1.一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，其特征在于，包括：缺氧激活探针、血管破坏剂和金属有机框架，所述缺氧激活探针和血管破坏剂共同负载于金属有机框架上；
其中，所述金属有机框架为在酸性条件下可以降解的金属有机框架。
2.如权利要求1所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，其特征在于，还包括免疫细胞膜，所述免疫细胞膜覆盖于所述金属有机框架的表面上。
3.如权利要求1所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，其特征在于，所述缺氧激活探针为基于N-氧化物结构制备的分子探针，所述N-氧化物结构的分子探针可以在缺氧刺激下转化为相应的胺化合物。
4.如权利要求3所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，其特征在于，所述基于N-氧化物结构的分子探针为4,4'-(苯并[1,2-c:4,5-c']噻二唑-4,7-二基)双(N,N-二乙基苯胺氧化物)。
5.如权利要求1所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，其特征在于，所述血管破坏剂为微管蛋白抑制剂。
6.如权利要求5所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，其特征在于，所述微管蛋白抑制剂为康普瑞丁磷酸酯。
7.如权利要求2所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，其特征在于，所述免疫细胞膜为M1巨噬细胞膜。
8.一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1至7任一项所述的纳米诊疗制剂，包括如下步骤：
S100、制备缺氧激活探针；
S200、以去离子水为溶剂使2-甲基咪唑、六水合硝酸锌、缺氧激活探针和血管破坏剂发生共价化学反应，将反应后的溶液离心、洗涤、干燥后，获得装载了缺氧激活探针和血管破坏剂的金属有机框架；
S300、在金属有机框架表面覆盖免疫细胞膜。
9.如权利要求8所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，S100中所述缺氧激活探针为基于N-氧化物结构的分子探针；
具体合成过程如下：卤代N,N-二乙基苯胺衍生物与苯并双噻二唑发生施蒂勒反应，随后与间氯过氧苯甲酸进行氧化反应，得到基于N-氧化物结构制备的分子探针。
10.如权利要求8所述的一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂的制备方法，其特征在于，S300中，通过共挤出的方式在金属有机框架表面覆盖免疫细胞膜。

技术领域
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂及其制备方法。
背景技术
[0002]尽管在过去几十年中，由于早期检测方法、手术技术和先进诊疗技术的进步，人类在癌症的诊断和预后方面取得了很大的进展，但癌症仍然是全球主要的公共卫生问题。因此，结合高效的综合疾病诊断和治疗策略对提高癌症治疗效果和总生存率至关重要。然而目前常用的成像技术大多存在固有的优缺点和适用范围，如荧光（fluorescence ，缩写FL）成像技术，具有高灵敏度和价格低廉，但在穿透深度和空间分辨率方面受到限制。光声（Photoacoustic，缩写PA）成像则具有很好的空间分辨效果和组织穿透能力，但灵敏度较低。最近报道的第二个近红外窗口（Near-Infrared-II，缩写NIR-II，1000-1700 nm）的荧光成像可以降低组织散射和自发荧光，且穿透力和分辨率均有所提高。因此，将NIR-II FL/PA双模式成像应用到肿瘤诊断中是一种引人瞩目的策略。然而，肿瘤的NIR-II FL/PA双模式成像目前仍然面临挑战。首先，同时实现NIR-II FL和PA信号的最大亮度是一项困难的任务，因为它们分别对应于辐射和非辐射通道。其次，“常亮型”NIR-II FL/PA信号缺乏疾病特异性激活，妨碍了它们在选择性区分正常和病理组织方面的作用。因此，亟需开发可激活的探针，能够针对特定病理特征微环境实现“点亮型”NIR-II FL/PA双模式信号，以提高疾病诊断的灵敏度和精确度。
[0003]最近，光热疗法（Photothermal therapy，缩写PTT）和光动力疗法（Photodynamictherapy，缩写PDT）等光疗策略因无创、毒副作用小、高时空特异性和优异的临床表现等而备受关注。此外，光疗还可以通过免疫原性死亡（Immunogenic cell death，缩写ICD）来诱导癌细胞释放大量肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen, 缩写TAAs）和损伤相关分子模式（damage-associatedmolecularpattern， 缩写DAMPs），这些抗原可促进树突状细胞（Dendritic cells，缩写DC）成熟并有助于抗原呈递给T细胞。