1.一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法，其特征在于，利用3D打印结合编织方法制备得到管状细胞外基质纤维支架后进行抗凝修饰，即得到所述管状细胞外基质纤维支架。
2.根据权利要求1所述的一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法，其特征在于，所述利用3D打印结合编织方法具体包括以下步骤：
将脱细胞后的动物管状组织利用旋切法切割后加捻，再通过3D打印纬线部分后编织经线部分，得到所述管状细胞外基质纤维支架。
3.根据权利要求2所述的一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法，其特征在于，所述动物管状组织为小肠、大肠、动脉和静脉中的一种；
所述动物包括猪、牛、羊、犬、马、鼠和兔子中的一种或任意几种。
4.根据权利要求2所述的一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法，其特征在于，所述旋切法包括以下步骤：
将脱细胞后的动物管状组织套在圆柱形模具上后固定于旋切设备，然后用刀或激光以螺旋线轨迹进行切割，得到连续的细胞外基质长条。
5.根据权利要求2所述的一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法，其特征在于，所述3D打印纬线部分后编织经线部分具体包括以下步骤：
根据所需宏观形状设计支架材料的织造结构，并编写相应的G代码，将细胞外基质纤维打印在插有规则排布针管的平台上，织造支架材料的纬线部分，将针管用细胞外基质纤维替代，织造支架材料的经线。
6.根据权利要求1所述的一种管状细胞外基质纤维支架，其特征在于，所述抗凝修饰包括以下步骤：
将所述管状细胞外基质纤维支架浸渍于多巴胺溶液中搅拌反应后，再置于水蛭素溶液中继续搅拌反应，即完成所述抗凝修饰。
7.根据权利要求6所述的一种管状细胞外基质纤维支架，其特征在于，所述多巴胺溶液的浓度为0.1-10％；
所述水蛭素溶液的浓度为0.5-10％。
8.如权利要求1所述的一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法制备得到的管状细胞外基质纤维支架，其特征在于，所述管状细胞外基质纤维支架的直径为1-100mm，长度为1-800mm。
9.如权利要求8所述的一种管状细胞外基质纤维支架在制备组织修复支架材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述组织修复包括血管、神经、肌腱、气管、食管、大肠或小肠的修复。

技术领域
[0001]本发明属于医用材料技术领域，尤其涉及一种管状细胞外基质纤维支架及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]心血管疾病(CVD)是人类健康头号杀手，全球范围内每年发病率和死亡率一直居高不下。《中国心血管健康与疾病报告2022》指出：中国CVD发病率持续上升。据推算，CVD现患人数3.3亿，其中冠心病1139万人，外周动脉疾病4530万人。小口径人工血管是治疗冠脉和外周动脉堵塞的重要手段，全球年需求量300余万根，中国需求占22％。临床上，医生会优先使用患者自体血管如大隐静脉、乳内动脉、桡动脉等来替换堵塞的血管，然而，有基础疾病或已经使用过的患者自体血管不能使用，另外，自体血管取材需要二次手术和昂贵的费用从而限制了其在临床上的应用。当前，临床上使用的大口径人工血管主要由不可降解的膨体聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚氨酯等加工而成，虽然在大口径(内径>6mm)血管移植中表现出了较高的通畅率，但是在小口径血管(内径＜6毫米)替代中存在易形成血栓、内膜增生、远期通畅率低等问题。迄今，临床上尚无性能优异的小口径人工血管(口径＜6毫米)产品，因此，研发新型小口径人工血管具有重要的临床意义。
