1.一种Mmp1突变蛋白，其特征在于，与野生型Mmp1相比，所述Mmp1突变蛋白的第171位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸或第60-75位氨基酸缺失；所述野生型Mmp1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种Spycatcher-Mmp1蛋白，其特征在于，所述Spycatcher-Mmp1蛋白通过权利要求1所述的Mmp1突变蛋白的编码序列与Spycatcher的编码序列融合表达获得。
3.权利要求1所述Mmp1突变蛋白或权利要求2所述的Spycatcher-Mmp1蛋白在展示多肽或蛋白中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蛋白包括含SpyTag的蛋白。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当将所述Mmp1突变蛋白用于展示多肽时，还包括对所述Mmp1突变蛋白进行修饰，得到修饰后的Mmp1突变蛋白；所述修饰为在所述Mmp1突变蛋白N末端连接Flag标签，C末端连接多肽LPXTG。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述Spycatcher-Mmp1蛋白与含有SpyTag的多肽或蛋白通过SpyTag/SpyCatcher形成异肽键偶联，实现多肽或蛋白的展示。
7.权利要求1所述Mmp1突变蛋白或权利要求2所述的Spycatcher-Mmp1蛋白在封装外源蛋白中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白包括靶向肽，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白包括绿色荧光蛋白。

技术领域
[0001]本发明属于纳米隔室应用技术领域，具体涉及一种Mmp1突变蛋白及其应用。
背景技术
[0002]耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌有许多相似功能的基因，且具有相似的细胞壁结构及表面抗原有效成分，因此，耻垢分枝杆菌抗原致敏的机体可产生较好的抗结核分枝杆菌的免疫力，与结核分枝杆菌抗原成分发生免疫反应，有效抑制结核分枝杆菌。
[0003]纳米隔室是一种由外壳蛋白和不同货物蛋白组成的结构，能够实现多种生化反应的发生。纳米隔室可提供一种受限的环境，使得货物蛋白和底物在腔体内具有较高的局部浓度，提高货物蛋白和底物碰撞的效率，还可以发挥屏蔽作用一方面可以规避释放的毒性反应中间体对胞质的损伤一方面纳米隔室也为货物蛋白创造了一个稳定的空间环境，可以降低胞质中其他活性物质对于货物蛋白催化反应的影响，利于不兼容的多种生化反应同时在细胞内发生。所以，纳米隔室在维持细菌代谢稳态及抵抗氧化压力中也发挥着重要的作用。
[0004]目前，现有技术中并没有耻垢分枝杆菌的纳米隔室及其应用的相关研究。
发明内容
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Mmp1突变蛋白，以及该Mmp1突变蛋白的应用，本发明通过提取耻垢分枝杆菌中的Mmp1基因，然后诱导表达纯化Mmp1蛋白，并经过对Mmp1蛋白进行纳米隔室的三维结构分析，发现了Mmp1蛋白定点突变171位的赖氨酸(K)和敲除60-75位loop区域，可以稳定的组装成直径为20nm、颗粒大小均一的纳米隔室(T＝1)，经过基因重组技术，并构建Spycatcher-Mmp1蛋白结构，可实现在纳米颗粒表面进行多肽或蛋白的展示和外源蛋白的封装。
[0006]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007]本发明提供了一种Mmp1突变蛋白，与野生型Mmp1相比，所述Mmp1突变蛋白的第171位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸或第60-75位氨基酸缺失；所述野生型Mmp1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本发明还提供了一种Spycatcher-Mmp1蛋白，所述Spycatcher-Mmp1蛋白通过上述方案所述的Mmp1突变蛋白的编码序列与Spycatcher的编码序列融合表达获得。
[0009]本发明还提供了上述方案所述Mmp1突变蛋白或Spycatcher-Mmp1蛋白在展示多肽或蛋白中的应用。
[0010]优选的，所述多肽包括含SpyTag的多肽；所述蛋白包括含SpyTag的蛋白。
[0011]优选的，当将所述Mmp1突变蛋白用于展示多肽时，还包括对所述Mmp1突变蛋白进行修饰，得到修饰后的Mmp1突变蛋白；所述修饰包括在所述Mmp1突变蛋白N末端连接Flag标签，C末端连接多肽LPXTG。
[0012]优选的，所述Spycatcher-Mmp1蛋白与含有SpyTag的多肽或蛋白通过SpyTag/SpyCatcher形成异肽键偶联，实现多肽或蛋白的展示。
[0013]本发明还提供了上述方案所述Mmp1突变蛋白或Spycatcher-Mmp1蛋白在封装外源蛋白中的应用。
[0014]优选的，所述外源蛋白包括靶向肽，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]优选的，所述外源蛋白包括绿色荧光蛋白。
[0016]有益效果：
[0017]本发明提供了一种Mmp1突变蛋白及其应用。本发明在耻垢分枝杆菌中分离纯化出Mmp1蛋白，并首次发现了Mmp1蛋白定点突变171位的赖氨酸(K)和敲除60-75位loop区域，可以稳定地组装成直径为20nm、颗粒大小均一的纳米隔室(T＝1)，然后经过基因重组技术，以及构建Spycatcher-Mmp1蛋白结构，可以实现在纳米颗粒表面进行多肽或蛋白的展示，且将外源蛋白融合靶向肽后，可以使Mmp1突变蛋白封装外源蛋白，为新型纳米颗粒疫苗研发和药物递送提供良好的应用价值。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0019]图1为实施例1中耻垢分枝杆菌野生型Mmp1蛋白预装柱(Superose 6Increase 10/300GL)纯化结果(A)和负染结果(B)；
[0020]图2为实施例2中耻垢分枝杆菌突变型Mmp1(K171A)和(Δ60-75)预装柱(Superose6Increase10/300GL)纯化结果(A)和负染结果(B)；
[0021]图3为应用例1中N-flag-Mmp1-LPXTG预装柱(Superose 6Increase 10/300GL)纯化结果(A)和电镜下观察负染结果(B)；
[0022]图4为应用例2中N-Spycatcher-Mmp1-flag预装柱(Superose 6Increase 10/300GL)纯化结果(A)和电镜下观察负染结果(B)；
[0023]图5位为应用例3中Mmp1封装外源蛋白GFP预装柱分析结果(A)和电镜负染结果(B)。
具体实施方式
