1.一种利用外泌体制备延缓胚胎成纤维细胞衰老药物的方法，其特征在于，利用外泌体处理衰老的小鼠胚胎成纤维细胞，所述外泌体为从体外培养细胞上清中分离提取的干细胞来源外泌体，具体包括以下步骤：
（1）将去除外泌体的胎牛血清置于超速离心管中，配平后，120000g在4℃离心2h，离心后取上清，并用0.22μm的针式滤器过滤上清，保存于-80℃冰箱备用；
（2）当胚胎干细胞刚复苏起来时，用正常血清配制的培养基来培养胚胎干细胞，当细胞汇合度达到80％时，吸弃培养基，用PBS轻轻地洗两次，将细胞传代后，用含有15％无外泌体的血清配制的培养基，继续培养24h后，将细胞培养上清收集至50ml离心管中，得到富含胚胎干细胞来源外泌体的上清液；
（3）超速离心法分离提取外泌体：①将上述步骤获得的细胞培养上清于4℃，500g离心10min，取上清，去除细胞碎片；②将所得上清于4℃，2000g离心30min，取上清，去除凋亡小体和大的细胞碎片；③用0.22μm的针式滤器过滤所得上清，去除直径大于200nm的微囊泡；④把过滤后的上清置于超速离心管中，于4℃，120000g离心2h，弃上清，加入适量PBS重悬管底沉淀，分装后于-80℃保存；
所述衰老的小鼠胚胎成纤维细胞是由小鼠原代MEF细胞连续传代获得的；
所述外泌体浓度为100ug/ml,处理时间为96h；
所述小鼠胚胎成纤维细胞的衰老状态是利用Ki67、p21、p53蛋白的表达变化检测。

技术领域
[0001]本发明涉及利用胚胎干细胞分泌的外泌体来延缓细胞衰老的技术手段，属于组织工程与新医药技术领域。
背景技术
[0002]胚胎干细胞是一种从哺乳动物囊胚中分离出来的多能细胞。胚胎干细胞最初来源于小鼠，随后从其他啮齿类动物、家养动物物种和非人类灵长类动物中分离出胚胎干细胞系或类似胚胎干细胞系。胚胎干细胞具有高度的自我更新能力和多向分化能力，在一定条件下可以诱导分化成各种类型的细胞。有研究报道其在治疗神经退行性疾病、糖尿病、修复坏死心肌和肝再生等方面有明显的治疗作用。然而，由于免疫排斥和伦理道德等问题，胚胎干细胞在临床治疗中的应用受到限制。因此，科学家们正在寻找替代胚胎干细胞的方法，以发挥胚胎干细胞的优良特性。近年来已经报道了几种替代疗法，如采用治疗性克隆、孤雌胚胎干细胞以及诱导多能干细胞来进行疾病治疗或组织修复。然而，它们的致瘤潜能依然限制了多能干细胞的临床应用。
[0003]外泌体是一种磷脂双分子层包裹的囊泡，是由核内体膜内陷产生的，平均直径约为100nm，外泌体包含RNA、脂类和蛋白质。外泌体的作用取决于其内容物传递到受体细胞，从而改变靶细胞的生物学过程。外泌体的运输和转运会影响其靶细胞的各种生理功能，在细胞内和细胞间通讯中发挥重要作用，包括调节免疫应答、细胞增殖、细胞迁移、血管形成、癌症进展等生物学过程。外泌体还可以从细胞中移除多余的成分以维持细胞内稳态，并与放射性组织损伤、心血管疾病、病毒致病性、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有关。外泌体由多种细胞分泌，可促进或限制疾病进展。因此，基于上述外泌体的内在特性，外泌体可能在许多疾病的预防和治疗中有更多的潜在用途。
[0004]多项研究报道，胚胎干细胞也能分泌外泌体，并且这种胚胎干细胞来源的外泌体已经在多种疾病恢复模型中被证实发挥重要作用。胚胎干细胞来源的外泌体可以通过传递miR-294促进血管新生和心肌细胞增殖，从而促进心梗后的心脏功能修复。近年来，有研究发现多种细胞分泌的外泌体具有延缓机体衰老的作用，人年轻成纤维细胞来源的外泌体可改善衰老相关的组织损伤，间充质干细胞来源的外泌体通过改善皮肤成纤维细胞的衰老促进皮肤再生，已有研究报道胚胎干细胞来源的外泌体也可以改善衰老间充质干细胞的衰老相关表型并且促进其治疗皮肤损伤的有效性。