[0003]近年来，科学家利用人工合成可降解聚合物材料或天然材料构建了多种小口径人工血管，期望可以在体内募集内源细胞原位再生成为类天然血管组织，然而，尽管人工合成材料力学强，具有良好的可加工性能，但生物相容性和活性不足，胶原蛋白等天然材料虽具有良好的生物相容性，但其力学性能较弱。通过脱细胞方法获得的细胞外基质材料具有免疫调节作用，可为细胞粘附、增殖和分化提供再生微环境，在细胞外基质人工血管构建和应用方面也取得了实质性的进展。利用人或动物源的动脉脱细胞构建的小口径人工血管结构致密，能够限制细胞迁移，阻碍血管再生，通过体外细胞培养构建的细胞外基质小口径人工血管展现了较好的应用前景。其中比较典型的例子是，美国耶鲁大学的LauraE.Niklason教授课题组体外利用生物反应器进行流动培养构建了细胞外基质人工血管。在动静脉瘘模型和外周动脉搭桥中展现了良好的抗感染和促血管再生性能(J.H.Lawson,L.E.Niklason,P.Roy-Chaudhury,Challengesandnovel therapiesforvascularaccessinhaemodialysis,NatRevNephrol.16(2020)586–602.)。然而，该工艺培养条件苛刻、耗时长、成本高、价格昂贵。相比之下，法国的波尔多大学的NicolasL'Heureux教授等人将羊膜组织脱细胞处理后裁剪成纤维，进一步通过编织构建小口径人工血管，该纺织工艺优势是耗时短、成本低、可控性强。然而，羊膜大小有限，导致裁剪后的纤维长度有限，很难实现连续编织，限制了编织血管规模化生产。王桂发将牛肠衣用刀具切成均匀宽度的牛肠衣片，脱脂、洗涤、加捻后用于制备成缝合线，其长度可达40米，但该长度仍然不足以生产大尺寸支架材料，用于人体极限体积组织缺损修复。因此，开发适宜的策略和工艺来制备细胞外基质纤维进而编织成细胞外基质人工血管有望解决现有细胞外基质人工血管生产中面临的诸多问题。
[0004]在管状纤维支架的构建方面，目前的方法有双层机织物和一体化编织等，其在化纤编织上应用成熟，但是在织造过程中纤维会反复摩擦，对强度和耐磨性要求高，且工艺较为繁琐，限制了细胞外基质纤维的应用。
发明内容
[0005]为解决上述技术问题，本发明提出了一种用于组织修复的管状细胞外基质纤维支架及其制备方法与应用。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007]一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法，利用3D打印结合编织方法制备得到管状细胞外基质纤维支架后进行抗凝修饰，即得到所述管状细胞外基质纤维支架。
[0008]优选的，所述利用3D打印结合编织方法具体包括以下步骤：
[0009]将脱细胞后的动物管状组织利用旋切法切割后加捻，再通过3D打印纬线部分后编织经线部分，得到所述管状细胞外基质纤维支架。
[0010]有益效果：本发明将细胞外基质纤维的活性、3D打印的多样性和织物的独特结构优势结合起来。
[0011]更为优选的，所述管状细胞外基质纤维支架的微观织造结构是由经线和纬线交织互锁固定成平纹、斜纹和缎纹中的一种。
[0012]优选的，所述动物管状组织为小肠、大肠、动脉和静脉中的一种；
[0013]所述动物包括猪、牛、羊、犬、马、鼠和兔子中的一种或任意几种。
[0014]有益效果：本发明中的细胞外基质纤维通过旋切获得，适用于多种动物的多种管状组织，原材料来源相对广泛。
[0015]优选的，所述旋切法包括以下步骤：
[0016]将脱细胞后的动物管状组织套在圆柱形模具上后固定于旋切设备，然后用刀或激光以螺旋线轨迹进行切割，得到连续的细胞外基质长条。
[0017]有益效果：相对于传统的纵向直接切割，本发明选择旋切法切割可以获得数倍于自身长度的细胞外基质纤维，进而编织出更长的管状细胞外基质纤维支架。
[0018]优选的，所述3D打印纬线部分后编织经线部分具体包括以下步骤：
[0019]根据所需宏观形状设计支架材料的织造结构，并编写相应的G代码，将细胞外基质纤维打印在插有规则排布针管的平台上，织造支架材料的纬线部分，将针管用细胞外基质纤维替代，织造支架材料的经线。
[0020]有益效果：传统织造工艺复杂，本发明采用3D打印和编织结合，可以精细化构建管状织物。
[0021]优选的，所述抗凝修饰包括以下步骤：
[0022]将所述管状细胞外基质纤维支架浸渍于多巴胺溶液中搅拌反应后，再置于水蛭素溶液中继续搅拌反应，即完成所述抗凝修饰。
[0023]优选的，所述多巴胺溶液的浓度为0.1-10％；
[0024]所述水蛭素溶液的浓度为0.5-10％。
[0025]有益效果：水蛭素具有优异的抗凝性能，可以抑制凝血酶活性。多巴胺可以与多个基团发生化学反应，从而将抗凝剂结合在管状织物表面，提升其抗凝性能。
[0026]一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法制备得到的管状细胞外基质纤维支架，所述管状细胞外基质纤维支架的直径为1-100mm，长度为1-800mm。
[0027]有益效果：本发明采用3D打印结合编织，可以灵活控制织造管状支架的直径和长度。
