1.一种相转变纳米粒子的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)将染料、显色剂、相转变材料、空心介孔载体和有机溶剂混匀，抽真空脱气，超声，配成分散液A；
2)将分散液A离心，弃去上清液，将沉淀分散到水和有机溶剂的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为10％-90％，在搅拌或超声下，滴加到水中；
3)离心，弃去上清液，水洗，重悬在质量含量为0.5％-10％的氯化钠水溶液或pH为7.4-7.6的PBS缓冲液或水中；
所述染料、显色剂、相转变材料、空心介孔载体和有机溶剂的质量比为0.1-50：0.1-50：100：100-1000：500-2000；
所述染料为简称为SL的3,5',6-tris(dimethylamino)-3'H-spiro[fluorene-9,1'-isobenzofuran]-3'-one，热敏黑TF-BL-1,热敏黑OB-2或热敏绿TFG；
所述显色剂为萘酚、双酚A、双酚S、双酚AF或没食子酸乙酯；
所述相转变材料为月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸、十二醇、十四醇、十六醇、十八醇、二十醇或二十二醇；
所述空心介孔载体为空心介孔有机硅纳米粒子、空心介孔二氧化硅纳米粒子或空心介孔羟基磷灰石纳米粒子。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征是所述有机溶剂为甲醇，乙醇，四氢呋喃，二甲基亚砜，N，N-二甲基甲酰胺或乙酸乙酯。
3.权利要求1或2的制备方法制备的一种相转变纳米粒子。
4.权利要求3的一种相转变纳米粒子在制备光热转化过程中温度控制药物中的应用。
5.权利要求3的一种相转变纳米粒子制备光热治疗药物中的应用。

技术领域
[0001]本发明属于医药制备领域，涉及一种相转变纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]细菌感染已对人类健康构成严重威胁，尤其是在滥用和过度使用抗生素导致耐药菌出现后。为了对抗耐药菌，多种不依赖抗生素的抗菌策略陆续被报道的，其中光热疗法(PTT)具有无创性、时空可控性、广谱抗菌活性、耐药率低等优点。它是依靠光热剂在近红外(NIR)照射下局部产生的热量，通过不可逆的蛋白质变性和/或细菌膜破坏来灭活细菌。然而，传统的光热系统缺乏内在的温度控制机制，并且不受控制的热量产生通常会给健康的组织和/或器官带来严重的热损伤。虽然一系列外部经验的变化基本参数(例如，激光功率、光热剂浓度和环境温度)可以部分调节平衡温度，当温度达到预设阈值时，提供内在的截止机制仍然具有挑战性。此外，由于病变组织中物质积累和光穿透的异质性，局部温度通常分布不均匀，极大地影响了整体治疗效果。因此，迫切需要开发一种具有内在温度控制机制的智能光热系统，用于细菌感染的恒温治疗。
[0003]构建具有内在温度控制机制的智能光热系统的前提是寻找一种吸光能力可以随外界温度可逆变化的智能材料，而基于相转变材料(PCM)的热致变色系统可以完美地满足这一需求。通常，热致变色材料由PCM(例如石蜡、脂肪醇、脂肪酸、脂肪酸烷基酯和烷基苯酮)、质子响应性隐色染料和无色质子供体(也称为显影剂)的三元混合物组成，其中PCM作为热敏基质来调节隐色染料在开环有色状态(在固体PCM中)和闭环无色状态(在熔融PCM中)之间的化学转化，在大多数情况下，热致变色材料被封装在不透水的聚合物壁中，用于一系列工业应用，例如热敏纸、产品标签、防伪墨水和安全警告。但是，大多数商业隐色染料的吸收位于相对较短的波长区域(<700nm)，因此，它们无法提供深层组织穿透和有效的光热转换。更重要的是，对于工业应用，PCM的生物相容性和无色染料的吸收曲线并不是他们的主要考虑因素。因此，大多数报道的热致变色材料几乎不适合生物医学用途。近年来，天然存在的饱和脂肪酸与饱和脂肪醇由于其成本低、结构明确、熔点高、固-液相转变可逆、生物相容性和生物降解性等优点，然而，饱和脂肪酸的高结晶度使其难以配制成具有不受影响的理化性质的稳定纳米粒子，常规使用的纳米粒子制备方法往往涉及使用较大量的表面活性剂，而表面活性剂的大量使用对相转变材料其原有的理化性质产生严重干扰，结晶性显著降低，影响到相转变纳米粒子相转变的特性，极大地限制了相转变纳米粒子的应用。
发明内容
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种相转变纳米粒子。
[0005]本发明的第二个目的是提供一种相转变纳米粒子的制备方法。
[0006]本发明的第三个目的是提供一种相转变纳米粒子在制备光热转化过程中温度控制药物中的应用。
[0007]本发明的第四个目的是提供一种相转变纳米粒子在制备光热治疗药物中的应用。
[0008]本发明的技术方案概述如下：
[0009]一种相转变纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0010]1)将染料、显色剂、相转变材料、空心介孔载体和有机溶剂混匀，抽真空脱气，超声，配成分散液A；