[0005]并且外泌体成功地规避了上述胚胎干细胞治疗面临的问题。首先，胚胎干细胞来源的外泌体可以避免伦理问题，因为外泌体来源于胚胎干细胞上清，并且胚胎干细胞可以在体外无限增殖，所以可以在不破坏新胚胎的情况下连续分离得到胚胎干细胞来源的外泌体。其次，与细胞治疗相比，细胞外囊泡更稳定，更方便储存，更容易管理和控制。第三，胚胎干细胞来源的外泌体的致瘤性低于胚胎干细胞。因此胚胎干细胞来源的外泌体被认为是胚胎干细胞在细胞治疗中的良好替代物，避免了胚胎干细胞在临床应用中的缺陷，极大的发挥了胚胎干细胞的优良特性。
[0006]衰老是生命过程的必然规律，是机体各组织、器官功能随年龄增长而发生退行性变化的过程，其特征是机体内生物过程变化的积累导致生物体功能随着时间的推移而下降。人的衰老伴随着认知和身体障碍的逐步积累，并且患多种疾病的风险增加，包括癌症，糖尿病，心血管，肌肉骨骼和神经退行性疾病。与年龄有关的衰老疾病的发生对生活质量产生严重影响，最终会增加死亡风险。随着老年人口的不断增加，当前我国正在逐渐步入人口老龄化社会。面对老龄化社会的到来，老年人群如何实现健康老龄化，成为我们当前急需解决的问题。
[0007]小鼠胚胎成纤维细胞是一种来源于妊娠期第13天的小鼠胚胎细胞，小鼠胚胎成纤维细胞是一种可用于干细胞培养的饲养层细胞，它们可以分泌几种有助于维持干细胞多能性的重要生长因子，并为干细胞生长提供细胞基质。但是小鼠胚胎成纤维细胞在连续传代的过程中衰老速度很快，在传代到第7代时，表现出细胞周期阻滞、细胞增殖缓慢、细胞体积缩小等衰老细胞典型的特征。
发明内容
[0008]本发明是一种利用胚胎干细胞分泌的外泌体来抵抗衰老的技术手段。
[0009]本发明是利用胚胎干细胞来源的外泌体处理复制性衰老的小鼠细胞，从而延缓小鼠细胞的衰老。
[0010]本发明可以有效地抑制复制性衰老的小鼠细胞中衰老相关基因以及蛋白的表达。
[0011]本发明可以有效地延缓小鼠细胞的衰老，改善细胞形态，促进细胞增殖，降低细胞氧化损伤程度。
[0012]本发明以连续传代的复制性衰老的小鼠胚胎成纤维细胞为模型，探究胚胎干细胞来源的外泌体抵抗衰老的作用。
附图说明
[0013]图1为外泌体的表征，该外泌体为胚胎干细胞来源的外泌体。
[0014]图2为胚胎干细胞来源的外泌体可以被小鼠胚胎成纤维细胞内化，从而发挥作用。
[0015]图3为胚胎干细胞来源的外泌体处理衰老的P7代小鼠胚胎成纤维细胞，衰老相关基因以及蛋白的表达量明显下降。
[0016]图4为胚胎干细胞来源的外泌体处理衰老的P7代小鼠胚胎成纤维细胞，提高细胞的增殖能力、降低DNA损伤程度。
具体实施方式
[0017]下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。
[0018]实施例1，本发明提供一种胚胎干细胞来源外泌体的提取方法。
[0019]细胞基础培养基、血清购于Hyclone公司；双抗、胰酶等试剂购于Gibco公司；细胞培养耗材均购于NEST公司。
[0020]用于提取外泌体的细胞培养所需血清为去除外泌体的胎牛血清，处理步骤如下：将胎牛血清置于超速离心管中，配平后，120000g在4℃离心2h，离心后在超净台中取上清，弃沉淀，并用0.22μm的针式滤器过滤上清，保存于-80℃冰箱备用。
[0021]细胞复苏、传代培养、冻存等细胞生物学实验操作步骤详见《动物细胞培养(第六版)》。