[0028]一种管状细胞外基质纤维支架在制备组织修复支架材料中的应用。
[0029]优选的，所述组织修复包括血管、神经、肌腱、气管、食管、大肠或小肠的修复。
[0030]有益效果：本发明所得细胞外基质纤维管状支架具有良好的力学性能和生物活性，可以应用在各种类管状组织的修复与再生。
[0031]与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
[0032]本发明利用3D打印技术辅助编织技术，可以制备足够长的细胞外基质纤维支架，同时可精细化控制管状细胞外基质纤维支架结构。与传统的脱细胞基质支架材料相比，本发明所得管状细胞外基质纤维支架能够诱导细胞的快速迁移，促进组织内源性再生，细胞外基质纤维降解可释放多种活性因子加速组织修复，可以实现细胞外基质管状材料高效、低成本规模化制备。此外，本发明通过多巴胺将管状细胞外基质纤维支架修饰上抗凝药物水蛭素，通过多巴胺修饰上抗凝药物水蛭素使得该管状材料具有持久的抗凝活性，可以抑制血小板粘附活性，提高血液相容性，促进内膜再生，提升长期通畅率。
附图说明
[0033]构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0034]图1是实施例2细胞外基质纤维制备和性能表征；
[0035]其中，A是动物管状组织脱细胞处理示意图，B是管状组织旋切模式图，C是管状组织长条加捻模式图，D是小肠粘膜下层脱细胞纤维及示意图，E是小肠粘膜下层脱细胞后苏木素伊红染色和细胞核染色，F是经过旋切后可获得不同宽度的细胞外基质长条，G是经过不同转速加捻后获得细胞外基质纤维形态；
[0036]图2是实施例2细胞外基质纤维编织人工血管的制备和表征；
[0037]其中，A是细胞外基质纤维编织人工血管的结构示意图；B和C是细胞外基质纤维编织人工血管的侧视图及俯视图；D是编织形成的长细胞外基质纤维编织人工血管；
[0038]图3是实施例3细胞外基质纤维编织人工血管的抗凝修饰；
[0039]其中，A是细胞外基质纤维编织人工血管修饰和不修饰水蛭素后的血小板粘附图，B是细胞外基质纤维编织修饰和不修饰的人工血管水蛭素APTT、PT、TT；
[0040]图4是实施例3细胞外基质纤维编织人工血管用于大鼠腹主动脉替换及效果评价；
[0041]其中，A是大鼠腹主动脉替换彩色多普勒超声检测术后1个月修饰和不修饰水蛭素管状支架的通畅情况，B是修饰和不修饰水蛭素管状支架术后1个月的形貌。
具体实施方式
[0042]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0043]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0044]本发明实施例公开了一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法，利用3D打印结合编织方法制备得到管状细胞外基质纤维支架后进行抗凝修饰，即得到所述管状细胞外基质纤维支架。
[0045]在优选的实施例中，所述利用3D打印结合编织方法具体包括以下步骤：
[0046]将脱细胞后的动物管状组织利用旋切法切割后加捻，再通过3D打印纬线部分后编织经线部分，得到所述管状细胞外基质纤维支架。
[0047]在更为优选的实施例中，所述管状细胞外基质纤维支架的微观织造结构是由经线和纬线交织互锁固定成平纹、斜纹和缎纹中的一种。
[0048]在优选的实施例中，所述动物管状组织为小肠、大肠、动脉和静脉中的一种；
[0049]所述动物包括猪、牛、羊、犬、马、鼠和兔子中的一种或任意几种。
[0050]在优选的实施例中，所述旋切法包括以下步骤：
[0051]将脱细胞后的动物管状组织套在圆柱形模具上后固定于旋切设备，然后用刀或激光以螺旋线轨迹进行切割，得到连续的细胞外基质长条。本发明中的旋切法能够使得细胞外基质长条的宽度可控。
[0052]在优选的实施例中，所述3D打印纬线部分后编织经线部分具体包括以下步骤：
[0053]根据所需宏观形状设计支架材料的织造结构，并编写相应的G代码，将细胞外基质纤维打印在插有规则排布针管的平台上，织造支架材料的纬线部分，将针管用细胞外基质纤维替代，织造支架材料的经线。
[0054]在优选的实施例中，所述抗凝修饰包括以下步骤：
[0055]将所述管状细胞外基质纤维支架浸渍于多巴胺溶液中搅拌反应后，再置于水蛭素溶液中继续搅拌反应，即完成所述抗凝修饰。
[0056]在优选的实施例中，所述多巴胺溶液的浓度为0.1-10％；
[0057]所述水蛭素溶液的浓度为0.5-10％。
