1.一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽，其特征在于，所述突变体多肽为SEQ ID NO:2所示。
2.一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽的偶联物，其特征在于，所述偶联物为权利要求1所述双开关突变体多肽的N端与生物素、链霉亲和素、荧光分子、磁性材料、细胞因子或抗原连接。
3.根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于，所述荧光分子选自以下荧光染料的一种或多种：BP Light、BP Fluor、BODIPY、Cy3、Cy5、Cy7、荧光素、罗丹明、FITC、800cw染料或芘染料。
4.根据权利要求2所述的偶联物，其特征在于，所述细胞因子选自白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、干扰素和生长因子中的一种或多种。
5.一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽的诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括生物素—链霉亲和素—磁珠，且生物素与权利要求1所述双开关突变体多肽的N端相连接；或者所述诊断试剂包括生物素—链霉亲和素—FITC，且生物素与权利要求1所述双开关突变体多肽的N端相连接。
6.根据权利要求1所述双开关突变体多肽、或权利要求2-4任意一项所述偶联物、或权利要求5所述诊断试剂在制备诊断肿瘤试剂中的应用。

技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽。
背景技术
[0002]肿瘤微环境包含癌细胞和多种癌症相关细胞。来源于肿瘤微环境的循环胞外囊泡(circulating tumor microenvironment extracellular vesicles,cTME-EVs)携带着丰富的母系癌细胞和癌症相关细胞的遗传物质，如蛋白、核酸、脂质和代谢物等。因此,全面识别cTME-EVs对提高癌症液体活检的精度和以无创方式研究TME具有重要意义。
[0003]但是目前的EV分离方法，如超离、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀等无法将cTME-EVs和大量的来自正常组织的胞外囊泡(EVs)分开，从而造成了癌症特征的掩盖。而抗体和适配体方法仅能通过胞外囊泡(EV)表面上的生物标志物捕获目标物质。然而，胞外囊泡(EV)表面的生物标志物表达具有巨大的异质性，这极大的影响了抗体和适配体等方法的精度，并限制了其在广泛癌症类型中的应用。
[0004]此外，癌症相关细胞分泌的EV中包含大量的反应TME的相关信息。但现在还没有合适的方法能够选择性富集这些特定EV，从而导致了在进行液体活检时，大量不可或缺的TME相关信息的丢失。因此急需开发一种能够从复杂体液中选择性富集cTME-EVs的方法，并可应用于广泛的癌症类型。
[0005]在这项专利中，我们开发了一种双开关的低pH插入肽(double switch pH lowinsertion peptide,D-S pHLIP)。D-S pHLIP具有高效的肿瘤微环境靶向能力(pKa≈6.8)。在微酸环境时，该多肽的D14和D25氨基酸会质子化，导致多肽疏水性增强而发生折叠成螺旋结构，进而插入到cTME-EVs膜上。此外，该工程多肽还能在中性的体循环期间牢固的锁定在cTME-EVs上。我们将多肽的N端修饰上生物素，注射到小鼠体内24h后，收集血清。用修饰了链霉亲和素的磁珠对装配了D-S pHLIP的cTME-EVs进行富集，并进行了性质测定。这项技术将改进癌症液体活检的精度，并将有助于TME相关研究。
发明内容
[0006]本发明目的是解决选择性富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的技术瓶颈，提供一种pHLIP突变体及其应用。