[0022]收集含有外泌体的胚胎干细胞培养上清：当胚胎干细胞刚复苏起来时，用正常血清配制的培养基来培养胚胎干细胞，当细胞汇合度达到80％时，吸弃培养基，用PBS轻轻地洗两次，将细胞传代后，用含有15％无外泌体的血清配制的培养基，继续培养24h后，将细胞培养上清收集至50ml离心管中，该上清富含胚胎干细胞来源的外泌体。
[0023]超速离心法分离提取外泌体：①将上述步骤获得的细胞培养上清于4℃，500g离心10min，取上清，去除细胞碎片；②将所得上清于4℃，2000g离心30min，取上清，去除凋亡小体等大的细胞碎片；③用0.22μm的针式滤器过滤所得上清，去除直径大于200nm的微囊泡；④把过滤后的上清置于超速离心管中，于4℃，120000g离心2h，弃上清，加入适量PBS重悬管底沉淀，分装后于-80℃保存。
[0024]实施例2，本发明提供一种胚胎干细胞来源外泌体的鉴定方法。
[0025]1.通过Western Blot检测外泌体标志蛋白Alix，TSG101和CD63(图1)。
[0026]1)蛋白样品制备：按PMSF：RIPA＝1：100的比例配制蛋白裂解液，将超速离心后得到的外泌体沉淀中加入蛋白裂解液裂解外泌体。将样品在冰上裂解30min，每5min在涡旋振荡器上震荡，确保充分裂解，30min后于4℃，12000rpm离心15min，将上清移入新的EP管中；使用BCA法测定外泌体蛋白浓度，其余蛋白液中加入5×SDS上样缓冲液，在沸水中煮5-10min变性，变性完成后将样品立即放入液氮中冷激速冻，保存于-80℃冰箱中备用。
[0027]2)配胶：用海绵仔细清洗Western Blot实验中所用到的玻璃板，用洗洁精洗后，自来水冲洗干净，再用超纯水冲洗三遍，后续用到的夹子、海绵、配胶瓶、电泳槽、转膜槽等也要清洗干净。将洁净晾干的玻璃板装于制胶架上，使底边吻合严密，用蒸馏水验漏。按照分离胶配方配制10％的分离胶溶液，充分混匀，用5ml移液枪一次性加入提前用夹子固定好的玻璃板中，注意避免气泡，分离胶加到距上边缘约1.5cm，轻轻加水液封，避免冲坏胶面。40min后，可见水和胶之间有一条明显的分界线，此时分离胶已凝固，用吸水纸将封分离胶的水吸干净。按照配方配制5％的浓缩胶溶液，加入1.5ml浓缩胶溶液到分离胶的上方，立即插入梳子，待浓缩胶凝固后便可使用。
[0028]3)聚丙烯酰胺凝胶电泳：将配好的胶板放置到电泳槽内，注意短玻板向内侧，在两块玻板中间加入新鲜配置的1x Running buffer，将梳子拔出，按照等质量(20ug-50ug)的原则进行蛋白上样，根据测定的浓度计算上样的体积，并用1xSDS将上样总体积调齐至20ul，将蛋白样品加入上样孔中，添加电泳液至电泳槽标记处，盖好电泳槽盖，注意正负极方向一致，浓缩胶用80V电压跑，待溴酚蓝跑至分离胶，蛋白marker分开时，将电压调至110V，直至溴酚蓝接近玻板底部时停止电泳，整个电泳所用时长为1.5小时。
[0029]4)转膜：提前准备好预冷的含有20％甲醇的转膜液(1x Transfer buffer)，将转膜夹、海绵及滤纸浸泡于预冷的转膜缓冲液中，小心撬开胶板，将浓缩胶沿着分界线轻轻去掉，把电泳后的分离胶置于黑色夹板一侧，剪取适宜大小的PVDF膜，置于甲醇中活化60s，放置于胶上，除尽胶与膜之间的气泡，在膜上轻轻地覆盖滤纸和海绵，按照转膜夹负极(黑色)-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-转膜夹正极(白色)顺序夹好转膜夹，放置于转膜槽中，添加转膜液，将整个转膜槽放置于装满冰的泡沫盒内，冰浴恒压100V转膜2h。
[0030]5)封闭：将转膜完成的PVDF膜取出，置于5％的脱脂牛奶(封闭液)中，有蛋白的一面朝上，水平摇床60rpm室温封闭2h。