[0024]本发明提供了一种Mmp1突变蛋白，与野生型Mmp1相比，所述Mmp1突变蛋白的第171位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸或第60-75位氨基酸缺失；所述野生型Mmp1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：MDYKDDDDKMTSAQNESQALGDLAARQLANATKTVPQLSTITPRFLLHLLSWVPVEAGIYRVNRVVNPDRVAIHSEAGAGTEEPLPETYVDYETHPREYTLRSISTLLDVHTRVSDLYSSPHDQVTQQLRLTIETIKERQEYELVNNPEYGLLAQATPEQTIQTLAGAPTPDDLDALITKVWKTPAFFLTHPLGVAAFGRECTYRGVPPPTVSMYGAQFITWRGIPIVPSDKVPVEDGTTKFVLVRTGEERQGVVGLFQPGLVGEQAPGLSVRFTGINRSAIASYLVTLYTSLAVLTDDALAVLDGVAVDQFHEYQ。
[0025]本发明优选先以体外表达的方式制备野生型Mmp1蛋白，所述野生型Mmp1蛋白的制备方法优选包括：
[0026]以野生型的耻垢分枝杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到Mmp1基因的DNA片段；
[0027]将所述Mmp1基因的DNA片段与改造后的穿梭pMV-261融合表达载体进行连接，得到重组表达载体；
[0028]将所述重组表达载体转入到感受态中进行诱导表达，得到所述野生型Mmp1蛋白。
[0029]本发明优选以野生型的耻垢分枝杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。本发明所述PCR扩增引物优选以Mmp1基因的DNA序列为模板设计得到。本发明所述PCR扩增引物的上游引物优选为261-Mmp1-F，所述261-Mmp1-F的核苷酸序列优选如SEQID NO.2所示，具体为：261-Mmp1-F：5’-TAAGAGAAAGGGAGTCCACATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGatgacgtccgcccagaacg-3’，下游引物优选为261-Mmp1-R，所述261-Mmp1-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示，具体为：261-Mmp1-R：5’-AACTACGTCGACTTAtcactggtactcatggaactgg-3’，本发明所述PCR扩增体系和扩增程序优选分别如表1和表2所示。
[0030]表1PCR扩增体系
[0031]PCR组分体积/μLddH2O172xPhantaMaxbuffer25上游引物261-Mmp1-F(10μM)1下游引物261-Mmp1-R(10μM)1<![CDATA[耻垢分枝杆菌(M.smegmatismc²155)基因组DNA]]>2dNTPMix(10mM)2DMSO1PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase(VazymeP505-d1)1
[0032]表2PCR扩增程序
[0033]
[0034]本发明所述Mmp1基因的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，具体如下：
[0035]5’-ATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGatgacgtccgcccagaacgaatcgcaggccctcggagatctcgccgcacggcaactcgcgaacgcgaccaagacagttccccagctgtcgaccatcacgccgcggttcctgctgcacctgctcagctgggttcctgtggaggccggtatctaccgggtgaaccgtgtggtcaaccccgaccgggtggcgatccactccgaggcgggcgcgggtaccgaggaaccgctgcccgagacctacgtcgactacgagacccatccgcgcgagtacacgttgcggtccatctcgacgctgctcgacgtgcacacccgtgtctcggacctgtactccagcccgcacgaccaggtcacccagcagttgcggctgaccatcgagaccatcaaggagcgccaggagtacgaactggtcaacaaccccgaatacgggttgctggcgcaggcgacgcccgagcagaccatccagaccctggccggcgccccgacccccgacgatctcgacgcgctgatcaccaaggtgtggaagacacccgcgttcttcctgacccatccgctgggcgtggccgctttcggccgggagtgcacctaccgcggtgtgccgccgccaaccgtgagcatgtacggcgcccagttcatcacgtggcgcggcatcccgatcgtgccgagcgacaaggtgcccgtcgaggacggcacgaccaagttcgtcctcgtgcgcaccggtgaggagcgccaaggcgtggtcggcctgttccagcccggattggtcggtgagcaggcgccgggtctgtccgtgcgcttcacgggcatcaaccggtcggccatcgcgtcgtacctggtgacgctctacacgtcgctcgcggtgctgaccgacgacgcactcgccgtcctcgacggcgtcgccgtggaccagttccatgagtaccagtga-3’。
[0036]Mmp1的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。
[0037]得到所述PCR扩增产物后，本发明优选将所述PCR扩增产物进行纯化，得到所述Mmp1基因的DNA片段。本发明对所述纯化的方式没有特殊限定，采用本领域中常规纯化手段即可，如试剂盒。
[0038]得到所述Mmp1基因的DNA片段后，本发明优选将所述Mmp1基因的DNA片段与线性化的穿梭pMV-261融合表达载体进行重组反应，插入Bam HI和Hind III之间得到重组表达载体。本发明进行所述重组表达载体构建时，用于线性化pMV-261载体的引物的上游引物261-F的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示，具体为：5’-TAAGTCGACGTAGTTAACTAGCGTACGATCGACTGC-3’，下游引物261-R的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-CATGTGGACTCCCTTTCTCTTATCGGGTGGTGGC-3’。
