【請求項1】
（i）配列番号1、配列番号3、および配列番号5の配列を含むか、または上記配列からなるHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号7、配列番号9、および配列番号11の配列を含むか、または上記配列からなるLCDR1、LCDR2、およびLCDR3、または
（ii）配列番号1、配列番号3、および配列番号51の配列を含むか、または上記配列からなるHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号7、配列番号9、および配列番号53の配列を含むか、または上記配列からなるLCDR1、LCDR2、およびLCDR3、または
（iii）配列番号1、配列番号3、および配列番号52の配列を含むか、または上記配列からなるHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号7、配列番号9、および配列番号54の配列を含むか、または上記配列からなるLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、CD40に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】 重鎖可変領域VHおよび軽鎖可変領域VLを含む、CD40に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
(i)重鎖可変領域VHは、配列番号13のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、および軽鎖可変領域VLは、配列番号15のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
(ii)重鎖可変領域VHは、配列番号58のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、および軽鎖可変領域VLは、配列番号64のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
(iii)重鎖可変領域VHは、配列番号60のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、および軽鎖可変領域VLは、配列番号66のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、または
(iv)重鎖可変領域VHは、配列番号62のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、および軽鎖可変領域VLは、配列番号66のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、
抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
(i)重鎖は、配列番号17、18または19のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、および軽鎖は、配列番号21のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
(ii)重鎖は、配列番号67のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、および軽鎖は、配列番号68のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、または
(iii)重鎖は、配列番号69または70のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、および軽鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1～3のいずれか1項に記載のCD40に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体がヒト化抗体またはヒト抗体またはキメラ抗体である、請求項1～4のいずれか1項に記載のCD40に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗原結合断片は、Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、単鎖抗体または（Fab’） 2 、diabody（dAb）または直鎖抗体から選択される抗体断片である、請求項1～5のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
請求項1～6のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸。
【請求項8】
請求項7に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項9】
請求項7に記載の核酸または請求項8に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項10】
CD40に結合する抗体またはその抗原結合性断片を調製する方法であって、前記抗体の発現に適した条件下で、請求項1～6のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、前記宿主細胞から前記抗体またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む方法。
【請求項11】
請求項1～6のいずれか1項に記載のCD40に結合する抗体またはその抗原結合断片と、追加の物質とを含み、ここで、前記追加の物質は治療薬またはマーカーである、免疫抱合体。
【請求項12】
請求項1～6のいずれか1項に記載のCD40に結合する抗体またはその抗原結合断片、または請求項11に記載の免疫抱合体を含む、医薬組成物。
【請求項13】 薬用補助剤をさらに含む、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項14】
請求項1～6のいずれか1項に記載のCD40に結合する抗体またはその抗原結合断片、または請求項11に記載の免疫抱合体と、1つ以上のその他の治療薬と、を含む、組合製品。
【請求項15】
前記治療剤は、化学療法剤、その他の抗体、細胞毒性薬剤、ワクチン、抗感染活性薬剤、低分子薬物または免疫調節剤から選択される、請求項14に記載の組合製品。
【請求項16】 免疫応答を増強するための、または、被験体における免疫応答の増強を必要とする被験体の疾患または被験体におけるCD40関連疾患を予防または治療するための医薬の製造における、請求項1～6のいずれか1項に記載のCD40に結合する抗体またはその抗原結合性断片、請求項11に記載の免疫抱合体、または請求項12もしくは13に記載の医薬組成物の使用。
【請求項17】 免疫応答が抗原特異的T細胞応答である、請求項16に記載の使用。
【請求項18】 前記疾患は、腫瘍または感染である、請求項16に記載の使用。
【請求項19】 前記腫瘍は、リンパ腫、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、肺がん、肝がん、胃がんおよびそれらの転移性がんである、または、前記感染は慢性感染もしくはウイルス感染である、請求項18に記載の使用。
【請求項20】 請求項16～19のいずれか1項に記載の使用であって、
前記医薬は、１以上の療法と組み合わせて被験体に投与され、ここで前記療法は、治療方法および/またはその他の治療薬である、
使用。