[0031]6)抗体孵育：①一抗孵育：用封闭液按照说明书稀释一抗(Alix，1:2000稀释；TSG101，1:2000稀释；CD63，1：2000稀释)，吸取2ml一抗置于抗体孵育盒中，对照蛋白Marker进行剪膜，将膜置于对应一抗中，4℃孵育过夜；②二抗孵育：将条带置于TBST中，水平摇床上，120rpm清洗3次，每次10min，然后加入对应种属的二抗，水平摇床60rpm室温孵育2h，孵育完成后用TBST洗3次，每次10min。
[0032]7)曝光：把发光液A、发光液B按1:1比例进行混合配成工作液，通过曝光仪进行曝光。
[0033]2.外泌体形态及粒径的表征
[0034]采用透射电镜(TEM)观察外泌体的形态。样品沉积在覆盖有碳膜的铜网格上，室温干燥2min，用过滤器除去多余的液体后，用2％醋酸铀对样品进行30s的负染。样品风干60min后，用透射电镜成像。使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)确定外泌体的粒径。
[0035]实施例3，本发明提供建立小鼠胚胎成纤维细胞衰老模型的方法。
[0036]1.原代MEF细胞的提取
[0037]1)取怀孕13.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫。取出整个子宫，用PBS洗涤3次，弃除表面残余血迹。
[0038]2)沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，充分洗涤，弃除表面红细胞。
[0039]3)用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，PBS洗涤3次。
[0040]4)去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干置于另一盛有PBS的平皿内用PBS洗涤3次。
[0041]5)用无菌剪刀将鼠躯干剪成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。
[0042]6)加5-10ml胰酶，将装有小鼠躯干碎块的离心管置于培养箱中消化10-20min。
[0043]7)取出离心管，反复吹打，加足量培养基终止消化，1000rpm离心5min。
[0044]8)弃上清，加适量培养液，反复吹打，重悬细胞。
[0045]9)将细胞分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞。
[0046]10)置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，待细胞长5-7天互相重叠爬满整个培养瓶时按1:3-1:6传代。
[0047]2.连续传代建立MEF细胞衰老模型
[0048]利用MEF细胞的复制性衰老特性,通过细胞传代培养的办法,将获得的原代MEF细胞连续传代培养直至其衰老。利用Ki67、p21、p53蛋白的表达变化检测细胞的衰老状态。
[0049]实施例4，本发明提供一种用外泌体延缓小鼠胚胎成纤维细胞衰老的技术。
[0050]用超速分离得到的胚胎干细胞来源的外泌体处理连续传代诱导的衰老的小鼠胚胎成纤维细胞，用不同浓度的外泌体(0，50，100，150，200ug/ml)处理衰老的小鼠胚胎成纤维细胞48h或者96h。通过CCK-8检测不同处理条件下细胞的增殖速度变化，并通过Q-PCR检测不同处理条件下细胞中衰老相关基因的表达量变化，各项衰老相关指标检测结果表明，浓度为100ug/ml的胚胎干细胞来源的外泌体处理96h能够延缓小鼠胚胎成纤维细胞的衰老。