除ICD外，模式识别受体（pattern recognition receptor，缩写PRR）刺激物也已成为激活肿瘤免疫系统的有效工具。环磷酸鸟苷-磷酸腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosinemonophosphate synthase，缩写cGAS)-干扰素基因刺激物(stimulator of interferongenes，缩写STING)通路的激活可诱导I型干扰素和其他免疫介质的产生，增强先天性免疫反应和抗肿瘤免疫循环。最近的研究发现，PDT和PTT可以破坏细胞内的氧化还原平衡，导致线粒体和核DNA损伤，甚至随后泄漏到细胞质中。大量研究证明这些泄露的线粒体和细胞核DNA可以有效激活cGAS-STING信号通路，从而激发抗肿瘤免疫反应。虽然PDT和PTT有望同时激活ICD和cGAS-STING通路，但目前的光疗法通常面临一些挑战。首先，大多数已报道的光敏剂无论是否位于肿瘤病灶中都处于"常开"状态。其次，在各种光敏剂中，有机分子具有组成简单、结构明确、生物相容性好、功能可调等优点。然而，大多数有机光敏剂稳定性差、光降解严重、聚集导致猝灭效应等问题阻碍了它们的广泛应用。
[0004]缺氧是肿瘤微环境（Tumor Mircroenviroment，缩写TME）的一个显著特征。在肿瘤部位，微血管表现出结构和功能紊乱，而快速增殖的癌细胞对新陈代谢的需求造成了供氧不足和耗氧加速之间的不平衡。这种动态变化导致了大多数实体瘤中普遍存在的缺氧状况。缺氧会引发与肿瘤发生、恶性进展、转移以及对化疗和放疗的耐药性有关的基因表达上调。因此，体内选择性缺氧检测是表征肿瘤形成和发展的关键工具，也为预测治疗反应和制定针对患者的治疗方案提供了重要信息。同时具有无创多模式缺氧成像功能和缺氧触发免疫治疗功能以及可调光物理能量转换过程的分子探针具有很好的应用前景，但目前还鲜有报道。
[0005]因此，如何利用肿瘤微环境的缺氧特征提供一种诊疗制剂，使治疗制剂不仅能通过活化生物成像实现精确、实时的肿瘤诊断，还能通过智能光疗发挥强大的抗肿瘤和免疫调节作用，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
[0006]本发明旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的第一个目的在于提供一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂；本发明的第二个目的在于提供一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂的制备方法。
[0007]为了实现第一个目的，本发明所采取的技术方案为：
一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂，包括：缺氧激活探针、血管破坏剂和金属有机框架，所述缺氧激活探针和血管破坏剂共同负载于金属有机框架上；
其中，所述金属有机框架为在酸性条件下可以降解的金属有机框架。
[0008]进一步地，还包括免疫细胞膜，所述免疫细胞膜覆盖于所述金属有机框架的表面上。
[0009]进一步地，所述缺氧激活探针为基于N-氧化物结构制备的分子探针，所述N-氧化物结构的分子探针可以在缺氧刺激下转化为相应的胺化合物，分子结构由受体-受体构型转变为供体-受体型。
[0010]进一步地，所述基于N-氧化物结构的分子探针为4,4'-(苯并[1,2-c:4,5-c']噻二唑-4,7-二基)双(N,N-二乙基苯胺氧化物)（简写为BN-O）。
[0011]进一步地，所述血管破坏剂为微管蛋白抑制剂。
[0012]进一步地，所述微管蛋白抑制剂为康普瑞丁磷酸酯（简写为CA4P）。
[0013]进一步地，所述免疫细胞膜为M1巨噬细胞膜。
[0014]为了实现第二个目的，本发明所采取的技术方案为：
[0015]一种用于多模式成像和癌症联合免疫治疗的纳米诊疗制剂的制备方法，用于制备上述的纳米诊疗制剂，包括如下步骤：
S100、制备缺氧激活探针；
S200、以去离子水为溶剂使2-甲基咪唑（简称2-MI）、六水合硝酸锌、缺氧激活探针和血管破坏剂发生共价化学反应，将反应后的溶液离心、洗涤，干燥获得装载了缺氧激活探针和血管破坏剂的金属有机框架；
S300、在金属有机框架表面覆盖免疫细胞膜。
进一步地，S100中所述缺氧激活探针为基于N-氧化物结构的分子探针；
[0016]具体合成过程如下：卤代N,N-二乙基苯胺衍生物与苯并双噻二唑发生施蒂勒反应，随后与间氯过氧苯甲酸进行氧化反应，得到基于N-氧化物结构制备的分子探针。
[0017]进一步地，S300中，通过共挤出的方式在金属有机框架表面覆盖免疫细胞膜。
[0018]本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果之一：