【請求項21】 前記治療方法は、手術療法および/または放射線療法を含み、および/またはその他の治療薬は化学療法剤、その他の抗体、細胞毒性薬剤、ワクチン、抗感染活性薬剤、低分子薬物または免疫調節剤から選択される、請求項20に記載の使用。
【請求項22】
請求項1～6のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項11に記載の免疫抱合体、を含む、検出キット。

[背景技术]

【0001】
本发明涉及特异性结合CD40的新抗体和抗体片段,以及含有所述抗体或抗体片段的组合物、药物、组合产品或试剂盒。 本发明还涉及编码抗体或其抗体片段的核酸和含有它们的宿主细胞,以及相关用途。 此外,本发明涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。
【0002】
T 细胞的完全激活需要两个信号。 抗原呈递细胞(APC)摄取肿瘤抗原,对其进行加工,形成MHC(抗原复合物),将其呈递给T细胞,并与T细胞表面的TCR结合,这是T细胞激活的第一个信号。是。 第二或共刺激信号通过 CD28 和 B7-1(CD80)/B7-2(CD86) 及其配体与共刺激因子 CD40、OX40、GITR 等的相互作用来传递。 (Smith -Garvin, J.E., G.A. Koretzky ,和 M.S. Jordan,T 细胞激活,2009 年。27:p.591-619)。 在缺乏共刺激信号的情况下,T细胞在抗原刺激后会变得无反应(无反应)或发生程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
CD40是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员,主要存在于各种抗原呈递细胞中,如B细胞、树突状细胞(DC细胞)、单核细胞和巨噬细胞(Grewal、I.S.和R.A. Flavell,细胞中的CD40和CD154) -介导的免疫。免疫学年鉴,1998。16:p.111-35)。 CD40在细胞表面形成三聚体,相应的配体CD40L(即CD154)主要表达在活化的T细胞表面。 CD40 和 CD40L 的相互作用是 T 细胞激活的共刺激信号。 根据特定的细胞类型,CD40 参与产生特定基因表达模式的效应。 T 细胞上 CD40L 和 CD40 的结合可激活 NF-κB(核因子 κB)、MAPK(丝裂原激活蛋白激酶)和 STAT3(信号转导器和转录激活剂 3)等通路(Rothe, M., et al. ,TRAF2 介导的 TNF 受体 2 和 CD40 激活 NF-κ B,《科学》,1995。269(5229):第 1424-7 页。
CD40不仅由正常免疫细胞表达,而且由许多恶性细胞表达。 具体而言,CD40 与 B 系 NHL、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、毛细胞白血病 (HCL)、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及膀胱癌、肾癌、卵巢癌和儿童癌相关,在宫颈癌中过度表达。 、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑色素瘤等(Hassan, S.B, et al., 抗 CD40 介导的癌症免疫治疗:最近和正在进行的临床试验的更新。Immunopharmacol 免疫毒理学,2014.36(2): p .96-104)。
CD40 激动剂抗体可以通过多种机制对抗肿瘤细胞,包括: 首先,CD40激动剂抗体通过激活免疫系统介导更强的抗肿瘤作用。 具体而言,CD40 激动剂抗体可以激活 DC 细胞并增加其抗原呈递能力,这与癌症免疫治疗中 B7 家族(CD80、CD86)和白细胞介素等共刺激分子的表达增加有关。 18:第 245-73 页)。 CD40 激动剂抗体促进静息 B 细胞增殖、免疫球蛋白类别转换、抗体分泌,并影响生发中心发育和记忆 B 细胞存活,这些对于体液免疫反应至关重要(Beatty、G.L.、Y. Li 和 K.B. Long,癌症免疫治疗:通过 CD40 激动剂激活先天性和适应性免疫。Expert Rev Anticancer Ther,2017。17(2):p.175-186)。 其次,与肿瘤细胞表面表达的 CD40 结合后,CD40 激动剂抗体介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC),并直接从自然杀伤细胞中去除高表达 CD40 的肿瘤细胞(Vonderheide, R.H. 和 M.J. Glennie,Agonistic CD40)。抗体和癌症治疗。临床癌症研究,2013。19(5):p.1035-43)。 第三,CD40激动剂抗体与肿瘤细胞表面表达的CD40结合后,例如CD40/CD40L信号通路抑制肿瘤细胞的细胞周期,使细胞阻滞在G2-M期,此外,CD40/ CD40L相互作用可以促进肿瘤细胞表面Fas表达增加,抑制高表达CD40的肿瘤细胞的生长,并通过Fas/FasL信号通路促进细胞凋亡(Eliopoulos, A.G.等人,CD40诱导细胞凋亡通过激活肿瘤坏死因子超家族的细胞毒性配体来杀伤癌细胞。Mol Cell Biol,2000.20(15):p.5503-15)。
CD40激动剂抗体根据其激动剂形式分为两种不同类型: 第一类CD40激动剂活性不依赖于Fc受体的交联(例如CP-870893和CDX-1140),但尽管前者显示出令人鼓舞的抗癌作用,但剂量限制性毒性可能导致全身性紊乱免疫功能与静脉血栓栓塞和细胞因子释放综合征(CRS)的发生有关。 另一种类型的 CD40 激动剂活性需要 Fc 受体交联。 肿瘤组织及肿瘤引流淋巴结周围存在较多的肿瘤相关炎症细胞,FcγR2b受体更加集中在肿瘤细胞周围。 因此,这种“交联抗体”激动剂将具有更高的组织选择性,使得抗体在肿瘤微环境中产生明显的激动作用,而在正常组织部位则具有较小的作用能力,因此可以提高治疗的安全性。金额保持在较低水平。
因此,虽然该领域已经存在CD40抗体如辉瑞制药的CP870893,但新的CD40抗体具有与现有抗体相当或更好的特性,尤其是依赖于Fc受体交联的CD40抗体,特别是具有更好的抗癌特性和需要更高的安全性。

[发明概要]

【0003】
因此,本发明提供了结合CD40(特别是人CD40或恒河猴CD40)的新抗体及其抗原结合片段。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH),其中所述VH是
(i)包含如SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的VH中包含的三个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3,
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 区域中),或
(iii)相对于(i)中的序列,HCDR3含有至少1个且不超过3个、2个或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL),其中所述VL是
[0072] (i)包含如SEQ ID NO: 15、64、66或16所示的VL中包含的三个互补决定区(CDR) LCDRl、LCDR2、LCDR3,
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 区域中),或
(iii)LCDR3相对于(i)中的序列含有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL。
(a) VH 是