[0039]得到所述含有Mmp1基因的重组表达载体后，本发明优选将所述重组表达载体转入大肠杆菌感受态细胞中。本发明所述大肠杆菌优选为大肠杆菌DH5α。本发明所述转入优选采用热激法。具体步骤优选如下(1)将恒温水浴的温度调到42℃。(2)从-80℃超低温冰柜中取出一管(100μL)自制感受态大肠杆菌DH5α，插入冰上，待其融化。(3)在超净工作台中向感受态细胞中加入5μL重组表达载体，轻轻震荡混匀后放置冰上20min。(4)插入42℃水浴中热激1.5min，然后迅速放回冰中，静置3min。(5)在超净工作台中向感受态中加入200μL无抗LB培养基，37℃复苏1h。(6)在超净工作台中取上述转化混合液200μL，滴到含卡那霉素抗性的LB平板培养皿中，涂布棒涂布均匀。将培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
[0040]将所述重组表达载体转入大肠杆菌感受态细胞后，本发明优选筛选阳性单克隆菌株，得到含有所述重组表达载体的阳性菌株。本发明所述筛选的方法优选包括：将所述大肠杆菌感受态细胞涂布在含有卡那霉素的固体LB培养基中进行培养，得到含有所述重组表达载体的阳性菌株。本发明所述卡那霉素的浓度优选为50μg/mL。本发明对所述培养的方法没有特殊限定，按照本领域中常规阳性单克隆筛选的方法进行培养即可。
[0041]得到含有所述重组表达载体的阳性菌株后，本发明优选采用碱性裂解法提取含有所述重组表达载体的阳性菌株的质粒，并委托苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序，得到与预期构建一致的的重组质粒。
[0042]得到所述测序成功的重组质粒后，本发明优选将所述测序成功的重组质粒转化分枝杆菌感受态细胞中，进行诱导培养。本发明所述转化优选采用电转仪电转进行所述转化，所述电转仪的参数设置优选为：电转程序Time constant protocol，电压2500V，时间5.7ms，电转杯厚度2mm。本发明所述GenePulser Xcell电转仪品牌为BIO-RAD。本发明所述分枝杆菌优选为耻垢分枝杆菌mc2155。
[0043]本发明所述诱导培养优选包括单克隆培养和扩大培养。本发明所述单克隆培养优选包括将所述分枝杆菌感受态细胞复苏4h后涂布在含有卡那霉素和羧苄青霉素的固体LB培养基中进行单克隆培养，得到单克隆菌落本发明所述单克隆培养的温度为37℃，时间优选为3d。本发明所述卡那霉素和羧苄青霉素的浓度均优选为50μg/mL。
[0044]本发明所述扩大培养优选包括挑取所述单克隆菌落接种至含有卡那霉素、羧苄青霉素和吐温80的5mL液体LB培养基中第一扩大培养，然后将5mL培养液转接至含有卡那霉素、羧苄青霉素和0.1％(v/v)吐温80的1L液体LB培养基中进行第二扩大培养，培养至菌液浓度达到OD600＝0.6～0.8为止，所述菌液浓度进一步优选为OD600＝0.8。本发明所述第一扩大培养的温度优选为37℃时间优选为36h，；所述第二扩大培养的温度优选为37℃，诱导温度为16℃。本发明所述卡那霉素和羧苄青霉素的浓度均优选为50μg/mL，所述吐温80的体积百分含量优选为0.01％。
[0045]完成所述诱导培养后，本发明优选将所述诱导培养后得到的菌液进行诱导表达，并收集分枝杆菌菌体。本发明所述诱导表达优选包括将所述诱导培养后得到的菌液冷却至16℃后，加入乙酰胺进行诱导表达培养，诱导Mmp1基因表达，并收集所述分枝杆菌菌体。本发明所述培养的温度优选为12℃～16℃，进一步优选为16℃，时间优选为3～5d，进一步优选为3d。本发明所述乙酰胺的质量体积百分比优选为0.1％～0.2％，进一步优选为0.2％。
[0046]完成所述诱导表达后，本发明优选将收集到的分枝杆菌菌体用于Mmp1蛋白的纯化，得到所述Mmp1蛋白。本发明所述Mmp1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0047]本发明所述纯化优选包括：将所述收集到的分枝杆菌菌体采用binding buffer重悬，进行高压破碎和高速离心，分离得到上清液；将得到的上清液加入含有flag抗体介质的亲和层析柱中层析；等到挂柱流穿结束后采用binding buffer冲洗5个柱体积，然后采用elution buffer对目的蛋白进行洗脱，得到洗脱样；将得到的洗脱样使用超滤管进行浓缩，得到浓缩液，将得到的浓缩液进一步纯化，得到所述Mmp1蛋白。
[0048]本发明所述binding buffer优选为20mM Tris-HCl和200mM NaCl的混合液，pH值为7.4。本发明所述高压破碎的压力优选为1000～1200bar，进一步优选为1000bar，所述高速离心的转速优选为18000rpm，进一步优选为265000×g，离心的时间优选为40min，进一步优选为40min。本发明所述elution buffer优选为20mM Tris-HCl、200mM NaCl和200μg/mLDYKDDDDK多肽混合液，pH值优选为7.4。本发明所述超滤管的截留分子量为100kDa。
[0049]本发明所述进一步纯化优选采用凝胶过滤色谱柱，所述凝胶过滤色谱柱的预装柱优选为Super ose 6Increase 10/300GL。
[0050]得到所述Mmp1蛋白后，本发明优选对Mmp1蛋白进行突变，得到Mmp1突变蛋白。所述突变优选为与野生型Mmp1蛋白相比，所述Mmp1突变蛋白的第171位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸或第60-75位氨基酸缺失。
[0051]本发明还提供了一种Spycatcher-Mmp1蛋白，所述Spycatcher-Mmp1蛋白通过上述方案所述的Mmp1突变蛋白的编码序列与Spycatcher的编码序列融合表达获得。Mmp1突变蛋白N末端连接Spycatcher003，C末端连接Flag标签(DYKDDDDK)。
[0052]本发明还提供了上述方案所述的Mmp1突变蛋白或Spycatcher-Mmp1蛋白在展示多肽或蛋白中的应用。本发明所述多肽优选为含SpyTag的多肽，所述蛋白优选为含SpyTag的蛋白。本发明将所述Mmp1突变蛋白用于展示多肽时，还优选包括对所述Mmp1突变蛋白进行修饰，得到修饰后的Mmp1突变蛋白；所述修饰优选包括在所述Mmp1突变蛋白N末端连接Flag标签(DYKDDDDK)，C末端连接多肽LPXTG。本发明所述Spycatcher-Mmp1蛋白与含有SpyTag的多肽或蛋白优选通过SpyTag/SpyCatcher形成异肽键共价偶联，实现多肽或蛋白的展示。
[0053]本发明还提供了上述方案所述的Mmp1突变蛋白或Spycatcher-Mmp1蛋白在封装外源蛋白中的应用。本发明所述外源蛋白优选包括靶向肽，所述靶向肽的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，具体如下：MTDFHGKTALVTGASAGLGAAVAKLLAARGASVFGIARDADRMAEVFTEVPGGRYASVDISSSQGCDQAVEQCVEQFGQLDTLINVAGFHQMRHTVSVTDEDWAKDLAVNLNGPFFLSRAALPHLLQAGGNIVNVASIAGV。
[0054]本发明所述外源蛋白优选包括绿色荧光蛋白(GFP)。