将缺氧激活探针和血管破坏剂整合到一种酸响应性的金属有机框架（Metalorganic Framework，缩写MOF）中形成纳米诊疗制剂。该MOF在弱酸条件下（pH小于6.5）可快速降解，进而促使血管破坏剂的释放。释放的血管破坏剂可以通过破坏肿瘤部位血管诱导强化肿瘤微环境（Tumor Mircroenviroment，缩写TME）缺氧，从而加速缺氧激活探针的转变进程，缺氧激活探针失去氧后，除了可以高效地诱导PTT和PDT外，由于能量带隙的变小，吸收光谱发生红移，会在近红外区实现“点亮型”开启的光声信号，且产生明亮的NIR-II FL信号。该纳米制剂通过原位可激活的荧光能够灵敏地描绘体内肿瘤的信息。进入肿瘤组织以后，该纳米诊疗制剂具有缺氧诱导强效PDT、PTT性质和高效诱导肿瘤细胞免疫原性死亡的能力。由于其优异的ROS产生能力，光热转换效率和自加速的探针转变，该纳米诊疗制剂不仅能够抑制原发肿瘤的生长，而且通过引发强烈的免疫反应抑制4T1荷瘤小鼠体内的远端肿瘤。
[0019]当在纳米诊疗制剂的金属有机框架表面覆盖免疫细胞膜后，特别是巨噬细胞膜后，在巨噬细胞膜的介导下，不仅可以减少被单核细胞的吞噬，同时延长循环时间，增强肿瘤的靶向聚集，由于巨噬细胞上的α4β1整合素可以结合到癌细胞上的血管细胞黏附分子，从而提高纳米粒子肿瘤靶向能力。
[0020]本发明提供的纳米诊疗制剂提出了一种新的策略，实现了缺氧激活的诊疗性能和可控的药物释放，为实现精确成像引导的肿瘤免疫治疗提供新的方案。
[0021]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0022]图1是本发明实施例1提供的BN和BN-O的合成路线图。
[0023]图2是本发明实施例1提供的BN-O的核磁碳谱。
[0024]图3是本发明实施例1提供的BN-O的高分辨率质谱。
[0025]图4是本发明实验例2提供不同光敏剂的光谱性质表征图；其中，A图为BN和BN-O在二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）中的吸收光谱；B图为BN和BN-O在DMSO中的吸收光谱；C图为I/I0与白光照射时间的关系，I0和I表示光照射前后2',7'-二氯荧光素（2',7'-Dichlorofluorescein，DCF）在525 nm处的发射强度；D图为BN和BN-O分子在730 nm激光照射下温度与光照时间的关系图。
[0026]图5是本发明实验例3提供的BN-O分子在缺氧条件下光谱转变表征；其中，A为BN-O在缺氧条件下的紫外吸收光谱变化图，B为BN-O在缺氧条件下的荧光光谱变化图，C为BN在缺氧条件下的荧光光谱变化图，D为响应后高分辨率质谱表征图。
[0027]图6是本发明实验例4提供的不同活性氧物质/氧化还原分子/金属离子处理后BC@Z-M近红外PL/PA开启倍率图。
[0028]图7是本发明实验例5提供的BC@Z-M在不同pH下粒径和形态的变化；其中，A为未经处理的BC@Z-M的TEM图和粒径图，B在酸性条件下BC@Z-M的TEM图和粒径图。
[0029]图8是本发明实验例6提供的BC@Z-M缺氧条件下的分子转换性质研究；其中，A为缺氧响应前后PL光谱变化，B为缺氧响应前后ROS产生能力表征，C为缺氧响应前后的热性能表征，D为缺氧响应前后的光性能表征，I0和I表示光照射前后DCF在525 nm处的发射强度。
[0030]图9是本发明实验例7提供的体外靶向研究；其中，A为BC@Z和BC@Z-M对4T1（小鼠乳腺癌细胞）肿瘤细胞摄取情况图，B为BC@Z和BC@Z-M对RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）巨噬细胞的摄取情况，C为BC@Z和BC@Z-M对4T1细胞和RAW264.7细胞的摄取定量结果统计图。
[0031]图10是本发明实验例8提供的体外细胞缺氧响应研究；其中，A为在缺氧条件下4T1细胞孵育BC@Z-M不同时间后近红外一/二区荧光的变化图，B为在常氧条件下4T1细胞孵育BC@Z-M不同时间后近红外一/二区荧光变化，C为常氧/缺氧条件下对细胞层面的荧光数值统计图。
[0032]图11是本发明实验例9提供的在缺氧/常氧条件下，对用不同配方处理24小时的4T1细胞进行ROS染色监测，比例尺：50μm，其中，2',7'-二氯荧光素（2',7'-Dichlorofluorescein,简称DCF）。
[0033]图12是本发明实验例9提供的在缺氧条件下不同浓度BC@Z-M对4T1肿瘤细胞杀伤效果的MTT法检测结果图。
[0034]图13是本发明实验例9提供的在缺氧/常氧条件下，对用不同方式处理24小时的4T1细胞进行活死染染色监测，比例尺：100μm。
[0035]图14是本发明实验例10提供的不同物质处理4T1细胞的钙网蛋白外翻（etco-CRT)水平情况，比例尺：50 μm。
[0036]图15是本发明实验例10提供的不同物质处理4T1细胞的高迁移率族蛋白B1（Highmobility group box-1 protein，简称HMGB1）外排水平情况，比例尺：50 μm。
[0037]图16是本发明实验例10提供的不同物质处理4T1细胞内ATP和cGAS-STING通路激活水平；其中，A为ATP，B为cGAS-STING通路激活水平。
[0038]图17是本发明实验例11提供的树突状细胞（DCs）提取培养示意图，其中，小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）。
图18是本发明实验例11提供的不同给药处理后DCs激活的流失结果图
