1.一种对单核细胞增生李斯特菌及其4个主要致病性血清型分别特异的Taqman引物，其特征是：
（1）从单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因中选取的2段DNA片段，命名为P1-P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2所示；
（2）从单核细胞增生李斯特菌4b型、1/2a型、1/2b型和1/2c型的gttA、lmo0701、A409_0759和lmo1118基因中分别选取的2段DNA片段，命名为P3-P10，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:10所示。
2.一种对单核细胞增生李斯特菌及其4个主要致病性血清型分别特异的Taqman探针，其特征是位于权利要求1中2个DNA片段的内部，且不同的探针在各自的5'端和3'端分别含有不同的荧光报告基团和荧光猝灭基团，命名为T1-T5，核苷酸序列如SEQ ID NO:11-SEQID NO:15所示。
3.一种含有权利要求1和2所述的特异性Taqman引物和探针的实时荧光PCR体系，该体系的组成成分如下：
。
4.一种权利要求1或2所述的对单核细胞增生李斯特菌及其4个主要致病性血清型分别特异的Taqman引物和探针用于实时荧光PCR检测体系方面的应用。

技术领域
[0001]本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于单核细胞增生李斯特菌主要致病性血清型的实时荧光PCR检测方法及应用。
背景技术
[0002]单核细胞增生李斯特菌与沙门氏菌、大肠杆菌O157和空肠弯曲菌并成为世界范围内的四大食源性致病菌，主要以食品为传染媒介，肉类、禽类、蛋类、水产品、奶粉及奶制品、以及蔬菜水果等都被证实是单核细胞增生李斯特菌的感染源。在美国，该菌每年导致约2500发病，500人死亡；此外，在瑞典、法国、澳大利亚，每年也有由单核细胞增生李斯特菌感染导致的食品中毒病例被报道。事实上，我国尚缺少系统的李斯特菌流行病学统计资料，以致报道的李斯特菌病例数量相对较少，因此其危害程度实际上远未能得到真实反映。由于单核细胞增生李斯特菌可污染几乎所有种类的食物，因而，各个食品加工企业及各国食品监管部门对于该菌的监测都很重视。
[0003]当前，最常用的单核细胞增生李斯特菌的表型分型技术是血清分型。单核细胞增生李斯特菌可分为13个血清型，其中，1/2a、1/2b、1/2c和4b为最主要的4个血清型，其分离率可占到食品和病人样品的95%以上。根据基因组进化比对分析结果，该菌可以分为4个谱系。其中，血清型1/2b和4b的菌株位于谱系I，血清型1/2a和1/2c的菌株位于谱系II。作为经典的分型方法，虽然基于凝集反应的血清分型被广泛应用，但也存在一些短板。例如，检测时间较长，以我国现行的出入境检验检疫行业标准《单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法》（SN/T 2521-2010）为例，从获得待测菌株至判读血清型鉴定结果，至少需要2天时间，且实验操作繁琐；此外，用于检测的抗血清依赖进口、价格昂贵。
[0004]与基于凝集反应的血清分型方法相对应，近年来，一些基于分子生物学手段的检测方法被相继开发。例如，当前国际上广为接受的多重PCR检测方法，可利用多重PCR手段，实现对单核细胞增生李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c和4b为最主要的4个血清型的分组检测，即由于基因相似性的原因，虽然无法对上述4个血清型进行个别区分，但仍可通过不同分组，实现对上述4个血清型所在组别的检测和区分（J Clin Microbiol. 2004, 3819-3822.）。2020年，一种基于多重荧光PCR的技术手段，也被国际同行所报道用于单核细胞增生李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c和4b型菌株的检测（Food Microbiol. 2020, 103367.）。然而，2023年的一项研究报道，由于上述体系中使用的靶基因lmo0737（检测血清型1/2a与1/2c）和ORF2110（检测血清型4b）有可能在相应血清型的菌株中存在丢失或在其他血清型菌株中存在从外源获得现象，会导致分子生物学检测结果与凝集反应检测结果不一致，即分子生物学检测结果出现错误（Microbiol Spectr. 2023, e0274522.）。