[0011]2)将分散液A离心，弃去上清液，将沉淀分散到水和有机溶剂的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为10％-90％，在搅拌或超声下，滴加到水中；
[0012]3)离心，弃去上清液，水洗，重悬在质量含量为0.5％-10％的氯化钠水溶液或pH为7.4-7.6的PBS缓冲液或水中。
[0013]所述染料、显色剂、相转变材料、空心介孔载体和有机溶剂的质量比为0.1-50：0.1-50：100：100-1000：500-2000。
[0014]优选地：染料为简称为SL的3,5',6-tris(dimethylamino)-3'H-spiro[fluorene-9,1'-isobenzofuran]-3'-one，热敏黑TF-BL-1,热敏黑OB-2或热敏绿TFG。
[0015]优选地：显色剂为萘酚、双酚A、双酚S、双酚AF或没食子酸乙酯。
[0016]优选地：相转变材料为月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸、十二醇、十四醇、十六醇、十八醇、二十醇或二十二醇。
[0017]优选地：空心介孔载体为空心介孔有机硅纳米粒子、空心介孔二氧化硅纳米粒子或空心介孔羟基磷灰石纳米粒子；
[0018]优选地：有机溶剂为甲醇，乙醇，四氢呋喃，二甲基亚砜，N，N-二甲基甲酰胺或乙酸乙酯。
[0019]上述制备方法制备的一种相转变纳米粒子。
[0020]上述一种相转变纳米粒子在制备光热转化过程中温度控制药物中的应用。
[0021]上述一种相转变纳米粒子制备光热治疗药物中的应用。
[0022]有益效果：
[0023](1)本发明的一种相转变纳米粒子可以避免常规纳米粒子制备过程使用大量表面活性剂干扰相转变性质的缺点，有效保存相转变材料原有的理化性质。
[0024](2)本发明的一种相转变纳米粒子可以实现光热控制过程不受环境温度、材料浓度、或是光功率密度的实验参数影响的温度控制。
[0025](3)实验证明，本发明的一种相转变纳米粒子在光热转化过程中温度控制，具有极好的有效性与安全性。在小鼠模型上实现了恒温光热治疗，升温过程可控，未出现温度飙升的情况，同时实现了病原体的有效杀伤与连带热损伤的有效避免。
附图说明
[0026]图1是实施例2制备的相转变纳米粒子(简称TCSN)的性质表征，包括基本形貌、粒径与光热性能表征；
[0027](A)TCSN的透射电镜照片；
[0028](B)TCSN的粒径分布情况(动态光散射)；
[0029](C)TCSN在不同强度的近红外光下的升温曲线；
[0030](D)TCSN在不同环境温度下近红外光下的升温曲线；
[0031](E)不同浓度TCSN在近红外光下的升温曲线；
[0032](F)分别用月桂酸LA、软脂酸PA、硬脂酸SA替代实施例2中的肉豆蔻酸，其它同
[0033]实施例2制备的相转变纳米粒子近红外光下的升温曲线；
[0034](G)TCSN与吲哚菁绿(ICG)在近红外光下的光热循环曲线；
[0035](H)TCSN在近红外光下光热升温过程中的温度分布；
[0036](I)ICG在近红外光下光热升温过程中的温度分布。
[0037]图2是实施例2制备的相转变纳米粒子在光热杀伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)方面性能的表征。
[0038](A),(B)是不同条件下光热治疗对MRSA活力影响及其数据输出；
[0039](C)是不同条件下的光热治疗对MRSA杀伤情况的活/死细菌染色照片；
[0040](D)是不同条件下的光热治疗对于MRSA表面形貌的影响。
[0041]图3是实施例2制备的相转变纳米粒子用于伤口感染MRSA的小鼠光热治疗的表征，其中：
[0042](A)是实验的时间线；
[0043](B)是治疗过程中每组小鼠体表温度的监测照片；
[0044](C)是治疗过程中每组小鼠体表最高温度的温度变化曲线；
[0045](D)是治疗过后各组小鼠伤口的面积变化照片；
[0046](E)是治疗过后各组小鼠伤口面积相对变化情况；
[0047](F)是第2天、第10天小鼠伤口样本中的菌落平板照片；
[0048](G)是第2天、第10天小鼠伤口样本中的菌落平板计数情况；
[0049](H)是小鼠存活率变化情况。
[0050]图4为TCSN与ICG在治疗小鼠伤口感染后小鼠伤口的病理切片照片，其中：
[0051](A)是第2天各组小鼠伤口的病理切片；
[0052](B)是第10天各组小鼠伤口的病理切片。
[0053]其中箭头颜色由深到浅，分别代表毛囊、热损伤、感染区域。
具体实施方式
[0054]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0055]各实施例中：
[0056]空心介孔有机硅纳米粒子，空心介孔二氧化硅纳米粒子，空心介孔羟基磷灰石纳米粒子为参考对应文献合成:
[0057]空心介孔有机硅纳米粒子Nat.Commun.2019，10,1241.