[0039]图19；是本发明实验例11提供的不同给药处理组DCs的成熟统计和DCs表达IL-6水平统计图；其中，A为DCS成熟统计图，B为DCs表达IL-6水平统计图。
[0040]图20是本发明实验例12提供的缺氧转变能力研究情况；其中，A为活体层面缺氧荧光开启验证，比例尺：10 mm，B为正常组织和肿瘤组织的缺氧荧光开启的切片表征，比例尺：100μm。
[0041]图21是本发明实验例12提供的荷瘤小鼠在注射BC@Z-M纳米粒子后不同时间的NIR-II FI结果，比例尺：10 mm。
[0042]图22是本发明实验例12提供的荷瘤小鼠在注射BC@Z-M纳米粒子后不同时间的PAI结果，比例尺：1 mm。
[0043]图23是本发明实验例13提供的为评估在4T1荷瘤小鼠中各种干预措施的治疗效果的时间表示意图。
[0044]图24是本发明实验例13提供不同治疗干预后的情况；其中，A为的肿瘤生长曲线图（n=5），B为不同治疗干预后肿瘤生长图片（n = 5），C为不同治疗后小鼠的存活率（n = 5）。
[0045]图25是本发明实验例13提供的不同治疗干预后肿瘤切片的CD31免疫荧光染色，图，比例尺：50μm。
[0046]图26是本发明实验例13提供的不同治疗干预后肿瘤切片的CD31免疫荧光染色荧光量化结果统计图。
[0047]图27是本发明实验例13提供的不同治疗干预后各组肝/肺组织病理切片。
[0048]图28是本发明实验例13提供的肿瘤组织中巨噬细胞（TAMs）激活的流式表征图。
[0049]图29是本发明实验例13提供的肿瘤组织中巨噬细胞（TAMs）激活的定量分析统计图。
[0050]图30是本发明实验例13提供的肿瘤组织中细胞毒性T细胞激活的流式表征图。
[0051]图31是本发明实验例13提供的肿瘤组织中细胞毒性T细胞激活的定量分析统计图。
[0052]图32是本发明实验例14提供的双侧肿瘤模型中BC@Z-M介导的协同治疗过程示意图。
[0053]图33是本发明实验例14提供的双侧肿瘤不同治疗后情况，其中，Primary为原位癌，Distant为远距离癌，A为双侧肿瘤模型中的肿瘤生长曲线图，B为不同治疗后双侧肿瘤的重量统计图（n = 5）。
[0054]图34是本发明实验例14提供的不同治疗干预后双侧瘤中细胞毒性T细胞浸润的流式分析结果。
[0055]图35是本发明实验例14提供的不同治疗干预后肿瘤中细胞毒性T细胞浸润的定量分析统计图。
[0056]图36是本发明实验例15提供的小鼠器官病理切片。
[0057]图37是本发明实验例15提供的小鼠血液检验情况，其中，A为血常规指数，B为血生化指数。
具体实施方式
[0058]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
术语解释
[0059]血管破坏剂：靶向肿瘤血管是一种有效治疗肿瘤的方案。血管破坏剂通过损伤肿瘤血管的内皮细胞，从而特异性破坏肿瘤血管，导致肿瘤中心大面积坏死，在临床试验中发挥了良好的抗肿瘤疗效。
[0060]光声成像（Photoacoustic imaging，PAI）：是一种结合了光学和超声成像原理的生物成像技术，具有高空间分辨率、深度穿透力和分子特异性的特点，被广泛应用于生物医学领域。其原理是利用激光器产生的光脉冲照射生物样品，被组织吸收的光能会导致局部的热膨胀，形成光声信号。这些光声信号由组织中的超声传感器（通常是超声探头）捕获，并转换成电信号。通过测量光声信号的时间延迟和幅度，可以重建出组织内部的结构和功能信息。PAI具有高分辨率、高穿透深度、非侵入性和多模态成像的优势，也可用于肿瘤诊断、治疗检测和药物筛选等领域，对生物医学研究和临床诊疗具有重要意义。
[0061]近红外二区荧光成像（NIR-II FI）：是一种基于近红外（NIR）光区域的荧光成像技术，其波长范围大约为1000至1700纳米。这一波长范围内，生物组织的光散射和吸收较低，同时组织深度穿透性较好，因此适合用于体内成像。NIR-II FI通常利用荧光探针或荧光标记物，例如与肿瘤组织的特异性结合，或者用于标记特定的细胞或分子。当这些荧光探针或标记物被激发时，会发出NIR-II的荧光信号，可以通过成像设备捕获和记录下来。近红外二区荧光成像在生物医学领域具有广泛的应用，其中包括肿瘤诊断、肿瘤微环境研究、肿瘤治疗监测等方面。
[0062]免疫原性死亡（ICD）：是一种调节性细胞死亡类型，通常是指肿瘤细胞受到外界相关刺激发生死亡的同时，濒死细胞将产生新的抗原表位并释放细胞内容物，包括多种促炎因子和损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），释放的DMAPs被抗原呈递细胞结合、识别和吞噬，并将其呈递给T细胞，进而激活适应性免疫应答，是一个由非免疫原性变为免疫原性而介导机体产生抗肿瘤免疫应答的过程。
[0063]肿瘤相关性抗原（TAAs）：是指在肿瘤细胞或正常细胞上存在的抗原分子，包括：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，常用于临床肿瘤的诊断。
[0064]损伤相关分子模式（DAMPs）：损伤相关模式分子是组织或细胞受到损伤、缺氧、应激等因素刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类物质,可通过Toll样受体、RIG-1样受体或NOD样受体等模式识别受体,诱导自身免疫或免疫耐受,在关节炎、动脉粥样硬化、肿瘤、系统性红斑狼疮等疾病发生和发展过程中发挥重要作用。
