨髓细胞单细胞悬液用200目尼龙筛网过滤至另一新的15mL离心管中，400×g，5min离心。
[0055](5)离心完成后，弃去上清，加入1mLEasysep buffer(PBS+2％FBS+0.1mM pH7.4的EDTA或不含Ca2+、Mg2+离子的PBS+2％ FBS)，重悬细胞后进行细胞计数，将细胞制成1×108个骨髓细胞/mL的细胞悬液。
[0056]4.小鼠骨髓细胞中CD11b+细胞的检测
[0057](1)一抗染色：取两个1.5mL离心管儿依次排放好，每管各加入1×106个全骨髓细胞，400×g，5min离心；弃上清，加入500μLPBS清洗细胞一次，400×g，5min离心；弃上清，加入100μL PBS重悬细胞；向两管儿细胞中依次加入0.25μg/0.5μL CD11b抗体与相应的同型对照(Isotype)抗体，轻轻吹匀后置于冰上染色30min，期间每隔10min轻轻吹匀细胞，避免细胞沉降以染色均匀。
[0058](2)二抗染色：一抗染色完成后，每个离心管儿中加入500μLPBS，400×g，5min离心；弃上清，加入500μL PBS清洗细胞两次，400×g，5min离心，弃上清，加入100μL PBS重悬细胞，此后步骤注意关灯遮盖锡箔纸避光操作，每管中加入5μL APC结合的荧光二抗，轻轻吹匀后置于冰上染色25min，期间每隔10min轻轻吹匀细胞，避免细胞降沉以染色均匀。
[0059](3)分析型流式细胞仪检测骨髓中CD11b+细胞的比例：二抗染色完成后，每个离心管加入500μLPBS，400×g，5min离心，弃上清，加入500μL PBS清洗细胞两次，400×g，5min离心，弃上清，加入100μL PBS和100μL细胞固定液(IC Fixation Buffer)，轻轻吹匀后，用300目黄纱布过滤细胞，将h
[0060]5.结果分析：
[0061]由图1可知，TNFSF15蛋白促进了野生型C57BL/6J小鼠骨髓中CD11b+细胞的比例和数量的增多；由图2可知，TNFSF15高表达C57BL/6J转基因小鼠骨髓中CD11b+细胞的比例和数量比Littermate组的多。综上可知，TNFSF15可以促进小鼠骨髓中CD11b+细胞的比例和数量的增多。
[0062]实施例2TNFSF15蛋白对体外培养的髓系CD11b+细胞的影响
[0063]1.小鼠骨髓中CD11b+细胞的磁珠分选
[0064](1)取出小鼠骨髓细胞后，用1mL Easysep buffer(PBS+2％FBS+0.1mM pH7.4的EDTA)，将细胞制成1×108个骨髓细胞/mL的细胞悬液。
[0065](2)按照EasysepTM Mouse CD11b Positive Selection Kit II试剂盒说明书操作规范完成，向每1×108个骨髓细胞/mL的细胞悬液中加入50μL Rat Serum，轻轻吹匀后室温静置5min。
[0066](3)预制备Selection Cocktail，每毫升细胞悬液需要50μL cocktail，取一个干净的1.5mL EP管儿，将25μL Component A与25μL Component B混入EP管儿中吹打均匀，室温静置5min后备用(混合好的Selection Cocktail可于4℃冰箱中存放一周，最好现用现混)。
[0067](4)将50μL混好的Selection Cocktail加入含有Rat serum的1×108个骨髓细胞/mL的细胞悬液中，轻轻吹匀后，室温静置5min。
[0068](5)从四度冰箱中取出RapidSpheresTM，置于超净工作台里的冰盒上，用枪轻柔吹匀磁珠，注意一定要将磁珠吹散均匀无肉眼可见大颗粒。
[0069](6)取80μL RapidSpheresTM加入到上述含Rat serum和Selection Cocktail的1×108个骨髓细胞/mL的细胞悬液中，轻轻吹打均匀后室温静置5min。
[0070](7)将1.5mLEP管儿中的细胞悬液取出置于5mL流式管儿中，并补充Easysepbuffer至3.5mL，轻轻吹打均匀，将流式管儿置于EasySep磁极中，静置3min。
[0071](8)将EasySep磁极中流式管儿内的液体小心倒出后，取出流式管儿，可看到管壁上初步分选的带有棕色磁珠的CD11b+细胞，向流式管儿中补充3.5mL Easysep buffer，轻轻吹下吹匀管壁上的细胞后，再次将流式管儿置于EasySep磁极中，静置3min。
[0072](9)重复三次步骤8.