[0007]本发明的pH低插入肽(pHLIP)突变体具有pHLIP功能，所述pHLIP功能是在酸性环境下插入脂质双分子层的功能。同时，为了使pHLIP具有选择性捕获肿瘤微环境衍生的胞外囊泡的能力，本发明对pHLIP进行了突变，得到了pKa提高，并且具有在体循环中稳定结合cTME-EV的功能。
[0008]本发明提供一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽，所述突变体多肽为SEQ ID NO:1所示的pH低插入肽的氨基酸序列中第28位的亮氨酸、第31位的天冬氨酸、第21位的亮氨酸以及第22位的亮氨酸被取代。
[0009]所述突变体多肽包括开关I和II，其中开关I为位于序列第21和22位且具有pKa为6.5-6.8的响应构象开关，开关II为序列第28和31位且具有稳定结合捕获的肿瘤微环境来源胞外囊泡的开关。优选pKa为6.6、6.7、6.8。
[0010]构象开关I位于序列第21和22位的亮氨酸，且被取代后具有响应pH6.5-6.8的功能；
[0011]开关II位于序列第28的亮氨酸和31位天冬氨酸，且被取代后具有稳定结合捕获的肿瘤微环境来源胞外囊泡的功能。
[0012]进一步优选第28位的亮氨酸和第31位的天冬氨酸被组氨酸和/或丙氨酸取代，优选第28位的亮氨酸被组氨酸或丙氨酸取代，第31位的天冬氨酸被组氨酸或丙氨酸取代；第21和22位的亮氨酸被苯丙氨酸和/或甘氨酸取代，优选第21位的亮氨酸被苯丙氨酸或甘氨酸取代，第22位的亮氨酸被苯丙氨酸或甘氨酸取代。
[0013]更优选所述突变体多肽为SEQ ID NO:2所示。
[0014]本发明还提供一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽的偶联物，所述偶联物为上述双开关突变体多肽的N端与分子标记物、荧光分子、磁性材料、细胞因子或抗原连接。
[0015]所述分子标记物选自生物素、链霉亲和素中的一种或多种。
[0016]所述荧光分子选自以下荧光染料的一种或多种：BP Light、BP Fluor、BODIPY、Cy3、Cy 5、Cy 7、荧光素、罗丹明、FITC、800cw染料或芘染料。
[0017]所述细胞因子选自白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、干扰素和生长因子中的一种或多种。
[0018]所述白细胞介素选自IL-2、IL-7、IL-10、IL-15或IL-21；所述干扰素选自IFN-α、IFN-β、IFN-γ、或IFN-λ；所述肿瘤坏死因子选自TNF-α或TNF-β；其中，所述集落刺激因子选自G-CSF、GM-CSF、SCF或Flt3L；所述趋化因子选自CCL2、CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、或CX3CL1；所述生长因子选自TGF-β、EGF、FGF、PDGF或VEGF。
[0019]所述抗原选自肿瘤相关抗原、细菌抗原或病毒抗原。
[0020]本发明还提供一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽的诊断试剂，所述诊断试剂包括上述偶联物和修饰了链霉亲和素的磁珠。
[0021]本发明还提供一种用于富集肿瘤微环境来源胞外囊泡的双开关突变体多肽的诊断试剂，所述诊断试剂包括生物素—链霉亲和素—磁珠，且生物素与上述双开关突变体多肽的N端相连接；
[0022]或者所述诊断试剂包括生物素—链霉亲和素—FITC，且生物素与上述双开关突变体多肽的N端相连接。
[0023]本发明还提供一种应用，将上述双开关突变体多肽、或上述偶联物、或上述诊断试剂用于制备诊断肿瘤试剂中。
[0024]所述肿瘤为肺癌、胃癌、肠癌、甲状腺癌、肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、头颈癌、脑瘤中的一种。
[0025]本发明的优点和有益效果为：
[0026]1)本发明的D-S pHLIP具有更高的pKa，可以更好的响应肿瘤的微酸环境；具有在体循环中稳定结合cTME-EV的功能。