[0065]树突状细胞（DC）：是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。
[0066]模式识别受体（PRR)是一类主要表达于固有免疫细胞表面、非克隆性分布、可识别一种或多种病原体相关分子模式的识别分子。
[0067]环磷酸鸟苷-磷酸腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激物（cGAS-STING）通路：是一种重要的免疫系统信号传导通路，其主要功能在于感知并响应细胞内的DNA损伤或病毒感染。当细胞内发生DNA损伤或病毒感染时，DNA片段会释放到细胞质中，这些DNA片段被识别并结合于细胞内的cGAS，激活该酶的催化活性，从而促使cGAS合成胞嘧啶二聚化腺苷酸（cGAMP）。cGAMP作为一种次级信号分子，与STING结合，进而引发STING的激活。激活的STING进一步启动下游信号传导途径，导致干扰素和其他炎症介质的释放。这些分子的释放可以激活树突状细胞等免疫细胞，从而引发细胞内或肿瘤微环境中的抗病毒或抗肿瘤免疫反应。cGAS-STING通路在对抗病毒感染和肿瘤发展的免疫监视中发挥着关键作用。因此，深入研究该通路不仅有助于更好地理解免疫系统对病原体感染的应对机制，还为开发针对病毒感染和癌症等疾病的新型免疫治疗方法提供了重要线索。
[0068]光热治疗（PTT）：是一种利用光能和热能来治疗疾病的治疗方法，常用于肿瘤治疗和其他医学应用中。该方法基于光热剂的特性，结合特定波长的光照射，产生热量并对目标组织进行热损伤，以达到治疗的目的。在肿瘤PTT过程中，患者首先接受光热剂的注射或局部应用，光热剂会在肿瘤组织中富集。随后，使用特定波长的激光或光源照射患处，光敏剂吸收光能，转化为热能，导致局部温度升高。这种局部的热效应可以引起目标肿瘤组织的热损伤、凝固、坏死或引发其他治疗效应，如血管闭塞、免疫反应等。这种治疗方法具有局部性强、非侵入性、可重复使用、操作简便等优点。但它也存在一些缺点和局限性：激光穿透深度限制、局部治疗难以应对转移性肿瘤、对正常组织的热损伤、治疗效果不稳定和治疗耗时。
[0069]光动力治疗（PDT）：是一种医学领域被广泛应用的治疗方法，其原理基于光敏剂在特定波长的光照射下被激发，其激发状态下会与氧气发生反应，产生一系列活性氧物质，如自由基和单线态氧，这些活性氧化物具有很强的氧化性，能够对细胞膜和细胞器造成强有力损伤，从而引发肿瘤细胞的凋亡或对其他疾病组织造成破坏。可根据需要和疾病程度选择合适的给药剂量、照射时间和照射强度而定。因此，PDT的优势在于其非侵入性、选择性和高特异性，仅对疾病组织造成损伤，而对正常组织几乎无副作用。与PTT一样，PDT仍受到光敏剂、光穿透深度和激光最大暴露量等的限制，对PDT的进一步研究和改进仍然是热门的研究领域，有望为临床治疗带来更多的突破和进展。
[0070]金属有机框架（MOF）：是一类多孔材料，由金属离子与有机配体通过配位键形成的晶体结构。MOF的特点包括高度有序的结构、可控的孔道大小和高比面积。这些框架在药物传递、多功能性、生物相容性和可控释放等方面显示出巨大的潜力，可以应用到肿瘤治疗的多个方面，包括药物输送、靶向治疗、诊断和监测等有望为肿瘤治疗带来新的突破和进展。
[0071]肿瘤微环境（TME）：是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。在实体肿瘤中，由于肿瘤组织迅速增长，以及高度膨胀及肿瘤组织内部血管系统不完备，这些会导致肿瘤组织内氧气供应不足，肿瘤微环境呈现出整体缺氧的特点。由于氧气供给不足，肿瘤细胞只能够通过无氧酵解的方式进行能量代谢，这会造成乳酸的积累；与此同时，肿瘤细胞膜上的离子交换蛋白也在源源不断的将细胞内部H+运输到细胞外，避免造成自身酸中毒。这些细胞反应也在不同程度上造成肿瘤微环境PH降低，整体呈现酸性环境。在肿瘤发生发展及缺氧，酸性的微环境下，肿瘤组织及外围组织细胞会发生大量凋亡，释放细胞碎片及趋化因子，导致炎症细胞浸润及炎症因子分泌。与此同时，肿瘤本身的发生发展也会引发免疫系统的免疫反应，造成炎症细胞在该区域聚集，引发剧烈的炎症反应。
[0072]活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS）：是一类具有高度活性的氧化性化合物，通常包括超氧阴负离子、羟基自由基、单线态氧、过氧化氢等，在细胞代谢过程中会产生少量的ROS，是生物体内正常的代谢产物。这些ROS具有未配对电子或含有活泼的氧气-氧键表现出较高的反应性，过多的ROS可导致细胞内氧化应激加剧，进而引发细胞损伤和组织炎症，与多种疾病的发生发展密切相关。在癌症治疗中，利用活性氧的细胞毒性，可有效诱导肿瘤细胞凋亡。
[0073]施蒂勒反应，也称Stille偶联反应、Stille偶合反应，是有机锡化合物和不含β-氢的卤代烃在钯催化下发生的交叉偶联反应。反应一般在除水除氧溶剂及惰性环境中进行。等计量的Cu(I)或Mn(II)盐可以提高反应的专一性及反应速率。氧气会使钯催化剂发生氧化，并导致有机锡化合物发生自身偶联。四(三苯基膦)合钯是最常用的钯催化剂，其他催化剂还有：PdCl2(PPh3)2、PdCl2(MeCN)2等。使用的卤代烃一般为乙烯基或芳基三氟甲磺酸酯或氯、溴、碘代烃。