[0055]为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的Mmp1突变蛋白进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0056]实施例1
[0057]野生型Mmp1蛋白的制备(耻垢表达系统)
[0058]1)获取耻垢分枝杆菌Mmp1基因的DNA序列
[0059]以Mmp1基因的DNA序列(SEQ ID NO.6)为模板设计PCR扩增引物，具体如下：
[0060]上游引物：261-Mmp1-F：TAAGAGAAAGGGAGTCCACATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGatgacgtccgcccagaacg和261-F：TAAGTCGACGTAGTTAACTAGCGTACGATCGACTGC；
[0061]下游引物：261-Mmp1-R：AACTACGTCGACTTAtcactggtactcatggaactgg和261-R：CATGTGGACTCCCTTTCTCTTATCGGGTGGTGGC。
[0062]以野生型的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis mc2155)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系如表1所示，PCR扩增程序为如表2所示：最终得到Mmp1基因的DNA序列(SEQID NO.6)；
[0063]2)构建基因重组表达载体
[0064]将具有flag标签的pMV-261载体与步骤1)得到的Mmp1基因的DNA序列连接，并通过热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将大肠杆菌DH5α感受态细胞涂布在含有50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基中进行筛选，得到含有重组表达载体的阳性菌株；
[0065]其中pMV-261载体线性化的引物为：
[0066]上游引物：261-F：TAAGTCGACGTAGTTAACTAGCGTACGATCGACTGC；
[0067]下游引物：261-R：CATGTGGACTCCCTTTCTCTTATCGGGTGGTGGC。
[0068]扩增体系同表1中的扩增体系，扩增程序同表2中的扩增程序。
[0069]3)提取阳性菌株的质粒、测序
[0070]大肠杆菌中pMV-261-N-flag-Mmp1重组质粒的提取是依据碱裂解法原理，采用市场上成熟的天根试剂盒进行提取的。具体步骤是：第一步，将1～5mL菌液，加入离心管中，12000rpm(～13400xg)离心1min，收集沉淀。第二部，向沉淀中加入250μL溶液P1(含RnaseA)，悬浮细菌沉淀。第三步，向离心管中加入250μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。第四步，向离心管中加入250μL溶液P3，立刻温和的上下翻转6-8次，充分混匀，出现白色沉淀后12000rpm离心10min。第五步，将上一步收集的上清液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉废液并将吸附柱放入收集管中。第六步，向吸附柱中加入600μL漂洗液12000rpm离心1min，此步重复2次。第七步，将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附柱中滴加50μL 65℃预热的蒸馏水，室温放置2min，然后12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。接下来将提取的质粒送去金唯智测序公司测序。
[0071]4)Mmp1基因的诱导表达
[0072]将步骤3)中测序成功的重组质粒通过电转仪转化到耻垢分枝杆菌M.smegmatismc2155感受态细胞中，复苏2h后，涂布在含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL羧苄青霉素的固体LB培养基中，37℃单克隆培养2～3天，得到单克隆菌体；挑取得到的单克隆菌体接种至含有含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL羧苄青霉素和0.01％吐温80的液体LB培养基(5mL)中培养24～48h，然后转接到含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL羧苄青霉素和0.01％吐温80的液体LB培养基(1L)中扩大培养，培养至菌液的浓度OD600＝0.8为止；然后将扩大培养后的菌液冷却至16℃，在培养基中加入0.2％(w/v)的乙酰胺诱导Mmp1基因的表达，同时加入0.2mM的磷酸吡哆醛作为辅助因子，16℃培养3～5d后收集菌体；
[0073]5)Mmp1蛋白的纯化
[0074]将步骤4)收集的菌体用bindingbuffer(20mM Tris-HCl pH7.4，200mMNaCl)重悬，并进行高压破碎，压力为1000bar；将破碎后的菌体进行离心，离心的转速为26500×g，时间为40min，将得到的上清液加入到含有抗flag抗体介质的亲和层析柱中，挂柱流穿结束后用bindingbuffer冲洗五个柱体积，然后用elution buffer(20mM Tris-HCl pH7.4，200mMNaCl，200μg/mLDYKDDDDK)对目的蛋白进行洗脱；将洗脱样使用超滤管进行浓缩，超滤管的截留分子量为100kDa；将浓缩后的洗脱样使用凝胶过滤色谱柱(Superose 6Increase 10/300GL column)进一步纯化，得到野生型Mmp1蛋白(蛋白序列如SEQ ID NO.5所示)，结果如图1所示。
[0075]通过对实施例1得到的野生型Mmp1蛋白进行纳米隔室的三维结构分析，再结合生化分析发现定点突变171位的赖氨酸(K)和敲除60-75位loop区域后，野生型Mmp1蛋白可以稳定地组装成直径为20nm、颗粒大小均一的纳米隔室(T＝1)。
[0076]实施例2
[0077]采用大肠杆菌表达系统，在大肠杆菌表达系统中纯化突变蛋白的流程与实施例1中野生型Mmp1纯化流程相同。
[0078]一种Mmp1突变蛋白，与实施例1得到的野生型Mmp1蛋白相比，Mmp1突变蛋白的第171位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸或第60-75位氨基酸缺失；
[0079]上述Mmp1突变蛋白的获取过程，具体步骤如下：
[0080]具体实验方案：
[0081]Mmp1突变蛋白的K171A和Δ60-75的核苷酸序列如下：