[0027]2)本发明将如SEQ ID NO:1所示的pHLIP进行突变，得到的pHLIP突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:2)仍然具有在酸性环境中插入脂质双分子层的功能，并被赋予了一个新的pH响应构象开关，用于在体循环中稳定结合cTME-EV，从而实现选择性富集富含大量癌症特征的cTME-EVs。
附图说明
[0028]图1是化学合成修饰了生物素的D-S pHLIP的HPLC图。
[0029]图2是化学合成修饰了生物素的D-S pHLIP的质谱图
[0030]图3是是pHLIP及其突变体的细胞实验和EV实验验证
[0031]图4是pHLIP及其突变体多肽在动物实验中的RNA浓度检测(A)和Western检测(B)图5是pHLIP及其突变体多肽的转录组学验证，其中对pHLIP及其突变体多肽的肿瘤相关差异表达基因数量分析
具体实施方式
[0032]实施例1：
[0033]突变体多肽的设计
[0034]pHLIP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在该SEQ ID NO:1，引入L21F/L22G的突变设计以使得pHLIP的pK值(即开关I)提高；引入开关II的设计(L28H/D31A)以使得多肽成“钩状”结构，从而在插入细胞膜后能够与细胞膜在体循环中牢固的结合。经H++软件预测突变后的pK值，并用分子模拟软件NAMD模拟多肽的结构变化后，确定在SEQ ID NO:1的第28位的亮氨酸被组氨酸或丙氨酸取代，第31位的天冬氨酸被组氨酸或丙氨酸取代；第21位的亮氨酸被苯丙氨酸或甘氨酸取代，第22位的亮氨酸被苯丙氨酸或甘氨酸取代。
[0035]实施例2：
[0036]具有NHS基团的多肽突变体经化学合成方法获得(由上海吉尔生化有限公司负责合成)。具体步骤包括：i)去维护：Fmoc维护的柱子和单体用一种碱性溶剂去除氨基的维护基团；ii)激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活溶解，激活的单体与游离的氨基在交联剂的作用下交联，构成肽键；iii)循环：重复循环直到整条肽链合成结束；iv)洗脱和脱维护：将多肽用脱树脂溶剂从柱上洗脱下来，制得如SEQ ID NO:2所示的突变体多肽。之后将活化的生物素与该突变体多肽的NHS基团进行缩合反应，从而获得生物素修饰的突变体多肽。高效液相色谱结果和质谱结果如图1/图2所示。结果表明，生物素修饰的突变体多肽纯度达到要求(95％)，通过质谱图表明合成成功。
[0037]实施例3：
[0038]细胞和EV实验验证：
[0039]人肺癌细胞，即A549，来自中国科学院上海生命科学研究所。所有关于细胞和EV的体外实验均在无菌超净台上进行。在细胞实验中，A549细胞在37℃的共聚焦培养皿中培养过夜，培养液为1mL Dulbecco改良基本培养基(DMEM；Wisent，Canada)，补充10％的热灭活胎牛血清(FBS)(Wisent,Canada)和1％的青霉素链霉素(Gibco Life Technologies，GrandIsland,NY)。去除上清液后，添加新鲜的1mLDMEM和5μM修饰了生物素的多肽。用三种pH条件，i)pH 7.4，ii)pH 7.4→6.2和iii)pH 7.4→6.2→7.4处理pHLIP细胞体系。用i)pH 7.4，ii)pH 7.4→6.8和iii)pH 7.4→6.8→7.4处理pHLIP突变体细胞体系。改变pH值后，将上述多肽与细胞在新鲜DMEM中孵育0.5小时，其中细胞保持生长。过量的多肽通过使用PBS(i和iii的pH值为7.4，ii的pH值为6.2(pHLIP)/6.8(pHLIP突变体))清洗细胞三次来去除。然后用修饰了链霉亲和素的FITC染料添加到上清液中，用于与修饰了生物素的多肽通过生物素-链霉亲和素系统结合。孵育10分钟后用相应pH的PBS溶液清洗，之后固定细胞，并用DAPI(蓝色荧光)对细胞核进行染色。在EV实验中，生物素修饰的多肽与过夜培养的1mL A549细胞上清液一起培养，然后进行7.4→6.2→7.4处理pHLIP体系，利用7.4→6.8→7.4处理pHLIP突变体体系。将修饰了链霉亲和素的FITC添加到上清液中。最后用DiI染料进一步用于EV膜染色。所有关于EV实验的pH变化和缓冲液替换都是通过100KDa超滤离心管进行的。共聚焦显微镜(Nikon,Japan)用于测量不同系统的荧光,结果如图3所示。