(i)包含如SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的VH中包含的三个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3,
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 区域中),
(iii)HCDR3相对于(i)中的序列含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代),和/或
(b) 所述VL为
[0072] (i)包含如SEQ ID NO: 15、64、66或16所示的VL中包含的三个互补决定区(CDR) LCDRl、LCDR2、LCDR3,
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 区域中),或
(iii)LCDR3相对于(i)中的序列含有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区VH和/或轻链可变区VL。
(a) VH 是
(i)包含如SEQ ID NO:13、58、60或62所示的VH中包含的三个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3,或
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 区域中),
(iii)HCDR3相对于(i)中的序列含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代),和/或
(b) 所述VL为
[0072] (i)包含如SEQ ID NO: 15、64或66所示的VL中包含的三个互补决定区(CDR) LCDR1、LCDR2、LCDR3,
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 区域中),或
(iii)LCDR3相对于(i)中的序列含有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL。
(a) VH 是
(i)含有如SEQ ID NO:14所示的VH中所含的三个互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3,或
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 替换中),
(iii)HCDR3相对于(i)中的序列含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代),和/或
(b) 所述VL为
(i)包含如SEQ ID NO:16所示的VL中包含的三个互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2、LCDR3,或
(ii)相对于(i)中的序列,总共存在至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)在三个 CDR 区域中),或
(iii)LCDR3相对于(i)中的序列含有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。
【0004】
在一个优选的实施方案中,VH选自如SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个优选的实施方案中,VL选自SEQ ID NO:15、64、66或16所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段是
SEQ ID NO:13、58、60、62或14所示的重链可变区和SEQ ID NO:15、64、66或16所示的轻链可变区的三个互补决定区HCDR包含三个互补决定区,LCDR。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段是
重链可变区的三个互补决定区HCDR如SEQ ID NO: 13、58、60或62所示,轻链可变区的三个互补决定区HCDR如SEQ ID NO: 15、64或62所示。 66包括性别决定区域LCDR。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段是
重链可变区的三个互补决定区HCDR如SEQ ID NO:14所示,轻链可变区的三个互补决定区LCDR如SEQ ID NO:16所示。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段是
(i)如SEQ ID NO:13所示的重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3的三个互补决定区和如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区的三个互补决定区, LCDR2、LCDR3、
(ii) SEQ ID NO: 58 所示的重链可变区 HCDR1、HCDR2、 HCDR3 的三个互补决定区和 SEQ ID NO: 64 所示的轻链可变区的三个互补决定区; LCDR2、LCDR3、
(iii) SEQ ID NO: 60或62所示的重链可变区的三个互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3和SEQ ID NO: 62所示的轻链可变区的三个互补决定区的互补性66. 决策区域 LCDR1、LCDR2、LCDR3、
(iv)如SEQ ID NO:14所示的重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3的三个互补决定区和如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区的三个互补决定区; LCDR2、LCDR3、
(v)与HCDR3和/或LCDR3相比,所述序列包含至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)),包括CDR的任意组合;
【0005】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
(i)所述VH包含互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2、HCDR3,其中HCDR1包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成;HCDR1包含具有1、2或3个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列相比发生改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。 HCDR2包含SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列组成,或者HCDR2包含选自SEQ ID NO:3或4的一个或两个氨基酸序列。或者包含具有三个改变的氨基酸序列(优选氨基酸取代,优选保守取代)。 HCDR3包含SEQ ID NO:5、51、52、55或6的氨基酸序列或由其组成;或者HCDR3包含SEQ ID NO:5、51、52、55或6的氨基酸序列。与序列相比具有一处、两处或三处改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)。
和/或