[0082]Mmp1(K171A)：5’-ATGACGTCCGCCCAGAACGAATCGCAGGCCCTCGGAGATCTCGCCGCACGGCAACTCGCGAACGCGACCAAGACAGTTCCCCAGCTGTCGACCATCACGCCGCGGTTCCTGCTGCACCTGCTCAGCTGGGTTCCTGTGGAGGCCGGTATCTACCGGGTGAACCGTGTGGTCAACCCCGACCGGGTGGCGATCCACTCCGAGGCGGGCGCGGGTACCGAGGAACCGCTGCCCGAGACCTACGTCGACTACGAGACCCATCCGCGCGAGTACACGTTGCGGTCCATCTCGACGCTGCTCGACGTGCACACCCGTGTCTCGGACCTGTACTCCAGCCCGCACGACCAGGTCACCCAGCAGTTGCGGCTGACCATCGAGACCATCAAGGAGCGCCAGGAGTACGAACTGGTCAACAACCCCGAATACGGGTTGCTGGCGCAGGCGACGCCCGAGCAGACCATCCAGACCCTGGCCGGCGCCCCGACCCCCGACGATCTCGACGCGCTGATCACCGCGGTGTGGAAGACACCCGCGTTCTTCCTGACCCATCCGCTGGGCGTGGCCGCTTTCGGCCGGGAGTGCACCTACCGCGGTGTGCCGCCGCCAACCGTGAGCATGTACGGCGCCCAGTTCATCACGTGGCGCGGCATCCCGATCGTGCCGAGCGACAAGGTGCCCGTCGAGGACGGCACGACCAAGTTCGTCCTCGTGCGCACCGGTGAGGAGCGCCAAGGCGTGGTCGGCCTGTTCCAGCCCGGATTGGTCGGTGAGCAGGCGCCGGGTCTGTCCGTGCGCTTCACGGGCATCAACCGGTCGGCCATCGCGTCGTACCTGGTGACGCTCTACACGTCGCTCGCGGTGCTGACCGACGACGCACTCGCCGTCCTCGACGGCGTCGCCGTGGACCAGTTCCATGAGTACCAGGGGGGTAGCGATTACAAGGATGACGACGATAAGTGA-3’(SEQID NO.8)；
[0083]Mmp1(Δ60-75)：5’-ATGACGTCCGCCCAGAACGAATCGCAGGCCCTCGGAGATCTCGCCGCACGGCAACTCGCGAACGCGACCAAGACAGTTCCCCAGCTGTCGACCATCACGCCGCGGTTCCTGCTGCACCTGCTCAGCTGGGTTCCTGTGGAGGCCGGTATCTACCGGGTGAACCGTGTGGTCAACCCCCTGCCCGAGACCTACGTCGACTACGAGACCCATCCGCGCGAGTACACGTTGCGGTCCATCTCGACGCTGCTCGACGTGCACACCCGTGTCTCGGACCTGTACTCCAGCCCGCACGACCAGGTCACCCAGCAGTTGCGGCTGACCATCGAGACCATCAAGGAGCGCCAGGAGTACGAACTGGTCAACAACCCCGAATACGGGTTGCTGGCGCAGGCGACGCCCGAGCAGACCATCCAGACCCTGGCCGGCGCCCCGACCCCCGACGATCTCGACGCGCTGATCACCAAGGTGTGGAAGACACCCGCGTTCTTCCTGACCCATCCGCTGGGCGTGGCCGCTTTCGGCCGGGAGTGCACCTACCGCGGTGTGCCGCCGCCAACCGTGAGCATGTACGGCGCCCAGTTCATCACGTGGCGCGGCATCCCGATCGTGCCGAGCGACAAGGTGCCCGTCGAGGACGGCACGACCAAGTTCGTCCTCGTGCGCACCGGTGAGGAGCGCCAAGGCGTGGTCGGCCTGTTCCAGCCCGGATTGGTCGGTGAGCAGGCGCCGGGTCTGTCCGTGCGCTTCACGGGCATCAACCGGTCGGCCATCGCGTCGTACCTGGTGACGCTCTACACGTCGCTCGCGGTGCTGACCGACGACGCACTCGCCGTCCTCGACGGCGTCGCCGTGGACCAGTTCCATGAGTACCAGGGGGGTAGCGATTACAAGGATGACGACGATAAGTGA-3’(SEQ ID NO.9)。
[0084]Mmp1突变蛋白的K171A和Δ60-75的氨基酸序列分别如下：
[0085]Mmp1(K171A)：MTSAQNESQALGDLAARQLANATKTVPQLSTITPRFLLHLLSWVPVEAGIYRVNRVVNPDRVAIHSEAGAGTEEPLPETYVDYETHPREYTLRSISTLLDVHTRVSDLYSSPHDQVTQQLRLTIETIKERQEYELVNNPEYGLLAQATPEQTIQTLAGAPTPDDLDALITAVWKTPAFFLTHPLGVAAFGRECTYRGVPPPTVSMYGAQFITWRGIPIVPSDKVPVEDGTTKFVLVRTGEERQGVVGLFQPGLVGEQAPGLSVRFTGINRSAIASYLVTLYTSLAVLTDDALAVLDGVAVDQFHEYQGGSDYKDDDDK(SEQ ID NO.10)；
[0086]Mmp1(Δ60-75)：MTSAQNESQALGDLAARQLANATKTVPQLSTITPRFLLHLLSWVPVEAGIYRVNRVVNPLPETYVDYETHPREYTLRSISTLLDVHTRVSDLYSSPHDQVTQQLRLTIETIKERQEYELVNNPEYGLLAQATPEQTIQTLAGAPTPDDLDALITKVWKTPAFFLTHPLGVAAFGRECTYRGVPPPTVSMYGAQFITWRGIPIVPSDKVPVEDGTTKFVLVRTGEERQGVVGLFQPGLVGEQAPGLSVRFTGINRSAIASYLVTLYTSLAVLTDDALAVLDGVAVDQFHEYQGGSDYKDDDDK(SEQ ID NO.11)。
[0087]由图2可以得出：对Mmp1蛋白进行定点突变和缺失突变后，分子筛和负染电镜结果发现Mmp1(K171A)和(Δ60-75)可以形成稳定的直径为20nm、颗粒大小均一的纳米隔室。
[0088]应用例1
[0089]实施例2得到Mmp1突变蛋白在展示多肽或蛋白中的应用
[0090]将实施例2得到的Mmp1突变蛋白的N末端连接上Flag标签(DYKDDDDK)，C末端连接上多肽LPXTG进行体外重组表达。
[0091]具体实验方法如下：