[0074]MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
[0075]在以下的实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0076]实施例1 BN-O的制备，合成路线如图1所示。
[0077]一、N,N-二乙基-4-(三丁基锡基)苯胺的制备，具体制备过程如下：将4-溴-N,N-二乙基苯胺（1.37克，6毫摩尔）溶解在40毫升无水四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）中，在氩气氛下，反应冷却至-78℃，使用干冰-丙酮混合物，保持30分钟，然后加入正丁基锂（n-BuLi）（2.5 M己烷溶液，2.4毫升，6毫摩尔）。在-78℃温度下搅拌2小时后，加入三丁基锡氯化物（1.63毫升，6毫摩尔），使混合物缓慢升温至室温，过夜搅拌，搅拌时间为12～24小时，加入水以淬灭反应，然后用二氯甲烷三次萃取混合物。收集的有机相混合物，使用MgSO4干燥。在减压下去除溶剂后，得到N,N-二乙基-4-(三丁基锡基)苯胺，为无色油状物，无需提纯直接用于下一步反应。
[0078]二、4,4'-(苯并[1,2-c:4,5-c']噻二唑-4,7-二基)双(N,N-二乙基苯胺)（简称BN）的制备，具体制备过程如下：在氩气氛下，将N,N-二乙基-4-(三丁基锡基)苯胺（1.31克，3毫摩尔）、4,7-二溴苯并[1,2-c:4,5-c']噻二唑（0.35克，1毫摩尔）和Pd(PPh3)4（0.35克，0.3毫摩尔）混合，在无水THF（50毫升）中。将混合物加热至回流，连续搅拌24小时。冷却至室温后，加入水，并用二氯甲烷萃取三次混合物。收集的有机相混合，使用MgSO4干燥，浓缩。粗品通过硅胶柱层析色谱法用二氯甲烷/正己烷（v/v 1:2）作为洗脱溶剂纯化，得到4,4'-(苯并[1,2-c:4,5-c']噻二唑-4,7-二基)双(N,N-二乙基苯胺)绿色固体，收率为73%。
[0079]三、BN-O的制备，具体制备过程如下：将200毫克的BN溶解在10毫升乙酸乙酯中，然后将反应混合物置于冰水浴中。缓慢滴加210毫克的对氯过氧苯甲酸（m-CPBA）的乙酸乙酯溶液后，将得到的混合物搅拌4小时。浓缩后，用甲醇作为洗脱剂在硅胶柱上纯化。混合洗脱剂蒸发后，产物被蒸发并重新溶解在二氯甲烷中。布氏漏斗抽滤除去硅胶。减压旋蒸除去有机溶剂，得到紫红色粉末的BN-O，收率为86%。
[0080]如图2所示，13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 152.65, 149.77, 135.00, 132.44,121.94, 77.51, 77.20, 76.88, 67.02, 49.96, 29.65, 8.59。
[0081]如图3所示， HRMS (MALDI-TOF, m/z): [M + H]+calcd. for C26H28N6O2S2,521.1795; found, 521.1792。
实施例2
[0082]纳米诊疗制剂的制备，具体制备过程如下：在室温10～30℃下将10毫克的硝酸锌六水合物和20毫克的CA4P溶解在5毫升去离子水中，然后滴加到含有400毫克2-MI和20毫克BN-O的5毫升去离子水溶液中，同时在磁力搅拌下进行。得到的混合物在搅拌10分钟后，通过离心（5,000 rpm）收集产物，并用去离子水洗涤三次。CA4P和BN-O的包封率分别为22.05%和10.9%。然后，将所得的未覆盖细胞膜的纳米诊疗制剂BC@Z（100 µL）与0.1毫克新鲜提取的M1巨噬细胞膜结合，随后经过超声和通过400 nm聚碳酸酯滤膜的微型挤出仪进行20次重复循环。随后，将聚碳酸酯滤膜更换为孔径为220 nm的滤膜，并连续挤压20次。最后，通过离心（5,000 rpm，15分钟）得到金属有机框架表面覆盖了M1巨噬细胞膜的纳米诊疗制剂BC@Z-M。
[0083]以下实验例所使用的BN和BN-O为实施例1制备的BN和BN-O；以下实验例使用的BC@Z和BC@Z-M为实施例2制备的BC@Z和BC@Z-M。
[0084]在以下实验例中磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）为空白对照组、L为激光辐照组、C@Z为装载有CA4P纳米制剂组、BC@Z为未覆盖细胞膜的纳米诊疗制剂组、BC@Z-M为表面覆盖了巨噬细胞M1的纳米诊疗制剂组、BC@Z+L为BC@Z和L联合处理组、BC@Z-M+L为BC@Z-M和L联合处理组。
[0085]实验例1 光敏剂的合成路线及表征。
[0086]对BN和BN-O进行核磁共振分析，对BN和BN-O的氢/碳原子进行归位分析，结果如图2所示，同时如图3所示，BN和BN-O高分辨率质谱结果也证实准确得到两种分子：BN的质荷比（m/z）=488.1817，质谱结果M+1=489.1890，BN-O的m/z=520.1715，质谱结果M+1=521.1792。
[0087]实验例2 不同光敏剂的光谱性质表征，如图4所示。