[0005]需要说明的是，目前国际上利用分子生物学方法，对于单核细胞增生李斯特菌4个主要致病性血清型的检测，只能检测至本发明中表2所示的各自血清型的分组水平，而无法精确区分组内的血清型。考虑到4b型、1/2a型、1/2b型和1/2c型菌株的分离率可占到食品样品和病人样品来源菌株的95%以上，所以，对于4b组、1/2a组、1/2b组和1/2c组菌株的成功检测，即默认为该菌株为相应的4b型、1/2a型、1/2b型或和1/2c型。
[0006]Taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5' 末端携带荧光基团， 3' 端携带淬灭基团。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。在PCR扩增过程总，荧光信号开始由本底指数增长阶段的拐点所对应的循环次数为Ct值。通常，Ct值<26 且出现S型扩增曲线，则判断样品为阳性，否则为阴性。
发明内容
[0007]本发明的目的在于提供一种单核细胞增生李斯特菌及其主要致病性血清型实时荧光PCR检测技术，为该菌主要致病性血清型的快速检测提供可靠、有效的技术手段。
[0008]本发明涉及一种对单核细胞增生李斯特菌检测的通用Taqman引物和探针、对4种不同血清型分别特异的Taqman引物和探针，以及实时荧光PCR检测方法。其中：
所述的Taqman引物序列包括：
（1）单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因中选取的2段DNA片段，如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2所示；
（2）单核细胞增生李斯特菌4b型、1/2a型、1/2b型和1/2c型的gttA、lmo0701、A409_0759和lmo1118基因中分别选取的2段DNA片段，如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:10所示。
[0009]上述SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列如下：
SEQ ID (5'-3')
NO:1 GCGCAATCAGTGAAGGGAAA 扩增单核细胞增生李斯特菌hlyA基因的上游引物P1
NO:2 TAAACTTGACGGCCATACGC 扩增单核细胞增生李斯特菌hlyA基因的下游引物P2
NO:3 CAGTGTTGCACCCATTCGAT 扩增单核细胞增生李斯特菌4b型gttA基因的上游引物P3
NO:4 CCGCCAATTAACCACAAGGA 扩增单核细胞增生李斯特菌4b型gttA基因的下游引物P4
NO:5 ACTGAATGGAAGGGAAGCCT 扩增单核细胞增生李斯特菌1/2a型lmo0701基因的上游引物P5
NO:6 CGCGGACAAGCATGTATTGA 扩增单核细胞增生李斯特菌1/2a型lmo0701基因的下游引物P6
NO:7 GCATTTGCAGCAGATCCTGA 扩增单核细胞增生李斯特菌1/2b型A409_0759基因的上游引物P7
NO:8 ACTCCCGTCCAAATCCCAAT扩增单核细胞增生李斯特菌1/2b型A409_0759基因的下游引物P8
NO:9 TAAGTATGCCGAACAAGCCG 扩增单核细胞增生李斯特菌1/2c型lmo1118基因的上游引物P9
NO:10 CAATTGCTTCAACGATAGATTTAAC 扩增单核细胞增生李斯特菌1/2c型lmo1118基因的下游引物P10。
[0010]所述的Taqman探针是从单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因，以及4b型、1/2a型、1/2b型和1/2c型的gttA、lmo0701、A409_0759和lmo1118基因中分别选取，且在相对应的2条Taqman引物内部筛选得到的，各自的5'端和3'端分别含有不同的荧光报告基团和荧光猝灭基团，其序列如SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:15所示。
[0011]SEQ ID (5'-3')
NO: 11 ACTCCAAGCGCTTGCAACTGCT 用于检测单核细胞增生李斯特菌的探针T1，5'端的荧光报告基团为HEX，3'端的荧光猝灭基团为BHQ-1
NO: 12 TGTCCAACCAGGTACAACAGCACCA 用于检测单核细胞增生李斯特菌4b型的探针T2，5'端的荧光报告基团为Cy5，3'端的荧光猝灭基团为BHQ-2
NO: 13 CGCCGGATAGCTCTGTCGTTAAAGCC 用于检测单核细胞增生李斯特菌1/2a型的探针T3， 5'端的荧光报告基团为ROX，3'端的荧光猝灭基团为BHQ-2
NO: 14 ACATGCTGTTCGCCTTCAAGCGA 用于检测单核细胞增生李斯特菌1/2b型的探针T4，5'端的荧光报告基团为FAM，3'端的荧光猝灭基团为BHQ-1