[0092]1.通过分子克隆方法将Mmp1突变基因N-flag-Mmp1-LPXTG构建至重组质粒pCDFDuet-1-N-flag-Mmp1-LPETG。N-flag-Mmp1-LPXTG碱基序列如下：5’-ATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGacgtccgcccagaacgaatcgcaggccctcggagatctcgccgcacggcaactcgcgaacgcgaccaagacagttccccagctgtcgaccatcacgccgcggttcctgctgcacctgctcagctgggttcctgtggaggccggtatctaccgggtgaaccgtgtggtcaaccccgaccgggtggcgatccactccgaggcgggcgcgggtaccgaggaaccgctgcccgagacctacgtcgactacgagacccatccgcgcgagtacacgttgcggtccatctcgacgctgctcgacgtgcacacccgtgtctcggacctgtactccagcccgcacgaccaggtcacccagcagttgcggctgaccatcgagaccatcaaggagcgccaggagtacgaactggtcaacaaccccgaatacgggttgctggcgcaggcgacgcccgagcagaccatccagaccctggccggcgccccgacccccgacgatctcgacgcgctgatcaccaaggtgtggaagacacccgcgttcttcctgacccatccgctgggcgtggccgctttcggccgggagtgcacctaccgcggtgtgccgccgccaaccgtgagcatgtacggcgcccagttcatcacgtggcgcggcatcccgatcgtgccgagcgacaaggtgcccgtcgaggacggcacgaccaagttcgtcctcgtgcgcaccggtgaggagcgccaaggcgtggtcggcctgttccagcccggattggtcggtgagcaggcgccgggtctgtccgtgcgcttcacgggcatcaaccggtcggccatcgcgtcgtacctggtgacgctctacacgtcgctcgcggtgctgaccgacgacgcactcgccgtcctcgacggcgtcgccgtggaccagttccatgagtaccagGGGGGTAGCGGGGGTAGCctgccggagacgggcTGA-3’(SEQ ID NO.12)。
[0093]氨基酸序列如下：MDYKDDDDKTSAQNESQALGDLAARQLANATKTVPQLSTITPRFLLHLLSWVPVEAGIYRVNRVVNPDRVAIHSEAGAGTEEPLPETYVDYETHPREYTLRSISTLLDVHTRVSDLYSSPHDQVTQQLRLTIETIKERQEYELVNNPEYGLLAQATPEQTIQTLAGAPTPDDLDALITKVWKTPAFFLTHPLGVAAFGRECTYRGVPPPTVSMYGAQFITWRGIPIVPSDKVPVEDGTTKFVLVRTGEERQGVVGLFQPGLVGEQAPGLSVRFTGINRSAIASYLVTLYTSLAVLTDDALAVLDGVAVDQFHEYQGGSGGSLPETG(SEQ ID NO.13)。
[0094]2.将上述测序成功的重组质粒转化至大肠杆菌(BL21(DE3))中表达纯化，结果如图3所示。由图3可以得出：通过凝胶过滤层析、SDS-PAGE分析和负染电镜观察发现，Mmp1亚基的C末端连接上多肽LPXTG后可以形成正二十面体球蛋白。
[0095]应用例2
[0096]一种Spycatcher-Mmp1蛋白，将编码实施例2中Mmp1突变蛋白的DNA片段与Spycatcher的编码序列融合表达获得，具体步骤如下：
[0097]1、通过分子克隆方法将Mmp1突变基因N-Spycatcher-Mmp1-flag构建至重组质粒得到pCDFDuet-1-N-Spycatcher-Mmp1-flag。
[0098]N-Spycatcher-Mmp1-flag基因的核苷酸序列如下：5’-atgggttcaagtgtaaccaccttatcaggtttatcaggtgaacaaggtccgtccggtgatatgacaactgaagaagatagtgctacccatattaaattctcaaaacgtgatgaggacggccgtgagttagctggtgcaactatggagttgcgtgattcatctggtaaaactattagtacatggatttcagatggacatgtgaaggatttctacctgtatccaggaaaatatacatttgtcgaaaccgcagcaccagacggttatgaggtagcaactccaattgaatttacagttaatgaggacggtcaggttactgtagatggtgaagcaactgaaggtgacgctcatactgggggctcagggggatctggcggctctggcggttcaacgtccgcccagaacgaatcgcaggccctcggagatctcgccgcacggcaactcgcgaacgcgaccaagacagttccccagctgtcgaccatcacgccgcggttcctgctgcacctgctcagctgggttcctgtggaggccggtatctaccgggtgaaccgtgtggtcaaccccgaccgggtggcgatccactccgaggcgggcgcgggtaccgaggaaccgctgcccgagacctacgtcgactacgagacccatccgcgcgagtacacgttgcggtccatctcgacgctgctcgacgtgcacacccgtgtctcggacctgtactccagcccgcacgaccaggtcacccagcagttgcggctgaccatcgagaccatcaaggagcgccaggagtacgaactggtcaacaaccccgaatacgggttgctggcgcaggcgacgcccgagcagaccatccagaccctggccggcgccccgacccccgacgatctcgacgcgctgatcaccaaggtgtggaagacacccgcgttcttcctgacccatccgctgggcgtggccgctttcggccgggagtgcacctaccgcggtgtgccgccgccaaccgtgagcatgtacggcgcccagttcatcacgtggcgcggcatcccgatcgtgccgagcgacaaggtgcccgtcgaggacggcacgaccaagttcgtcctcgtgcgcaccggtgaggagcgccaaggcgtggtcggcctgttccagcccggattggtcggtgagcaggcgccgggtctgtccgtgcgcttcacgggcatcaaccggtcggccatcgcgtcgtacctggtgacgctctacacgtcgctcgcggtgctgaccgacgacgcactcgccgtcctcgacggcgtcgccgtggaccagttccatgagtaccaggggggtagcgattacaaggatgacgacgataagtga-3’(SEQ ID NO.14)；
[0099]氨基酸序列如下：MGSSVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATPIEFTVNEDGQVTVDGEATEGDAHTGGSGGSGGSGGSTSAQNESQALGDLAARQLANATKTVPQLSTITPRFLLHLLSWVPVEAGIYRVNRVVNPDRVAIHSEAGAGTEEPLPETYVDYETHPREYTLRSISTLLDVHTRVSDLYSSPHDQVTQQLRLTIETIKERQEYELVNNPEYGLLAQATPEQTIQTLAGAPTPDDLDALITKVWKTPAFFLTHPLGVAAFGRECTYRGVPPPTVSMYGAQFITWRGIPIVPSDKVPVEDGTTKFVLVRTGEERQGVVGLFQPGLVGEQAPGLSVRFTGINRSAIASYLVTLYTSLAVLTDDALAVLDGVAVDQFHEYQGGSDYKDDDDK(SEQ ID NO.15)。