(ii)所述VL包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2、LCDR3,其中LCDR1包含SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列组成;LCDR1包含具有1、2或3个的氨基酸序列;与SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列相比发生改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。 LCDR2包含SEQ ID NO: 9或10的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 9或10的氨基酸序列组成,或LCDR2包含选自SEQ ID NO: 9或10的一或两个氨基酸序列。或包含具有三个改变的氨基酸序列(优选氨基酸取代,优选保守取代)。 LCDR3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 11、53、54、56 或 12 或由其组成,或者 LCDR3 包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 11、53、54、56 或 12 含有具有以下特征的氨基酸序列:与序列相比,一处、两处或三处改变(优选氨基酸取代,优选保守性取代)。
【0006】
在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段,其包含如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
(a) VH 是
(i) 含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或由上述序列组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3;
(ii)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:51或由其组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3,或
(iii)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:52或由其组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3,或
(iv)包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或由其组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3,或
(v)所述三个CDR区总共含有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代);(iv)HCDR的任意组合; ; 或者
(vi) (i)至(iv)的任何HCDR的组合,其中HCDR3含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代) ; 包括;
和/或
(b) 所述VL为
(i) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或由上述序列组成;
(ii) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含或由以下组成:SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:53,或
(iii) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含或由以下组成:SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:54,或
(iv) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12,或由上述序列组成;
(v)所述三个CDR区总共含有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代); , 或者
(vi) (i)至(iv)的任意LCDR的组合,其中HCDR3含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代) ; 包括。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段,其包含如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
(a) VH 是
(i) 含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或由上述序列组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3;
(ii)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:51或由其组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3,或
(iii)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:52或由其组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3,或
(iv)所述三个CDR区总共含有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代);(iii)HCDR的任意组合; ; 或者
(v) (i)至(iii)的任何HCDR的组合,其中HCDR3含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代) ; 包括;
和/或
(b) 所述VL为
(i) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或由上述序列组成;
(ii) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含或由以下组成:SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:53,或
(iii) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含或由以下组成:SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:54,或
(iv)所述三个CDR区总共含有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代); , 或者
(v) (i)至(iii)的任意LCDR的组合,其中LCDR3含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代) ; 包括。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段,其包含如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
(a) VH 是
(i) 含有 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 或由上述序列组成的 HCDR1、HCDR2、HCDR3;
(ii)所述三个CDR区总共含有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代),或HCDR的组合;