[0058]空心介孔二氧化硅纳米粒子Chem.Mater.2010,22,2693.
[0059]空心介孔羟基磷灰石纳米粒子J.Mater.Chem.B,2013,1,2447.
[0060]实施例1SL(3,5',6-tris(dimethylamino)-3'H-spiro[fluorene-9,1'-isobenzofuran]-3'-one)的制备
[0061]将尿素(2.5克)与氯化铝(10.0克)和六水氯化铝(0.25克)一起加入坩埚中，然后在125℃下搅拌，形成离子液体，加入结晶紫内酯(2.0克)，在140℃下搅拌24小时，冷却到环境温度后，将坩埚中的固体混合物倒入冷水(400毫升)，得到灰绿色的悬浮液，加入过氧化氢(30％，1.2毫升)，搅拌1.5小时。用二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，并在减压下浓缩。将得到的灰绿色固体溶于热甲苯(110℃)中，并通过活性炭脱色。过滤后，从热滤液中重新结晶出浅黄色的固体。粗制的产品从乙酸乙酯中经过重结晶，得到目标产品的白色晶体。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.19(d,J＝2.5Hz,1H),6.99(d,J＝2.4Hz,2H),6.89–6.76(m,4H),6.51(dd,J＝8.4,2.4Hz,2H),3.03(s,12H),3.01(s,6H).13C-NMR(100MHz,CDCl3):δ172.1,152.2,151.4,142.4,138.8,131.7,127.7,124.8,122.6,119.3,111.9,106.5,103.6,92.6,40.9,40.8.HRMS(ESI,m/z,C26H28N3O2+,[M+H]+):理论分子量：414.2176；测得分子量：414.2175.
[0062]实施例2一种相转变纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0063]1)将染料(SL)、显色剂(双酚A)、相转变材料(肉豆蔻酸，MA)、空心介孔载体(空心介孔有机硅纳米粒子)和有机溶剂(乙醇)按照质量比为25：50：100：200：500混匀，抽真空脱气5分钟，超声1小时后，配成分散液A；
[0064]2)将分散液A以13000rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀分散到水和乙醇的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为50％，在超声下，滴加到5毫升水中；
[0065]3)10000rpm离心10分钟，弃去上清液，水洗，重悬在10毫升pH为7.4的PBS缓冲液中得到相转变纳米粒子。
[0066]实施例2的相转变纳米粒子(简称TCSN)如图1所示。相转变纳米粒子具有核壳结构，其中相转变材料为内核，装载到空心介孔有机硅纳米粒子中。透射电子显微镜显示TCSN呈球形结构(图1A)，动态光散射测量显示TCSN的粒径分布在100-400nm之间(图1B)。TCSN在不同光功率密度(图1C)、不同环境温度下(图1D)、不同浓度下(图1E)光热升温情况(TCSN的浓度以SL的浓度计算，其中SL的浓度通过标准曲线以紫外-可见光度计确定)。
[0067]实验表明，TCSN保持相转变材料的基本性质，TCSN恒温光热能力不受上述外界因素影响，均可产生温度恒定在49℃左右的恒温光热效果，而此温度与肉豆蔻酸(简称为MA)的熔点接近。与传统的光热试剂吲哚菁绿(ICG)相比，具有更好的光稳定性，在经历过的5个光热循环中始终可以稳定在相同的温度下(图1G)。ICG与相转变纳米粒子在产生光热的过程中各深度的温度分布情况(图1H,图1I)可以看到，相转变纳米粒子(图1H)在光热过程中温度的时空分布都比较均匀；而ICG(图1I)在升温过程中温度集中在小的时空范围内，说明其主要在较小的范围内有温度飙升，升温的过程不受控制，其光热的稳定性也不足，当较深的区域温度升高时，最先接触近红外激光的浅层已经逐渐失去光热转换的能力。
[0068]分别用月桂酸LA、软脂酸PA、硬脂酸SA分别替代实施例2中的肉豆蔻酸，其它同实施例2。测试了使用不同相转变材料(月桂酸LA，熔点42℃；软脂酸PA，熔点61℃；硬脂酸SA，熔点66℃)制备的相转变纳米粒子。