[0073](10)向流式管儿中先加入2mL EGM2培养基，重悬分选的CD11b+细胞。
[0074]2.流式细胞仪检测CD11b+细胞的分选效率与分选纯度
[0075](1)一抗染色：取三个1.5mL离心管儿依次排放好，每管依次加入1×106的全骨髓细胞(BM)、分选后的CD11b+细胞和BM细胞与CD11b+细胞混合细胞(每种细胞5×105个)，400×g，5min离心，弃上清，加入500μL PBS清洗细胞一次，400×g，5min离心，弃上清，加入100μL PBS重悬细胞，按照最初三个离心管儿的排放顺序，依次加入0.25μg/0.5μL CD11b抗体、0.25μg/0.5μL CD11b抗体和同型对照抗体，轻轻吹匀后置于冰上染色30min，期间每隔10min轻轻吹匀细胞，避免细胞沉降以染色均匀。
[0076](2)二抗染色：一抗染色完成后，每个离心管加入400μL PBS，400×g，5min离心，弃上清，加入500μL PBS清洗细胞两次，400×g，5min离心，弃上清，加入100μL PBS重悬细胞，此后步骤注意关灯遮盖锡箔纸避光操作，每管中加入5μL APC结合的荧光二抗,轻轻吹匀后置于冰上染色25min,期间每隔10min轻轻吹匀细胞，避免细胞沉降以染色均匀。
[0077](3)分析型流式细胞仪检测分选效率与纯度：二抗染色完成后，每个离心管加入400μL PBS，400×g，5min离心，弃上清，加入500μL PBS清洗细胞两次，400×g，5min离心，弃上清，加入100μL PBS和100μL IC Fixation Buffer，轻轻吹匀后，用300目黄纱布过滤细胞，将细胞移至5mL流式管儿中，样品可在一周内上机检测，注意全程避光。检测完成后，Flowjo-V10软件分析处理检测结果。
[0078]3.髓系CD11b+细胞的体外培养
[0079](1)整联蛋白(FN)铺设：提前一天将细胞培养六孔板中铺设10μg/mL的FN(PBS稀释)，每孔1mL，置于4℃冰箱中封口膜封口无菌放置一夜。
[0080](2)髓系CD11b+细胞的培养：将含FN的六孔板从4℃冰箱中取出，置于37℃细胞培养箱中孵育半小时后，弃去FN上清液，加入1×107个CD11b+细胞/Ml EGM2培养基，将细胞分为两组即TNFSF15(0.5μg/mL)刺激组与相应体积的Vehicle组，每组三个重复孔，置于37℃CO2细胞培养箱中培养。
[0081](3)培养的髓系CD11b+细胞换液：髓系CD11b+细胞培养至第2天的时候进行细胞换液；收集各孔悬浮细胞，400×g，5min，弃上清后用新的EGM2培养基重悬，重新加入原来的孔，各孔按照组别重新使用人重组蛋白TNFSF15(0.5μg/0.5mL)和相应体积的Vehicle组处理，继续置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养；细胞培养至第4天时，重复第二天的操作换液；第6天时，弃上清悬浮细胞，因为第5天开始，细胞培养液中已经没有存活的悬浮细胞存在，直接给贴壁分化细胞换液，直至细胞培养至第7天。
[0082]4.髓系CD11b+细胞凋亡检测
[0083](1)培养的髓系CD11b+细胞收集：吸取培养第三天的悬浮CD11b+细胞，置于2mL离心管中，各孔做好标记，400×g，5min离心；用PBS轻轻均匀冲洗贴壁的CD11b+细胞，各孔加入500μL胰酶进行消化处理，37℃消化1min后加入新的EGM2中和终止胰酶的消化，各孔做好标记，400×g，5min离心；用PBS重悬各孔的悬浮与贴壁细胞，重新合并到一个2mL离心管中，即为培养第三天的CD11b+细胞总细胞。
[0084](2)PBS重悬培养第3天的CD11b+细胞总细胞两次，以去除细胞中残留的胰酶成分，胰酶会影响后续的凋亡染色。
[0085](3)PBS重悬的细胞，400×g，5min后，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，全程注意避光处理，吹匀动作要轻柔，避免后续人为因素造成的细胞的物理死亡而影响检测结果。
[0086](4)加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，用锡箔纸包裹避光，室温孵育10min。