[0040]结果表明pHLIP突变体在理想的pH 6.8条件下插入了细胞膜中，成功提高了多肽的pK值。另外，pHLIP突变体在酸性环境插入细胞/EV后，再回到中性时仍能与细胞/EV结合，说明“钩状”突变设计的成功。
[0041]实施例4
[0042]动物实验：
[0043]5-6周龄的裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物研究均按照天津市实验动物使用与护理委员会制定的指南进行，整体项目方案经南开大学动物伦理委员会批准。实验室认证号为天津市科学技术委员会颁布的SYXK(津)2019-0003。106个肺癌细胞植入小鼠体内后，三周内肿瘤形成。然后将修饰了生物素的多肽在肿瘤的对侧腹腔注射(2mg/kg)。在不同时间点采集全血样本，放置1.5小时，然后在4℃下以1000g离心15分钟，以获得血清。利用2μm由链霉亲和素修饰的磁珠使用磁性分离收集多肽捕获的cTME-EVs。根据制造商的说明，使用miRNeasy血清/血浆试剂盒(QIAGEN)检测样本的RNA浓度(图4A)。
[0044]在western blot分析中，样品用冷冻RIPA缓冲液(Beyotime Biotechnology)和蛋白酶抑制剂(PMSF，1mM，Beyotime-Biotechlology)溶解30分钟。裂解产物在14000g下离心20分钟，以收集上清液。然后通过SDS-PAGE分离样品，并转移到0.45μm硝化纤维素膜(Millipore)上。在初步抗体孵育之前，在37℃下用5％脱脂牛奶(TBST、20mM Tris HCl、150mM NaCl和0.05％吐温-20)进一步封闭膜1小时。随后，针对以下蛋白质的抗体用于WB实验：抗CD63(1:1000，Proteintech，25682-1-AP)、抗EpCAM(1:1000、Beyotime，AF1603)、抗Alix(1:1000；Beyotime，ET1705-74)和抗CD9(1:1000)。HRP连接的抗兔IgG抗体(1:3000，Beyotime，A0208)用作二级抗体。将膜与一级抗体在4℃下孵育过夜，然后使用TBST清洗三次，并在室温下与二级抗体孵育2小时。每十分钟用TBST进一步清洗一次膜(三次)，用BeyoECLPlus(Beyotime Biotechnology)培养，并由Azure c600(Azure Biosystems，USA)成像，结果如图4B所示。
[0045]结果表明，pHLIP突变体捕获到了大量的EV，而野生型pHLIP则几乎没有捕获到。这表明了pHLIP突变体在活体内选择性富集cTME-EV的可用性。Western实验结果进一步验证了这个结论。
[0046]实施例5
[0047]转录组测序：
[0048]为了验证pHLIP突变体捕获到了更多的癌症相关信息，我们将pHLIP突变体捕获到的cTME-EVs以及利用EV分离的金标准在超速离心获得的肿瘤模型小鼠的EV进行验证。正常小鼠模型的EV由超速离心法得到，用以分析肿瘤相关差异表达基因。在超速离心组中，将获得的血清在10000g下离心30min。用超速离心机(110000g，90min，Beckman Coulter，OptimaTM MAX-XP，USA)离心上清液。将获得的颗粒重新悬浮在PBS(pH 7.4，5mM)中，并再次通过用超速离心机离心(110000g，90min)。最后，将所得颗粒分散在PBS中(pH 7.4，5mM)。如图5所示，pHLIP突变体组获得的肿瘤相关差异表达基因的数量是金标准超离组的18倍以上。
[0049]本发明中涉及的氨基酸序列如下：
[0050]SEQ ID NO：1
[0051]
[0052]SEQ ID NO：2
[0053]
[0054]其中，下划线标注位点为待突变位点。