[0100]将上述测序成功的重组质粒转化至大肠杆菌(BL21(DE3))中表达纯化，结果如图4所示，根据图4可以得出应用SpyTag/SpyCatcher形成异肽键偶联，将蛋白质组装和化学反应结合构建具有新功能Spycatcher-Mmp1蛋白结构，即Mmp1融合表达Spycatcher可用于展示含SpyTag的多肽或蛋白。
[0101]应用例3
[0102]将外源GFP蛋白融合一段靶标肽(内源货物蛋白SufS的1-141位氨基酸MSTSEYRSLNAESDLPISADELSALATQLFAAGIRPGPDTPPQTAPVAPRGNVPGTAHPVAPPTEFVAVPSAVWSVPAHTSPVPEPVAPQTDPLVPPGVADLTAFTVPGGIVPTLPGVLAGARTAVPAAESPDYYFLRDTR(SEQ ID NO.16)或者1-155位氨基酸MSTSEYRSLNAESDLPISADELSALATQLFAAGIRPGPDTPPQTAPVAPRGNVPGTAHPVAPPTEFVAVPSAVWSVPAHTSPVPEPVAPQTDPLVPPGVADLTAFTVPGGIVPTLPGVLAGARTAVPAAESPDYYFLRDTRAHQPVPQFPDRHEI(SEQ ID NO.17)位disorder区肽段)后，证明实施例2得到的Mmp1突变蛋白内部可以封装外源蛋白。
[0103]具体实验方法：
[0104]1.通过分子克隆方法将Mmp1-flag基因和N-domain-GFP构建至重组质粒pCDFDuet-1-Mmp1-flag+N-domain-GFP。
[0105]Mmp1-flag基因碱基序列如下：
[0106]5’-atgacgtccgcccagaacgaatcgcaggccctcggagatctcgccgcacggcaactcgcgaacgcgaccaagacagttccccagctgtcgaccatcacgccgcggttcctgctgcacctgctcagctgggttcctgtggaggccggtatctaccgggtgaaccgtgtggtcaaccccgaccgggtggcgatccactccgaggcgggcgcgggtaccgaggaaccgctgcccgagacctacgtcgactacgagacccatccgcgcgagtacacgttgcggtccatctcgacgctgctcgacgtgcacacccgtgtctcggacctgtactccagcccgcacgaccaggtcacccagcagttgcggctgaccatcgagaccatcaaggagcgccaggagtacgaactggtcaacaaccccgaatacgggttgctggcgcaggcgacgcccgagcagaccatccagaccctggccggcgccccgacccccgacgatctcgacgcgctgatcaccaaggtgtggaagacacccgcgttcttcctgacccatccgctgggcgtggccgctttcggccgggagtgcacctaccgcggtgtgccgccgccaaccgtgagcatgtacggcgcccagttcatcacgtggcgcggcatcccgatcgtgccgagcgacaaggtgcccgtcgaggacggcacgaccaagttcgtcctcgtgcgcaccggtgaggagcgccaaggcgtggtcggcctgttccagcccggattggtcggtgagcaggcgccgggtctgtccgtgcgcttcacgggcatcaaccggtcggccatcgcgtcgtacctggtgacgctctacacgtcgctcgcggtgctgaccgacgacgcactcgccgtcctcgacggcgtcgccgtggaccagttccatgagtaccaggggggtagcgattacaaggatgacgacgataagtga-3’(SEQ ID NO.18)；
[0107]Mmp1-flag氨基酸碱基序列如下：
[0108]MTSAQNESQALGDLAARQLANATKTVPQLSTITPRFLLHLLSWVPVEAGIYRVNRVVNPDRVAIHSEAGAGTEEPLPETYVDYETHPREYTLRSISTLLDVHTRVSDLYSSPHDQVTQQLRLTIETIKERQEYELVNNPEYGLLAQATPEQTIQTLAGAPTPDDLDALITKVWKTPAFFLTHPLGVAAFGRECTYRGVPPPTVSMYGAQFITWRGIPIVPSDKVPVEDGTTKFVLVRTGEERQGVVGLFQPGLVGEQAPGLSVRFTGINRSAIASYLVTLYTSLAVLTDDALAVLDGVAVDQFHEYQGGSDYKDDDDK(SEQ IDNO.19)；
[0109]N-domain-GFP碱基序列如下：
[0110]5’-atgagtaccagtgagtaccgctcgttgaatgccgagagcgatctgccgatcagcgccgacgaactctcggcgctggccacgcagttgttcgccgcaggcatccggccgggtcccgacacaccgcctcagaccgctccggtcgcaccgcgcggcaacgtgccgggtaccgcgcatccggtggccccgcccacggaattcgtggctgtgccgtcggccgtatggtccgtgccggcgcacacttcaccggtcccggaacctgttgcaccacagaccgatcccctggtcccgccgggagtggcggatctgacggcgttcacggtgcccggcggtatcgtcccgacacttcccggtgtgctggccggcgcacgcacggccgtgcctgccgccgagtcgcccgactactacttcctgcgggacacacgcgcacatcagcccgtgcctcagtttcccgaccgccacgagatcatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa-3’(SEQ ID NO.20)；
[0111]N-domain-GFP氨基酸序列如下：
[0112]MSTSEYRSLNAESDLPISADELSALATQLFAAGIRPGPDTPPQTAPVAPRGNVPGTAHPVAPPTEFVAVPSAVWSVPAHTSPVPEPVAPQTDPLVPPGVADLTAFTVPGGIVPTLPGVLAGARTAVPAAESPDYYFLRDTRAHQPVPQFPDRHEIMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK(SEQ ID NO.21)；
[0113]重组质粒的碱基序列如下：