[0087](5)染色完成后，400×g，5min离心，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
[0088](6)向细胞重悬液中加入10μL碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，冰上避光孵育10min。
[0089](7)染色完成后，随即进行流式细胞仪检测，若不能马上检测，可将细胞用4％PFA固定，三天内检测；Annexin V-FITC被FITC通道激发发出绿色荧光，PI被PE通道激发出红色荧光。
[0090]5.结果分析：
[0091]由图3可知，TNFSF15蛋白促进了培养分化中的CD11b+细胞的存活；由图4可知，TNFSF15蛋白抑制了培养分化中的CD11b+细胞的凋亡。综上可知，TNFSF15蛋白对体外培养分化的CD11b+细胞由保护的作用。
[0092]实施例3TNFSF15蛋白处理体外培养的髓系CD11b+细胞后，周细胞分子表型蛋白的表达变化。
[0093]1.流式细胞术检测培养分化的髓系CD11b+细胞的分子表型蛋白表达变化。
[0094](1)一抗染色：将培养的细胞收集，按照相应的抗体说明书进行一抗(PDGFR-β、α-SMA、Desmin)与其对应的同型对照(Isotype)抗体进行染色，其中，PDGFR-β与α-SMA的一抗染色需要先用破膜剂破膜细胞十分钟后进行染色。
[0095](2)二抗染色：一抗染色完成后，PBS重悬细胞，400×g，5min离心，两次，以清洗细胞避免非特异性抗体结合；后按相应抗体属性进行二抗染色，二抗为带荧光标签的抗体，全程需要避光。
[0096](3)流式检测：二抗染色完成后，用PBS重悬清洗细胞，400×g，5min离心，两次，后用4％PFA重悬，将染色完成的细胞用300目黄纱布过滤后进行流式检测。
[0097]2.细胞免疫荧光检测培养分化的髓系CD11b+细胞的分子表型蛋白表达变化。
[0098](1)将共聚焦小皿中培养好的细胞，用PBS轻柔均匀清洗三次，每次5min。
[0099](2)将清洗好的细胞中加入预冷的4％PFA(多聚甲醛)，4℃冰箱固定15min。
[0100](3)固定完成后吸弃4％PFA，用PBS轻柔均匀清洗细胞三次，每次5min。
[0101](4)0.5％ Triton-100(PBS配制)室温通透20min。
[0102](5)用PBS轻柔均匀清洗细胞三次，每次5min。
[0103](6)向共聚焦小皿中加入5％BSA封闭30min。
[0104](7)封闭完成后，根据一抗说明书，吸弃5％BSA封闭液，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜。
[0105](8)一抗孵育完成后，吸弃一抗稀释液，用PBST轻柔均匀清洗细胞三次，每次5min。
[0106](9)根据一抗种属性加入相应荧光的稀释好的二抗，室温孵育1h。此后实验步骤应注意全程避光处理。
[0107](10)二抗染色完成后，用PBST轻柔均匀清洗细胞三次，每次5min。
[0108](11)向共聚焦小皿中滴加DAPI(5mg/kg)，染色10min，进行细胞核的染色；用PBST轻柔均匀清洗细胞三次，每次5min。
[0109](12)显微镜下观察采集图像。
[0110]3.结果分析：
[0111]由图5可知，TNFSF15蛋白促进了体外培养的髓系CD11b+细胞向周细胞的分化。
[0112]实施例4TNFSF15处理体外培养的髓系CD11b+细胞后，细胞形态的变化。
[0113]1.普通显微镜下观察细胞形态：体外培养的CD11b+细胞在第1天、第3天、第5天与第7天时，显微镜下观察细胞形态变化。
[0114]2.微分干涉差显微镜(DIC)下观察CD11b+细胞体外培养1天时的贴壁细胞形态变化。
[0115]3.结果分析：
[0116]由图6可知，与Vehicle组相比，TNFSF15处理组的CD11b+细胞，培养第一天时，细胞核与细胞体积明显偏大，细胞边缘刺突状针形触角丰富；培养第三天时，TNFSF15组呈典型鹅卵石状，细胞饱满；培养第五天时，TNFSF15组开始出现纺锤形细胞；培养第七天时，TNFSF15组细胞普遍呈细长纺锤状；由此可知，TNFSF15促进了分化中的CD11b+细胞呈周细胞样形态。
[0117]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。