[0058]更为优选的，所述搅拌反应的时间为24h，所述继续搅拌反应的时间为2h。
[0059]本发明实施例还公开了一种管状细胞外基质纤维支架的制备方法制备得到的管状细胞外基质纤维支架，所述管状细胞外基质纤维支架的直径为1-100mm，长度为1-800mm。
[0060]本发明实施例还公开了一种管状细胞外基质纤维支架在制备组织修复支架材料中的应用。
[0061]在优选的实施例中，所述组织修复包括血管、神经、肌腱、气管、食管、大肠或小肠的修复。
[0062]如无特殊说明，本发明实施例中的管状组织均通过购买得到；
[0063]其中，牛颈动脉、猪小肠黏膜以及猪腹主动脉均购自屠宰场(天津二商迎宾肉类食品有限公司)。
[0064]如无特殊说明，本发明实施例中的室温均指25±3℃。
[0065]以下实施例中3D打印的操作流程按照设备说明书要求即可，结构设计的G代码设计也是根据最终产品结构要求进行的，均属于常规操作流程，本领域技术人员熟知。
[0066]实施例1
[0067]一种用于组织修复的管状牛颈动脉细胞外基质纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
[0068](1)脱细胞处理：将牛颈动脉整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在50r/min的速率下搅拌2h以消毒。消毒结束后取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔6h换一次溶液，洗涤1天。然后用水按照组织和水1:5质量比，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔5h换一次溶液，洗涤3天。洗涤结束后再将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris-HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在50r/min、37℃条件下酶洗20h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织。
[0069](2)旋切：将上述脱细胞管状组织套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切，设置金属棒自转速度80r/min，刀具横移速度50mm/min，旋切得到3.5mm宽的连续长条。
[0070](3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述细胞外基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度90r/min，卷绕的速度110r/min，加捻程度为3r/cm。
[0071](4)结构设计：根据所需管状结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。
[0072](5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造细胞外基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为10cm的针管组成方形阵列，间距1.5mm，替代经线，将细胞外基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。
[0073](6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用细胞外基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得管状细胞外基质纤维支架材料。管状细胞外基质纤维支架材料直径是5毫米，长度是30毫米。
[0074](7)抗凝修饰：将管状支架浸渍在质量浓度为1％的多巴胺溶液中搅拌反应24小时，取出支架放入质量浓度为10％的水蛭素溶液中搅拌反应2小时进行抗凝修饰，即得到用于组织修复的管状牛颈动脉细胞外基质纤维支架。
[0075]实施例2
[0076]一种用于组织修复的管状猪小肠黏膜下层细胞外基质纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