(iii)所述HCDR3含有至少1个且不超过3个、2个或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代);
和/或
(b) 所述VL为
(i) LCDR1、LCDR2、LCDR3,其包含 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12,或由上述序列组成;
(ii)所述三个CDR区总共含有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代),或
(iii)LCDR3包括(i)的LCDR的组合,其中LCDR3含有至少一个且不超过三个、两个或一个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)。
【0007】
在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段,其
(i) HCDR1、HCDR2、HCDR3,其含有 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID LCDR1、LCDR2、LCDR3 或由其组成含有NO:11或由上述序列组成,或
(ii) HCDR1、HCDR2、HCDR3,其含有 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:51 和 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID LCDR1、LCDR2、LCDR3 或由其组成含有NO:53或由上述序列组成,或
(iii) HCDR1、HCDR2、HCDR3、和/或 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9,包含 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:52,或由上述序列组成; LCDR1、LCDR2、LCDR3含有SEQ ID NO:54或由上述序列组成;
(iv) HCDR1、HCDR2、HCDR3,其含有或由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID LCDR1、LCDR2、LCDR3 组成含有NO:12或由上述序列组成,
(v)所述三个HCDR区和/或所述三个LCDR区总共具有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代); )、HCDR 和 LCDR (i) 至 (iv) 的任意组合,或
(vi) (i)至(iv)中任一项,其中HCDR3和/或LCDR3含有至少一个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代),包括HCDR 和 LCDR 的组合。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗CD40抗体或其抗原结合片段,其包含如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
(a) VH 是
(i) 含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:55或由上述序列组成的HCDR1、HCDR2、HCDR3;
(ii)所述三个HCDR区域总共含有至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代)的HCDR的组合;
和/或
(b) 所述VL为
(i)LCDR1、LCDR2、LCDR3,其含有或由以下组成:SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:56,或
(ii)所述三个LCDR区域总共含有至少1个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代,优选保守取代);
【0008】
在一些实施例中,SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列为:
X1、X2或X3可以是任何氨基酸,优选X1可以是T、N、W、K、A或Y,更优选T或N并且X2可以是W或Y。 A-R-E-R-V-G-A-X1-P-T-Y-Y-Y-X2-X3- DV,优选其中X3是W、Y、M、F、T,更优选M、W或Y。
在一些实施例中,SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列为:
X1、X2、X3和X4可以是任何氨基酸,优选X1可以是Q、N或P,更优选Q或N,并且X2可以是G、Q、F、可以是S、Y或M,更优选G X3可以是E、N、T、S或K,更优选E或N,X4是T、Q、V、L、P或E,更优选T、Q或V。
【0009】
在一个优选的实施方案中,本发明提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗CD40抗体或其抗原结合片段,其中所述VH包含互补决定区(CDR)HCDR1 、HCDR2、HCDR3和VL包括(CDR)LCDR1、LCDR2、LCDR3,其中抗体或其抗原结合片段中含有的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合如表A所示。

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【0010】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区VH和/或轻链可变区VL。
(a)重链可变区VH,
(i) 选自 SEQ ID NO: 13、58、60、62 或 14 和至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98 的氨基酸序列% ;或包含具有99%同一性的氨基酸序列或由具有99%同一性的氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:13、58、60、62或14的氨基酸序列或由其组成;或
(iii)与选自13、58、60、62或14个的氨基酸序列相比,SEQ ID NO:1个以上(优选10个以下,更优选5、4、3、2、1个以下)的氨基酸具有氨基酸改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守取代,优选所述氨基酸改变不在CDR区内发生,优选所述氨基酸改变发生在FR区内)的序列 重链可变区VH 包括;
和/或
(b)轻链可变区VL,
(i) 选自 SEQ ID NO: 15、64、66 或 16 和至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 的氨基酸序列,或99;包含具有%同一性的氨基酸序列或由具有%同一性的氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:15、64、66或16的氨基酸序列或由其组成;或
(iii)与选自SEQ ID NO: 15、64、66或16的氨基酸序列相比,有1个或更多(优选10个或更少,更优选5、4、3、2、1或更少)个氨基酸; [0120] 具有改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守取代,优选所述氨基酸改变不发生在CDR区内,优选所述氨基酸改变发生在FR区内)的酸序列; VL区。