[0069]实验证明，恒温的温度可以通过使用具有不同熔点的相转变材料即可(图1F)。综上，TCSN具有不受外界实验参数的影响，单纯由制备使用的相转变材料调控的恒温光热能力。此外，实验证明，将显色剂、空心介孔载体更改后，制备的相应的相转变纳米粒子也分别保持了其相对应体相转别材料的性质，可以实现智能调控的光热过程。本发明的相转变纳米粒子作为一种具有内在温度控制机制的智能光热纳米系统，可用于实现智能控温的光热转换。
[0070]在相转变纳米粒子中，具有明确熔点的相转变材料(PCM，肉豆蔻酸)用作热敏基质以适应SL和显色剂(双酚A)；SL用作隐色染料，提供可逆的结构转变和高效的光热转换；显色剂作为隐色染料的质子供体。在固体PCM中，SL通过接收来自显色剂的质子形成SL-H+，从而采用NIR吸收着色状态。在NIR照射下，SL-H+的光热效应迅速提高了系统温度并导致PCM熔化。在液态PCM中，SL-H+通过失去一个质子转化为NIR透明无色状态(即SL)。在这种情况下，立即停止发热，使系统在PCM熔点附近的温度下动态平衡。值得注意的是，这种热平衡过程仅与热致变色材料的固有特性相关，而与外部实验参数无关，成为一类新型的用于恒温光热治疗、防止光热治疗连带损伤的智能光热材料。
[0071]随后，我们对于TCSN在光热杀菌领域的应用进行了测试(图2)。首先，我们按照空白组(PBS)、无SL的TCSN组(TCSN(-SL))，ICG组与TCSN组，分别在有无近红外光情况下考察了不同条件下对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的杀伤能力。在无光照的四组中，细菌的活力没有受到影响。空白组与无SL的TCSN组在光照下也未对细菌产生明显影响。然而，在ICG或TCSN光照的组中，均可以观察到显著的细菌杀伤效果，两组分别可杀伤99.9999％与99.99％的MRSA(图2A，B)。随后的活/死细菌染色实验(图2C)表明，仅ICG+激光与TCSN+激光条件下可以实现有效的光热杀菌。通过活/死细菌染色法，我们可以直观看到，TCSN与细菌的活力无明显影响，TCSN与ICG均可在近红外光的辐照下，有效地杀死MRSA。通过扫描电子显微镜(图2D)，我们可以看到ICG与TCSN在激光辐照下对MRSA的形貌产生了一定影响，而这也是导致细菌死亡的主要原因。
[0072]为验证恒温光热治疗在实际治疗中的优势，我们分别使用PBS、ICG、TCSN在有无近红外光的辐照下，对于伤口感染MRSA的BALB/C小白鼠模型进行了光热治疗，并比照了其效果(图3)。使用ICG进行的光热治疗过程中，最高温度曾一度升至65℃以上，相比之下TCSN+光照组温度恒定在49℃左右，未出现温度飙高的情况。在非光照组中，小鼠伤口的感染恢复情况无显著差别，PBS+光照组也与无光照的PBS组无显著差别。然而，ICG+光照的组中，小鼠的伤口出现了较为严重的烫伤，导致小鼠的伤口在第4天左右出现了扩大情况，并且该组中有两只小鼠夭折。相比之下，未有明显治疗效果的PBS，TCSN，ICG，PBS+光照4组的小鼠，伤口的面积每日逐渐减小，逐渐愈合。TCSN+光照的组中，小鼠伤口的愈合情况最好，小鼠的体重也最快恢复至正常。分别在第2天、第10天对小鼠伤口的细菌感染情况与伤口病理切片进行比较后(图4)，实验证明ICG+光照的情况下会对伤口的正常组织产生较大的伤害，导致小鼠需要面临原本就感染的伤口未愈合又受到光热导致的烫伤双重损伤，对小鼠的生存造成了严重影响；相比之下TCSN组由于光热治疗全程整个伤口的温度均在安全功率范围内，因此在消除感染的同时未造成连带损伤，极大地提高了小鼠伤口的愈合速度与小鼠的生存能力。
[0073]实施例3一种相转变纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0074]1)将染料(热敏黑OB-2)、显色剂(双酚S)、相转变材料(硬脂酸)、空心介孔载体(空心介孔二氧化硅纳米粒子)和有机溶剂(二甲基亚砜)按照质量比0.1：0.1：100：100：500混匀，抽真空脱气10分钟，超声1小时后，配成分散液A；
[0075]2)将分散液A以10000rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀分散到水和二甲基亚砜的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为90％，在超声下，滴加到5毫升水中；