[0114]5’-GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGagtaccagtgagtaccgctcgttgaatgccgagagcgatctgccgatcagcgccgacgaactctcggcgctggccacgcagttgttcgccgcaggcatccggccgggtcccgacacaccgcctcagaccgctccggtcgcaccgcgcggcaacgtgccgggtaccgcgcatccggtggccccgcccacggaattcgtggctgtgccgtcggccgtatggtccgtgccggcgcacacttcaccggtcccggaacctgttgcaccacagaccgatcccctggtcccgccgggagtggcggatctgacggcgttcacggtgcccggcggtatcgtcccgacacttcccggtgtgctggccggcgcacgcacggccgtgcctgccgccgagtcgcccgactactacttcctgcgggacacacgcgcacatcagcccgtgcctcagtttcccgaccgccacgagatcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGacgtccgcccagaacgaatcgcaggccctcggagatctcgccgcacggcaactcgcgaacgcgaccaagacagttccccagctgtcgaccatcacgccgcggttcctgctgcacctgctcagctgggttcctgtggaggccggtatctaccgggtgaaccgtgtggtcaaccccgaccgggtggcgatccactccgaggcgggcgcgggtaccgaggaaccgctgcccgagacctacgtcgactacgagacccatccgcgcgagtacacgttgcggtccatctcgacgctgctcgacgtgcacacccgtgtctcggacctgtactccagcccgcacgaccaggtcacccagcagttgcggctgaccatcgagaccatcaaggagcgccaggagtacgaactggtcaacaaccccgaatacgggttgctggcgcaggcgacgcccgagcagaccatccagaccctggccggcgccccgacccccgacgatctcgacgcgctgatcaccaaggtgtggaagacacccgcgttcttcctgacccatccgctgggcgtggccgctttcggccgggagtgcacctaccgcggtgtgccgccgccaaccgtgagcatgtacggcgcccagttcatcacgtggcgcggcatcccgatcgtgccgagcgacaaggtgcccgtcgaggacggcacgaccaagttcgtcctcgtgcgcaccggtgaggagcgccaaggcgtggtcggcctgttccagcccggattggtcggtgagcaggcgccgggtctgtccgtgcgcttcacgggcatcaaccggtcggccatcgcgtcgtacctggtgacgctctacacgtcgctcgcggtgctgaccgacgacgcactcgccgtcctcgacggcgtcgccgtggaccagttccatgagtaccagGGGGGTAGCGATTACAAGGATGACGACGATAAGTGAtgaTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCATCGTGGCCGGATCTTGCGGCCCCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGCTAGCTCACTCGGTCGCTACGCTCCGGGCGTGAGACTGCGGCGGGCGCTGCGGACACATACAAAGTTACCCACAGATTCCGTGGATAAGCAGGGGACTAACATGTGAGGCAAAACAGCAGGGCCGCGCCGGTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCTCCTGCCAGAGTTCACATAAACAGACGCTTTTCCGGTGCATCTGTGGGAGCCGTGAGGCTCAACCATGAATCTGACAGTACGGGCGAAACCCGACAGGACTTAAAGATCCCCACCGTTTCCGGCGGGTCGCTCCCTCTTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGTTTACCGGATACCTGTTCCGCCTTTCTCCCTTACGGGAAGTGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACACACTGGTATCTCGGCTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTAAGCAAGAACTCCCCGTTCAGCCCGACTGCTGCGCCTTATCCGGTAACTGTTCACTTGAGTCCAACCCGGAAAAGCACGGTAAAACGCCACTGGCAGCAGCCATTGGTAACTGGGAGTTCGCAGAGGATTTGTTTAGCTAAACACGCGGTTGCTCTTGAAGTGTGCGCCAAAGTCCGGCTACACTGGAAGGACAGATTTGGTTGCTGTGCTCTGCGAAAGCCAGTTACCACGGTTAAGCAGTTCCCCAACTGACTTAACCTTCGATCAAACCACCTCCCCAGGTGGTTTTTTCGTTTACAGGGCAAAAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACTGAACCGCTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATTAATACGACTCACTATA-3’(SEQ ID NO.22)。
[0115]将上述测序成功的重组质粒转化至大肠杆菌(BL21(DE3))中表达纯化，Mmp1封装外源蛋白GFP预装柱分析结果和电镜负染结果由图5所示，可见通过凝胶过滤层析、SDS-PAGE分析和负染电镜观察发现，添加货物蛋白SufS无序区(1-155aa)的GFP可以被Mmp1蛋白封装形成正二十面体球蛋白。
[0116]由以上实施例可知，本发明提供了一种Mmp1突变蛋白及其应用，本发明在耻垢分枝杆菌中分离纯化出Mmp1蛋白，并首次发现了Mmp1蛋白定点突变171位的赖氨酸(K)或敲除60-75位loop区域，可以稳定地组装成直径为20nm、颗粒大小均一的纳米隔室(T＝1)，然后经过基因重组技术，以及构建Spycatcher-Mmp1蛋白结构，可以实现在纳米颗粒表面进行多肽或蛋白的展示，且将外源蛋白融合一段前导肽后，可以使Mmp1突变蛋白封装外源蛋白，为新型纳米颗粒疫苗研发和药物递送上提供了良好的应用价值。
[0117]尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。