【0011】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH是
(i) 选自 SEQ ID NO: 13、58、60 或 62 和至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 的氨基酸序列,或99 包含具有%同一性的氨基酸序列或由具有%同一性的氨基酸序列组成,或
(ii)包含选自SEQ ID NO:13、58、60或62的氨基酸序列或由其组成;或
(iii)与选自SEQ ID NO: 13、58、60或62的氨基酸序列相比,有1个或更多(优选10个或更少,更优选5、4、3、2、1或更少)个氨基酸;包括具有改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守取代,优选所述氨基酸改变不发生在CDR区内,优选所述氨基酸改变发生在FR区内)的氨基酸序列;
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL是
(i)与选自SEQ ID NO:15、64或的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同66;包含具有以下特征的氨基酸序列或由具有以下特征的氨基酸序列组成:
(ii)包含选自SEQ ID NO:15、64或66的氨基酸序列或由其组成;或
(iii) 与选自 SEQ ID NO: 15、64 或 66 (优选氨基酸氨基酸取代,更优选保守氨基酸取代,优选所述氨基酸改变不在CDR区内发生,优选所述氨基酸改变发生在FR区内)。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH是
(i)与选自SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸包含数组或由数组组成,或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成;或
(iii)与选自SEQ ID NO:14的氨基酸序列相比,一个或多个(优选10个或更少,更优选5、4、3、2、1或更少)氨基酸改变(优选氨基酸取代),更优选氨基酸保守取代,优选所述氨基酸改变不发生在CDR区内,优选所述氨基酸改变发生在FR区内)。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL是
(i)与选自SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸包含数组或由数组组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成;或
(iii)与选自SEQ ID NO:16的氨基酸序列相比,一个或多个(优选10个或更少,更优选5、4、3、2、1或更少)氨基酸改变(优选氨基酸取代),更优选氨基酸保守取代,优选所述氨基酸改变不发生在CDR区内,优选所述氨基酸改变发生在FR区内)。
【0012】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区VH和/或轻链可变区VL。
(i) 重链可变区 VH 包含 SEQ ID NO: 13 的氨基酸序列或由 SEQ ID NO: 13 的氨基酸序列组成,并且轻链可变区 VL 包含 SEQ ID NO: 15 的氨基酸序列或由 SEQ ID NO: 15 的氨基酸序列组成;
(ii) 重链可变区 VH 包含 SEQ ID NO: 58 的氨基酸序列或由 SEQ ID NO: 58 的氨基酸序列组成,并且轻链可变区 VL 包含 SEQ ID NO: 64 的氨基酸序列或由 SEQ ID NO: 64 的氨基酸序列组成,
[0073] (iii)重链可变区VH包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或由SEQ ID NO:60的氨基酸序列组成,并且轻链可变区VL包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或由SEQ ID NO:66组成;
(iv) 重链可变区 VH 包含 SEQ ID NO: 62 的氨基酸序列或由 SEQ ID NO: 62 的氨基酸序列组成,并且轻链可变区 VL 包含 SEQ ID NO: 66 的氨基酸序列或由 SEQ ID NO: 66 的氨基酸序列组成;
(v)重链可变区VH包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成,并且轻链可变区VL包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,本发明抗体的重链可变区的氨基酸序列是至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%相同,或其氨基酸序列与上述(i)~(v)的重链可变区的氨基酸序列相比,有1个以上(优选10个以下,更优选5、4、3、2个)。 ,1或更少)氨基酸改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守性取代,优选氨基酸改变不发生在CDR区内,优选所述氨基酸改变发生在FR区内。
在一些实施方案中,本发明抗体的轻链可变区的氨基酸序列是至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%相同,或其氨基酸序列与上述(i)~(v)的轻链可变区的氨基酸序列相比,有1个以上(优选10个以下,更优选5、4、3、2个)。 ,1或更少)氨基酸改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守性取代,优选氨基酸改变不发生在CDR区内,优选所述氨基酸改变发生在FR区内。
【0013】
在一个优选的实施方案中,本发明提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗CD40抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或抗原中含有的重链-其结合片段可变区VH和轻链可变区VL的组合示于表B中。
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【0014】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链和/或轻链。
(a) 重链,
(i) 选自 SEQ ID NO: 17、18、19、67、69、70 或 20 和至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 的氨基酸序列, 96;%、97%、98%或99%同一性,
(ii)包含选自SEQ ID NO:17、18、19、67、69、70或20的氨基酸序列或由其组成;或
(iii)与选自17、18、19、67、69、70或20的氨基酸序列相比,SEQ ID NO:1或更多(优选20或少于10,更优选5、4、3)。所述氨基酸改变发生在重链恒定区内);
和/或
(b)轻链,
(i) 选自 SEQ ID NO: 21、68、71 或 22 和至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 的氨基酸序列, 98;包含具有%或99%同一性的氨基酸序列或由具有%或99%同一性的氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:21、68、71或22的氨基酸序列或由其组成;或