[0076]3)8000rpm离心10分钟，弃去上清液，水洗，重悬在1毫升水中得到相转变纳米粒子。
[0077]实施例4一种相转变纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0078]1)将染料(热敏黑TF-BL-1)、显色剂(双酚AF)、相转变材料(二十二醇)、空心介孔载体(空心介孔有机硅纳米粒子)和有机溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)按照质量比25：50：100：500：2000混匀，抽真空脱气5分钟，超声1小时后，配成分散液A；
[0079]2)将分散液A以13000rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀分散到水和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为20％，在超声下，滴加到5毫升水中；
[0080]3)10000rpm离心10分钟，弃去上清液，水洗，重悬在10毫升质量含量0.5％的氯化钠水溶液中得到相转变纳米粒子。
[0081]实施例5一种相转变纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0082]1)将染料(热敏绿TFG)、显色剂(双酚S)、相转变材料(月桂酸)、空心介孔载体(空心介孔羟基磷灰石纳米粒子)和有机溶剂(乙酸乙酯)按照质量比20：0.1：100：200：2000混匀，抽真空脱气5分钟，超声1小时后，配成分散液A；
[0083]2)将分散液A以13000rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀分散到水和乙酸乙酯的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为10％，在超声下，滴加到5毫升水中；
[0084]3)10000rpm离心10分钟，弃去上清液，水洗，重悬在10毫升质量含量10％的氯化钠水溶液中得到相转变纳米粒子。
[0085]实施例6一种相转变纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0086]1)将染料(SL)、显色剂(没食子酸乙酯)、相转变材料(十二醇)、空心介孔载体(空心介孔有机硅纳米粒子)和有机溶剂(甲醇)按照质量比5：15：100：1000：1000混匀，抽真空脱气5分钟，超声1小时后，配成分散液A；
[0087]2)将分散液A以13000rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀分散到水和甲醇的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为80％，在超声下，滴加到5毫升水中；
[0088]3)10000rpm离心10分钟，弃去上清液，水洗，重悬在10毫升pH为7.6的PBS缓冲液中得到相转变纳米粒子。
[0089]实施例7一种相转变纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0090]1)将染料(SL)、显色剂(萘酚)、相转变材料(软脂酸)、空心介孔载体(空心介孔有机硅纳米粒子)和有机溶剂(四氢呋喃)按照质量比为50：50：100：1000：2000混匀，抽真空脱气5分钟，超声1小时后，配成分散液A；
[0091]2)将分散液A以13000rpm离心10分钟，弃去上清液，将沉淀分散到水和四氢呋喃的混合溶液中，所述混合溶液的水的质量含量为50％，在超声下，滴加到5毫升水中；
[0092]3)10000rpm离心10分钟，弃去上清液，水洗，重悬在10毫升pH为7.4的PBS缓冲液中得到相转变纳米粒子。
[0093]实验证明，分别用十四醇、十六醇、十八醇或二十醇替换本实施例中的软脂酸，其它同本实施例，分别获得相转变纳米粒子。
[0094]综上所述，本方法制备的相转变纳米粒子可以保持相转变材料原有理化性质从不受实验参数影响达到恒温光热控制，其中，使用肉豆蔻酸为例的相转变纳米粒子在应用到光热治疗时具有较好的治疗的效果。
[0095]实验证明，实施例3-7制备的相转变纳米粒子保持相转变材料原有理化性质的能力及杀伤细菌的作用与实施例2制备的相转变纳米粒子相似。