NO: 15 ATCAGGAATATGATTTTGAGAATGAACC 用于检测单核细胞增生李斯特菌1/2c型的探针T5，5'端的荧光报告基团为NED，3'端的荧光猝灭基团为QSY
本发明进一步公开了用于检测单核细胞增生李斯特菌及其主要致病性血清型的实时荧光PCR检测体系，其组成成分和浓度如下表1所示：

[0012]不同型别单核细胞增生李斯特菌对应的靶基因、Taqman引物和探针编号、在实时荧光PCR仪器中的设定的荧光通道，以及扩增曲线Ct值是否应小于26如下表2所示：

[0013]本发明进一步公开了用于检测单核细胞增生李斯特菌4b型、1/2a型、1/2b型和1/2c型共4个主要致病性血清型的特异Taqman引物和探针用于实时荧光PCR检测体系方面的应用。实验结果显示：该实时荧光PCR体系能够准确检测出上述4个血清型的单核细胞增生李斯特菌，具有检测速度快和检测准确性高的优点。
[0014]本发明主要解决了利用分子生物方法，对单核细胞增生李斯特菌这一重要食源性致病菌的主要致病性血清型快速、准确检测的问题，对该菌临床检测和流行病学监测具有重要意义；重点考察了单核细胞增生李斯特菌4个主要致病性血清型的实时荧光PCR体系的检测效果，主要难点在于血清型特异Taqman引物和探针的获得以及多重PCR检测体系的建立。
[0015]需要说明的是，目前国际上利用分子生物学方法，对于单核细胞增生李斯特菌4个主要致病性血清型的检测，只能检测至表2所示的各自血清型的分组水平，而无法精确区分组内的血清型。这是因为，4b型、1/2a型、1/2b型和1/2c型菌株的分离率可占到食品样品和病人样品来源菌株的95%以上，所以，对于4b组、1/2a组、1/2b组和1/2c组菌株的成功检测，即默认为该菌株为相应的4b型、1/2a型、1/2b型或和1/2c型。而本发明也遵循上述原则。
[0016]当前国际上广为接受的多重PCR检测方法（J Clin Microbiol. 2004, 3819-3822.），可实现对单核细胞增生李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c和4b为最主要的4个血清型的分组检测。2020年，一种基于实时荧光PCR的技术手段（Food Microbiol. 2020, 103367.），也被国际同行所报道用于单核细胞增生李斯特菌1/2a、1/2b、1/2c和4b型菌株的检测。然而，2023年的一项研究报道（Microbiol Spectr. 2023, e0274522.）中指出，在本发明之前公开的技术（包括上述2项技术）的靶基因lmo0737（检测血清型1/2a与1/2c）和ORF2110（检测血清型4b），由于有可能在相应血清型的菌株中存在丢失或在其他血清型菌株中存在从外源获得现象，会导致分子生物学检测结果与凝集反应检测结果不一致，即分子生物学检测结果出现错误。由于上述报道中使用的菌株来源于国外的临床分离菌，本发明无法获得。然而，本发明获得了上述菌株的基因组序列，通过利用本发明中的特异性Taqman引物和探针与这些基因组进行比证明，本发明的多重PCR检测体系对于上述报道中应用的菌株的鉴定结果，与全基因组测序鉴定或血清凝集反应结果完全一致，即可以完全进行正确的血清型鉴定，准确率100%。具体比对结果可见如下表3所示。
[0017]
[0018]
[0019]本发明公开的用于单核细胞增生李斯特菌4个主要致病性血清型检测的实时荧光PCR体系所具有的积极效果在于：
（1）通过面向新的靶基因进行引物和探针设计，克服了已有技术由于目标靶基因设计缺陷导致的检测结果错误，实现了单核细胞增生李斯特菌4个主要致病性血清型的准确检测。
[0020]（2）缩短了检测时间：利用该实时荧光PCR检测体系，自获得基因组DNA或纯培养菌落计，可在3个小时内完成检测。相比基于凝集反应的血清型检测技术，缩短检测时间近2天。
附图说明
[0021]图1为本发明中4种主要致病性血清型单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR体系扩增曲线展示，其中A是单核细胞增生李斯特菌CMCC 54007（4b型），B是单核细胞增生李斯特菌CMCC 54001（1/2a型），C是单核细胞增生李斯特菌NCTC 10887（1/2b型），D是单核细胞增生李斯特菌ATCC 19112（1/2c型）；
图2为本发明实时荧光PCR体系对其他血清型单核细胞增生李斯特菌检测后扩增曲线展示，其中A是单核细胞增生李斯特菌ATCC 19113（3a型），B是单核细胞增生李斯特菌ATCC 19114（4a型），C是单核细胞增生李斯特菌NCTC 4883（4c型），D是单核细胞增生李斯特菌ATCC 19117（4d型），E是单核细胞增生李斯特菌NCTC 10890（7型）；