[0088]BN和BN-O的光物理性质：在DMSO中，BN-O和BN的最大吸收波长分别为538 nm和770nm；最大发射波长分别为650 nm和1113 nm。
[0089]在730 nm激光器照射下，用热成像仪和DCFH-DA探针，评价了BN和BN-O的升温效果和产ROS的能力，相较于BN-O，BN展现出更强的升温能力和ROS产生能力。
[0090]实验例3 BN-O分子在缺氧条件下光谱转变表征，如图5所示。
[0091]BN-O在缺氧条件下，随缺氧时间的延长，在波长为550 nm处的吸收逐渐下降，在波长为730 nm处的吸收逐渐增强，溶液颜色变化也与BN、BN-O相符合；BN-O的荧光光谱，随缺氧时间的增加，BN-O的荧光逐渐下降；随缺氧时间增加，BN的荧光逐渐增强；BN-O已完全转变为BN。
[0092]实验例4 BC@Z-M在不同干扰离子/物质存在条件下近红外二区荧光信号/光声信号监测，如图6所示。
[0093]无论是金属离子还是氧化还原物质均不能使BC@Z-M的荧光明显开启，而在缺氧条件下荧光得到明显的开启，在光声测试中也得到相类似的结论。
[0094]实验例5 BC@Z-M在不同pH下粒径和形态的变化，如图7所示。
[0095]透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，简称TEM)和动态光散射（Dynamic Light Scattering，简称DLS）测量结果显示，BC@Z-M具有一个平均直径约为134nm的球形结构。
[0096]在pH为6.5的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）溶液中引入BC@Z-M，以模拟肿瘤微环境弱酸条件，测定BC@Z-M的酸响应情况，采用TEM和DLS来研究纳米颗粒（Nanoparticles ，NPs)形态的变化，经过弱酸处理后，BC@Z-M的形态转变为不规则的破碎态，这是表明BC@Z-M发生了降解。
[0097]实验例6 BC@Z-M缺氧条件下的分子转换性质研究，如图8所示。
[0098]在37 ℃缺氧(Hypoxia)条件下，BC@Z-M与在富集细胞色素P450（cytochromeP450，简称CYP450）的大鼠肝微粒体和还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，简称NADPH）共孵育，并在不同时间点对体系的荧光变化进行检测，荧光信号会出现明显的红移，由BN-O的650 nm红移至BN的900 nm左右。这是因为BC@Z-M中BN-O分子发生缺氧响应，使其荧光发射从近红外一区转移至长波长区，部分发光在1000 nm以上。
[0099]对缺氧转变后的纳米体系进行光热和光动力测试，与不经缺氧处理的BC@Z-M相对比，缺氧处理后的BC@Z-M具有明显ROS产生能力，与不经缺氧处理的BC@Z-M相对比，缺氧处理后的BC@Z-M具有明显的光热升温效果。
[0100]实验例7 体外细胞靶向研究，如图9所示。
[0101]通常纳米粒子具有较差的肿瘤靶向能力，部分原因是较差的体内循环，易被吞噬细胞作为外来异物清除，另一方面缺少有效的肿瘤靶向，因此减少了肿瘤聚集，对此本发明探究了纳米粒子的免疫逃逸和肿瘤靶向能力。与BC@Z相比，M1巨噬细胞膜包裹可以极大地提高BC@Z-M的肿瘤靶向能力，BC@Z-M的巨噬细胞摄取量远低于BC@Z，这是由于M1巨噬细胞膜的包裹成功的让巨噬细胞减少了对BC@Z-M的吞噬。
[0102]实验例8 体外细胞缺氧响应研究，如图10所示。
[0103]受分子层面缺氧响应光谱变化启发，随后在细胞层面进行了缺氧响应光谱变化检测，4T1细胞在缺氧条件下与BC@Z-M共孵育3小时后可以见到明显的NIR-I荧光猝灭，点亮的NIR-I荧光，但常氧条件下，NIR-I和NIR-II的荧光强度没有明显变化，比例尺：50 μm。
[0104]实验例9 体外细胞研究，如图11、图12、图13所示。
[0105]当CA4P和BN-O被封装到酸响应性COF载体中时，它们的抗肿瘤作用在常氧条件下减弱，这是由于常氧环境限制了BN-O分子的转变，进而没有高效的开启PDT能力。在缺氧刺激下，BC@Z-M +光照射组表现出相当的产ROS能力，大大提高了肿瘤杀伤能力。此外，随着浓度的升高，BC@Z-M展现出剂量依赖性的杀肿瘤能力。细胞活死染染色结果也表明缺氧条件下BC@Z-M +光照射组可以有效杀伤肿瘤细胞。
[0106]实验例10ICD与cGAS-STING通路诱导表征，如图14、图15、图16所示。
[0107]本发明评估了不同治疗后的4T1肿瘤细胞钙网蛋白（etco-CRT）外翻、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）外排水平和三磷酸腺苷（ATP）的释放水平。作为ICD过程中关键标志，“BC@Z-M+L”组细胞etco-CRT外翻量和HMGB1外排量最高；“BC@Z-M+L”组的细胞ATP释放效率最高，这一结果表明，PTT效应和PDT效应的整合促进了强ICD的发生。此外，对不同处理组的4T1肿瘤细胞提蛋白进行蛋白表达分析发现，cGAS-STING通路的蛋白磷酸化明显上调，说明cGAS-STING通路的成功激活，如图31所示，为抗肿瘤免疫治疗提供了依据。
[0108]实验例11 细胞水平免疫激活研究，如图17、图18、图19所示。