[0077](1)脱细胞处理：将猪小肠黏膜下层整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在50r/min的速率下搅拌2h以消毒。消毒结束后取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔6h换一次溶液，洗涤1天。然后用水按照组织和水1:5质量比，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔5h换一次溶液，洗涤3天。洗涤结束后再将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris-HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在50r/min、37℃条件下酶洗20h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织。
[0078](2)旋切：将上述脱细胞管状组织套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切，设置金属棒自转速度80r/min，刀具横移速度50mm/min，旋切得到3.5mm宽的连续长条。
[0079](3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述细胞外基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度90r/min，卷绕的速度110r/min，加捻程度为3r/cm。
[0080](4)结构设计：根据所需管状结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。
[0081](5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造细胞外基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为10cm的针管组成方形阵列，间距1.5mm，替代经线，将细胞外基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。
[0082](6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用细胞外基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得管状细胞外基质纤维支架材料。管状细胞外基质纤维支架材料直径是2毫米，长度是20毫米。
[0083]图1是细胞外基质纤维制备和性能表征，可以看出，本实施例旋切后得到细胞外基质长条，其宽度可控，且宽度可以达到1毫米，并且，长度超长，将20厘米脱细胞小肠旋切至2毫米宽度，可以得到8米长的长条，远大于传统直接切割的长度。同时，本发明利用旋切纯物理加工方式，不改变材料厚度，也没有酸溶酶解和湿法纺丝等处理，不会破坏其活性。此外，本发明加捻后的细胞外基质纤维纤维自然卷曲，并形成沿长度方向的沟槽，可以引导取向再生，且加捻程度可控，捻度越大纤维卷曲越紧密。
[0084]图2是实施例2细胞外基质纤维编织人工血管的制备和表征，可以看出，细胞外基质纤维编织人工血管在编织结构上属于机织结构，是经线纬线的交织，且人工血管经线纬线交织紧密，直径和长度灵活可控。
[0085](7)抗凝修饰：将管状支架浸渍在质量浓度为1％的多巴胺溶液中搅拌反应24小时，取出支架放入质量浓度为10％的水蛭素溶液中搅拌反应2小时进行抗凝修饰，即得到用于组织修复的管状猪小肠黏膜下层细胞外基质纤维支架。
[0086]实施例3
[0087]一种用于组织修复的管状猪腹主动脉细胞外基质纤维支架的制备方法，包括以下步骤：
[0088](1)脱细胞处理：将猪腹主动脉整根或者部分组织，按照组织和溶液质量比为1:5放入质量浓度为0.1％的过氧乙酸溶液中，在50r/min的速率下搅拌2h以消毒。消毒结束后取出用水冲洗三遍，按照组织和溶液1:5质量比放入质量浓度为1％的十二烷基硫酸钠溶液中，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔6h换一次溶液，洗涤1天。然后用水按照组织和水1:5质量比，在50r/min搅拌速率下搅拌洗涤，每隔5h换一次溶液，洗涤3天。洗涤结束后再将组织和溶液按照1:5质量比用含有DNA和RNA酶的Tris-HCL溶液(50单位/mLDNA酶+1单位/mLRNA酶)，在50r/min、37℃条件下酶洗20h，取出，再用水洗涤3天，得到脱细胞管状组织。