图3为本发明实时荧光PCR体系对其他李斯特菌检测后扩增曲线展示，其中A是格氏李斯特菌（ATCC 19120），B是无害李斯特菌（ATCC 33090），C是威氏李斯特菌（ATCC35897），D是斯氏李斯特菌（ATCC 35967），E是伊氏李斯特菌（ATCC BAA-678）。
具体实施方式
[0022]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
[0023]所述的单核细胞增生李斯特菌及其近缘菌株的来源如表4所示：
表4 用于Taqman引物和探针特异性检测的菌株

[0024]实施例1
[0025]1、特异基因的筛选
选择单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因、4b血清型的gttA基因、1/2a血清型的lmo0701基因、1/2b血清型的A409_0759基因、以及1/2c血清型的lmo1118基因作为特异基因，进行引物设计。
[0026]2、引物的设计和制备
将选取的单核细胞增生李斯特菌通用检测基因和各个血清型的特异基因序列分别导入在线设计软件中（https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool），选择默认参数。运行程序，得到针对每个输入基因序列的正义链、反义链引物和对应的探针序列。
[0027]引物、探针序列及其修饰基团如SEQ NO:1至SEQ NO:15所示。
[0028]将设计好的引物和探针序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行DNA合成，利用去离子水溶解后备用。
实施例
[0029]如采取完全的基因组DNA的提取方案，则按照下述步骤进行处理：
（1）将单核细胞增生李斯特菌接种至5毫升经高压灭菌处理（121度，15分钟）脑心浸出液培养基中（BHI培养基），37℃，180转/分钟的摇床中过夜培养，收集菌体。
[0030]（2）利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（产品号DP302），按照其操作步骤进行细菌基因组DNA的提取，取0.5微升基因组DNA作为下一步实时荧光PCR反应的模板。
[0031]如采取从纯培养细菌中粗提基因组DNA的方案，则按照下述步骤进行处理：
（1）挑取细菌单菌落至1毫升去离子水中，或过夜培养的细菌菌液1毫升，离心收集菌体，去掉上清液后，溶解于100微升细菌裂解液中（20毫摩尔Tris-HCl，2毫摩尔EDTA,1.2% TritonX-100），沸水浴中处理10 min。
[0032]（2）置于冰上1 min后，8000转/分钟离心1 min。
[0033]（3）吸取5微升上清液作为下一步实时荧光PCR反应的DNA模板。
[0034]如采取从食品样品中粗提DNA的方案，采用以下方式进行处理：
（1）取固体或半固体食品样品2克，或液体食品样品5毫升，将样品置于20 毫升BHI培养基中，37度，180转/分钟震荡培养12小时。
[0035]（2）取1 毫升（1）中的培养物，8000 转/分钟离心5min，弃去上清。
[0036]（3）加入1毫升去离子水，重悬混匀，8000转/分钟离心5min，弃去上清。
[0037]（4）100微升细菌裂解液中（20毫摩尔Tris-HCl，2毫摩尔EDTA, 1.2% TritonX-100），沸水浴中处理10 min。
[0038]（5）置于冰上1 min后，8000转/分钟离心1 min。
[0039]（6）吸取5微升上清液作为下一步实时荧光PCR反应的DNA模板。
实施例
[0040]以实施例2提取的核酸溶液作为实时荧光PCR反应的模板，分别加入第1组和第2组实时荧光PCR反应体系，置于实时荧光定量基因扩增仪（本实施例选择美国ABI公司的QuantStudio5 Q5实时荧光定量PCR仪），按如下条件进行反应。
[0041]反应条件：

[0042]检测结果中，某个体系的CT值小于26，则判断样品中含有该体系对应血清型的单核细胞增生李斯特菌。
[0043]实验结果显示，本发明提供的技术准确性和特异性良好，对于表4中菌株的检测结果如下表5所示：

[0044]实施例5
[0045]（1）收集了34株单核细胞增生李斯特菌的食品样品分离株。
[0046]（2）按照实施例2的步骤，提取每株细菌的基因组DNA。
[0047]（3）加入0.5微升基因组DNA至实时荧光PCR检测体系，混合后，按照实施例3中的反应条件进行反应。
[0048]（4）实时荧光PCR检测结果显示，在34株菌中，1/2a型有10株，1/2b型有3株，1/2c型有15株，4b型有6株。上述检测结果与血清凝集检测结果完全一致。