[0109]濒死/死亡的肿瘤细胞可以释放大量死亡相关模式分子或抗原，这些成分均可有效激活DCs，从而激活下游免疫，BC@Z-M杀伤肿瘤细胞后对DCs的激活情况的研究，具体过程如下：提取小鼠原代DCs细胞铺于细胞迁移（transwell）小室下室，然后4T1细胞铺于上室，经过不同治疗干预后，共孵育4T1细胞与DCs细胞，孵育完成后，收集下室DCs细胞，标记DCs成熟标志蛋白，通过流式细胞术监测DCs成熟情况；BC@Z-M +光照射组展现出最高的DCs成熟率，表明BC@Z-M+光照射可以有效杀伤肿瘤细胞并促使DCs成熟；同时BC@Z-M+光照射组表现出最高的IL-6因子水平，展现出强大的抗肿瘤免疫。
[0110]实验例12 肿瘤靶向性验证，如图20、图21、图22所示。
[0111]首先对活体层面BC@Z-M的缺氧转变能力进行了探究，对荷瘤小鼠瘤内注射BC@Z-M的同时，对侧皮下注射同等剂量的BC@Z-M，可以看到随着时间的延长，皮下注射的一侧荧光没有明显转变，而瘤内注射的一侧NIR-I荧光减弱，NIR-II的荧光明显增强。随后，对肿瘤和对侧组织进行冰冻切片，通过共聚焦结果可以发现，与正常组织相比，肿瘤组织中的NIR-II荧光强度更高，免疫荧光染色分析缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）发现，肿瘤组织中具有更多的HIF-1α表达，这与肿瘤组织中NIR-II荧光强于正常组织的结果一致。
[0112]对于4T1荷瘤小鼠尾静脉给药后，在不同时间点小鼠进行荧光和光声成像，从结果可以发现在给药24 h时荧光信号在肿瘤部位最强。同时对小鼠肿瘤区域进行光声成像也得到相同结论，证明BC@Z-M在肿瘤部位有效的积累和缺氧响应。
[0113]实验例13 体内抗肿瘤效果研究，如图23至图31所示。
[0114]分别在第0、3、6天，注射和照射程序重复3次，每隔一天监测一次肿瘤的生长情况和体重。与PBS组相比，C@Z、BC@Z或“BC@Z+L”处理的小鼠均表现出一定程度的肿瘤抑制作用，其中，“BC@Z-M+L”组的肿瘤展现出最为明显的抑制作用。第16天的肿瘤平均体积约PBS（1222 mm3）、L（1149 mm3）、C@Z（754 mm3）、BC@Z（746 mm3）、“BC@Z+L”（460 mm3）组分别是“BC@Z-M+L”（123 mm3）组的9.9、9.3、6.1、6.1和3.7倍。此外，在第16天收获的分离肿瘤的重量证实了“BC@Z-M+L”治疗与其他干预措施相比具有优越的抗肿瘤效率。这些结果表明，BC@Z-M协同传递和靶向释放CA4P和BN-O可显著提高小鼠存活率。
[0115]对肿瘤组织进行免疫荧光染色发现血管破坏剂结合PDT/PTT治疗可以有效抑制瘤内新生血管的生长。对各组小鼠肺/肝组织进行病理染色分析，发现“BC@Z+L”组可以有效抑制癌细胞的肝/肺转移。采用流式细胞术对肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤浸润的细胞毒性T细胞进行分析，发现“BC@Z+L”组可以有效的促进抗肿瘤的M1型巨噬细胞（CD80+86+）的极化和杀伤性T细胞（CD3+4+8+）的肿瘤浸润，从而发挥出色的抗肿瘤效果，其中， G1为 PBS组， G2为PBS + L组， G3为C@Z组， G4为BC@Z组， G5为 BC@Z + L组， G6为 BC@Z-M + L组。
[0116]实验例14 双侧瘤抗肿瘤效果评估，如图32至图35所示。
[0117]小鼠双侧瘤模型的建立，在该模型中，在第0天将4T1肿瘤细胞植入雌性BALB/c小鼠的右侧。接种原发肿瘤6天后，将等量的肿瘤细胞植入左侧，以模拟远处肿瘤的存在。体内肿瘤治疗是通过在第7天全身给药不同的制剂，然后在注射后24小时对原发肿瘤进行局部光照射。分别在第10、13天重复治疗。每两天仔细监测一次两侧肿瘤的进展情况，以评估治疗效果，评估结果显示，PBS治疗组的原发性肿瘤和远端肿瘤的生长均不受控制，“PBS+L”治疗对原发肿瘤和远端肿瘤均有较弱的抑制作用，可能是由于缺少光敏剂分子的存在，使得单纯激光照射对肿瘤生长起不到抑制作用，通过“BC@Z-M+L”治疗后，原发肿瘤和远端肿瘤的生长均明显延迟，导致显著的抑制率分别为81%和85%。第22天，“BC@Z-M+L”组的远处肿瘤平均重量为0.09 g，PBS组肿瘤平均重量为0.556g，BC@Z-M+L组肿瘤重量远远小于PBS组肿瘤重量。此外，通过对原位瘤和远端瘤内的免疫细胞浸润情况分析发现，“BC@Z-M+L”组小鼠原位瘤和远端瘤内的细胞毒性T细胞分别是PBS治疗组的2.2倍和2倍，结果表明“BC@Z-M+L”组具有强有力募集免疫细胞的能力，进而发挥出色的抗肿瘤免疫作用。
[0118]实验例15 生物安全性研究，如图36和图37所示。
[0119]PBS与BC@Z-M静脉注射组的小鼠心、肝、脾、肺、肾进行石蜡切片，并进行病理染色，从结果可以看出BC@Z-M处理的小鼠没有明显的器官损伤，比例尺：100 μm。此外血常规和血生化分析结果也显示BC@Z-M处理组小鼠没有出现任何异常，证明了BC@Z-M纳米诊疗制剂的安全性。
[0120]最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。