[0089](2)旋切：将上述脱细胞管状组织套在金属棒上，再将该金属棒固定于旋切设备，利用刀具以螺旋线轨迹在棒表面旋切，设置金属棒自转速度80r/min，刀具横移速度50mm/min，旋切得到3.5mm宽的连续长条。
[0090](3)加捻：采用加捻卷绕设备将上述细胞外基质条加捻成纤维，并自动卷绕在筒管上，加捻的速度90r/min，卷绕的速度110r/min，加捻程度为3r/cm。
[0091](4)结构设计：根据所需管状结构设计纤维织造结构，并编写用于3D打印机运行的G代码。
[0092](5)打印纬线部分：采用3D打印设备织造细胞外基质支架材料，打印平台由一组竖直插着的直径为21G，长度为10cm的针管组成方形阵列，间距1.5mm，替代经线，将细胞外基质纤维从打印机喷口引出，按照编写的G代码控制的路径绕在打印平台针管上，然后逐层绕制，形成支架材料的纬线部分。
[0093](6)编织经线部分：将针管从绕制的支架材料拔出，将每一列纬线用细胞外基质纤维沿着针管空缺部位以S形串联起来，形成支架材料的经线。最终获得管状细胞外基质纤维支架材料。管状细胞外基质纤维支架材料直径是10毫米，长度是50毫米。
[0094](7)抗凝修饰：将管状支架浸渍在质量浓度为1％的多巴胺溶液中搅拌反应24小时，取出支架放入质量浓度为10％的水蛭素溶液中搅拌反应2小时进行抗凝修饰，即得到用于组织修复的管状猪腹主动脉细胞外基质纤维支架。
[0095]技术效果：
[0096]1.血小板粘附实验：
[0097]将新鲜兔血在1500r/min转速下离心15min，取上清液得到富血小板血浆(PRP)，采用血球计数板计数血小板浓度备用。将实施例3所得管状细胞外基质纤维支架裁剪成1厘米长宽灭菌放入48孔板，每孔/管加入1mLPBS放置在培养箱保温1h，然后吸除PBS。每孔加入1mL的用PBS稀释的含有5×105个血小板的PRP溶液，放置在37℃静置孵育3h，将血小板粘附后的溶液去除，用PBS漂洗后，用2.5％的戊二醛固定12h。然后用25％、50％、75％、100％的乙醇分别浸泡30min梯度脱水，最后贴在电镜台上，喷金后SEM观察血小板粘附形态。
[0098]2.凝血时间实验：
[0099]取新鲜兔血在3000r/min离心15min，取上清液得到贫血小板血浆(PPP)。测试活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)凝血酶时间(TT)和FIB含量，将实施例3所得管状细胞外基质纤维支架裁剪成圆片加入离心管，每管加入200μL的PPP，37℃孵育10min。然后分别再加入：(1)200μL预热的凝血酶原试剂测试PT；(2)加入200μL预热的凝血酶试剂测试TT；(3)先加入200μL的活化部分凝血活酶试剂，37℃孵育3min，再加入200μL的预热的1％浓度CaCl2溶液测试APTT。将通过以上三种方法所得样品在半自动凝血分析仪上读取凝血时间。
[0100]结果如图3所示，由图3可知，水蛭素接枝后，管状细胞外基质纤维支架材料抗凝血性能显著改善，血小板粘附显著少于不修饰组，接枝后织物表面血小板基本没有，且水蛭素接枝后APTT、PT、TT都显著延长，尤其是APTT，延长接近一倍。
[0101]3.管状细胞外基质纤维支架用于大鼠腹主动脉替换实验，包括以下步骤：
[0102]大鼠腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉(3.3mL/kg体重)，待大鼠进入深度麻醉后，鼠尾静脉注射肝素(100U.I/kg剂量)进行全身肝素化处理，剃除腹部毛发，剪开腹部皮肤及肌肉，剥离肾下腹主动脉，对动脉小分支进行结扎，用动脉夹夹住动脉的两端，从中间剪断动脉，剥离动脉外层后，用9-0带针尼龙缝合线采用端端吻合术进行原位植入实施例3所得管状细胞外基质纤维支架。缝合时以米字法缝合，每端8针。两端均缝好后，用棉花小心压住缝合处止血，缓慢移除动脉夹以恢复血流。用硫酸庆大霉素冲洗腹腔，3-0缝合线缝合肌肉层和皮肤，碘伏消毒。在12周时间点时用异弗烷气体麻醉后，利用高分辨率超生多普勒检测通畅情况，之后进行深度麻醉取材进行内表面形貌观察。
[0103]由图4可知，多普勒超声显示，植入大鼠腹主动脉的管状细胞外基质纤维支架完全通畅，无狭窄和动脉瘤，而不接枝水蛭素的管状细胞外基质纤维支架易堵塞。并且，根据纵切内表面观察可以看到，接枝水蛭素的管状细胞外基质纤维支架内表面完全被新生内膜组织覆盖，表面无血栓，缝合口再生良好，无明显狭窄，而不接枝水蛭素的管状细胞外基质纤维支架组内膜表面有血栓存在。
[0104]以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。