(iii)与选自21、68、71或22的氨基酸序列相比,SEQ ID NO:1个或更多(优选20或10个或更少,更优选5、4、3、2、1或更少)的氨基酸最优选地,改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守性取代,优选所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区内,更优选所述氨基酸改变不发生在轻链可变区内)重链氨基酸变化发生在轻链恒定区内。
【0015】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的重链是
(i) 选自 SEQ ID NO: 17、18、19、67、69 或 70 和至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96% 的氨基酸序列包含具有97%、98%或99%同一性的氨基酸序列或由具有97%、98%或99%同一性的氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:17、18、19、67、69或70的氨基酸序列或由其组成;或
(iii) 与选自 17、18、19、67、69 或 70 的氨基酸序列相比,SEQ ID NO: 1 或更多 (优选 20 或少于 10,更优选 5、4、3、2),一个或更少)氨基酸改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守取代),优选所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区内,更优选所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区内最优选地,重链氨基酸改变发生在重链恒定区内。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的轻链是
(i) 选自 SEQ ID NO: 21、68 或 71 和至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 的氨基酸序列或者包含具有99%同一性的氨基酸序列或由具有99%同一性的氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:21、68或71的氨基酸序列或由其组成;或
[0090] (iii)选自SEQ ID NO: 21、68或71的一个或多个(优选20个或少于10个,更优选5、4、3、2、1个或更少)氨基酸序列(优选氨基酸);取代,更优选氨基酸保守性取代,优选所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区内,更优选所述氨基酸改变不发生在轻链可变区内,最优选重链氨基酸改变发生在轻链恒定区内。
【0016】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的重链是
(i)与选自SEQ ID NO:20的氨基酸序列有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性包含或由具有的氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成;或
(iii)与选自SEQ ID NO:20的氨基酸序列相比,一个或多个(优选20或10个或更少,更优选5、4、3、2、1个或更少)氨基酸变化(优选1个或更少)是氨基酸取代,更优选氨基酸保守取代,优选所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区内,更优选所述氨基酸改变不发生在重链可变区内,最优选。所述重链可变区内不发生氨基酸改变的氨基酸序列包括重链恒定区内发生重链氨基酸改变的氨基酸序列。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的轻链是
(i)与选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性包含或由具有的氨基酸序列组成;
(ii)包含选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成;或
(iii)与选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列相比,一个或多个(优选20或10个或更少,更优选5、4、3、2、1个或更少)氨基酸变化(优选1个或更少)是氨基酸取代,更优选氨基酸保守性取代,优选所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区内,更优选所述氨基酸改变不发生在轻链可变区内,最优选。所述轻链可变区内不发生氨基酸改变的氨基酸序列包括其中重链氨基酸改变发生在轻链恒定区内的氨基酸序列。
【0017】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段包含如下重链和/或轻链。
(i)重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:17、18、19、67、69或70或由其组成,并且轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:21、68或71 ; 包含或由数组组成;
(ii)重链包含SEQ ID NO: 17、18或19的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 17、18或19的氨基酸序列组成,并且轻链包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 21的氨基酸序列组成;
(iii)重链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列或由SEQ ID NO:67的氨基酸序列组成,并且轻链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列或由SEQ ID NO:68的氨基酸序列组成;
(iv)重链包含SEQ ID NO: 69或70的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 69或70的氨基酸序列组成,并且轻链包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 71的氨基酸序列组成;
(v)重链包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成,并且轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中,本发明的抗体的重链的氨基酸序列是(i)〜(v)的重链的氨基酸序列的至少85%、90%、91%、92%、93% )与上述相同,94%、95%、96%、97%、98%或99%相同,或者氨基酸序列是一个或多个(优选20个或少于10个,更优选5、4、3、2、 1个或更少的氨基酸改变(优选氨基酸取代,更优选保守氨基酸取代,优选所述氨基酸改变是显着的,最优选氨基酸改变发生在重链恒定区内。
在一些实施方案中,本发明抗体的轻链的氨基酸序列是至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同,或者氨基酸序列为20或10个或更少,更优选5、4、3个氨基酸改变(优选氨基酸取代,更优选氨基酸保守性取代) 、2、1或更少,并且优选地,氨基酸改变是轻链,更优选地,所述氨基酸改变不发生在轻链可变区内,并且最优选地,所述氨基酸改变不发生在轻链恒定区内。
【0018】
在一个优选的实施方案中,本发明提供了一种包含重链和轻链的抗CD40抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段所含的重链和轻链的组合见表C..

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【0019】
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其片段的重链和/或轻链还包含信号肽序列,例如,信号肽序列包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列包含或由数组组成。
在本发明的一个实施方案中,本文所述的氨基酸变化包括氨基酸取代、插入或缺失。 优选地,本文所述的氨基酸改变是氨基酸取代,优选保守取代。
在一些实施方案中,改变发生在抗体的重链和/或轻链的CDR区(特别是CDR3区)中。 在一些实施方案中,CDR区例如CDR3区中有1、2或3个改变。
【0020】
在优选的实施方案中,本文所述的氨基酸变化发生在CDR(例如,FR)之外的区域中。 在一些实施方案中,改变发生在抗体的FR区,例如抗体的重链和/或轻链可变区的FR区,例如FR1、FR2、FR2或F4区。 在一些实施方案中,改变发生在FR2区域中。 在一些实施例中,FR区中有1、2或3个变化。
更优选地,本发明的氨基酸改变发生在重链可变区外部和/或轻链可变区外部的区域中,例如在重链和/或轻链的恒定区中。
在一些实施方案中,取代是保守取代。 保守取代是指一个氨基酸被同类型的另一个氨基酸取代,例如,一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸取代,一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代,或用另一种氨基酸取代中性氨基酸是指用中性氨基酸替代。 取代的例子如表D所示。
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【0021】
在一些实施方案中,取代发生在抗体的CDR区中。 一般而言,所得变体相对于亲本抗体在生物学特性(例如,增加的亲和力)方面被修饰(例如,改进)和/或具有亲本抗体的实质保留。 示例性替代变体是亲和力成熟的抗体。 在一些实施方案中,取代发生在抗体重链和/或轻链的CDR3区中。 在一些实施方案中,CDR3区中有1、2或3个取代。
在一些实施方案中,取代发生在抗体的FR区,例如抗体的重链和/或轻链可变区的FR1、FR2、FR2或F4区。 在一些实施方案中,取代发生在FR2区域中。 在一些实施方案中,FR区中有1、2或3个取代。
【0022】
在一些实施方案中,本发明提供了包含本文公开的可变区序列或具有本文公开的CDR的可变区序列和具有修饰的Fc区的恒定结构域的抗体。 与其他 Fc 受体(即激活受体)相比,修饰的 Fc 区对 FcγRIIb 的亲和力增强。 此类具有增强的FcγRIIb特异性的激动性抗CD40抗体预计在癌症治疗和慢性感染中表现出优异的功效(Li和Ravetch(2011)Science 333:1030;White等人2011)J.Immunol.187:1754)。 不希望受理论束缚,此类FcγRIIb特异性激动性抗CD40抗体可用于抑制细胞毒性CD40。 8+ 增强的辅助作用可以通过增加树突细胞成熟、促进 T 细胞增殖和活化以及增强抗肿瘤反应来表现。 不希望受理论束缚,通过本发明的交联实现的激动剂CD40抗体的FcR介导的信号增强可能是治疗功效的主要促进剂。 FcR结合的CD40激动剂抗体在抗体的Fc部分中的交联可以增加信号强度并增强细胞活化。
例如,Yu 等人 (2013) J. Am Soc. 135:9723 和 WO 2014/184545,Chu 等人 (2008) 中描述了 Fc 序列中的突变。分子免疫学 45:3926,Mimoto 等人 (2013) 蛋白质工程设计与选择 26:589。 Fc 区突变位置(数量)的命名法可在 EU 索引中找到,例如 Kabat 等人 (1981),Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, Md.)这有助于比较具有不同可变结构域长度的抗体中等效位置的 Fc 序列。
Fc序列中的示例性突变包括例如E233D、G237D、H268D、P271G、A330R、S267E和/或L328F。 在一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含具有增强FcγRIIb特异性的突变的人IgGl恒定结构域,所述突变包含E233D、G237D、H268D、P271G和A330R、或S267E和L328F。 含有增强FcγRIIb特异性的突变人IgGl恒定结构域的抗体重链的示例性序列参见例如SEQ ID NO: 18或19。
【0023】
在一些实施方案中,本文提供的抗体可被进一步修饰以包括本领域已知且容易获得的其他非蛋白质部分。 适合于抗体诱导活性的部分包括但不限于水溶性聚合物。 水溶性聚合物的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二烷基、聚1,3,6-三烷基、乙烯-马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯实例包括氧化物/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇,及其混合物。
在一些实施方案中,本文提供的抗体被改变以增加或减少抗体的糖基化程度。 通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点,可以容易地完成抗体中糖基化位点的添加或删除。 当抗体包含 Fc 区时,与其连接的糖可以改变。 在某些应用中,去除不需要的糖基化位点修饰可能有用。 例如,去除岩藻糖模块以改善抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)*C277:26733)。 在其他应用中,可以进行半乳糖苷修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
【0024】
在一些实施方案中,可能需要产生半胱氨酸工程抗体,例如“thioMAb”,其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。 例如,美国专利号7,521,541中描述的产生半胱氨酸修饰的抗体。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段具有与本发明的抗体针对CD40相同或相似的结合亲和力和/或特异性,和/或本发明的抗体与抗原结合。其片段具有与本发明的抗体相同或相似的对CD40的结合亲和力和/或特异性,和/或与本发明的抗体对相同或重叠表位的结合的抑制(例如,竞争性抑制),和/或。本发明的抗体与CD40和/或表现出一种或多种生物学特性的本发明的抗体竞争性结合。
在一些实施方案中,本发明的抗CD40抗体是IgGl形式的抗体、或IgG2形式的抗体、或IgG3形式的抗体、或IgG4形式的抗体。
在一些实施方案中,抗CD40抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中,抗CD40抗体是人源化抗体。 用于人源化抗体的各种方法是本领域技术人员已知的,例如,Almagro & Fransson (Almagro JC and Fransson J (2008) Frontiers inBioscience 13:1619-1633)的评论内容通过引用整体并入;包含于此。
在一些实施方案中,抗CD40抗体是人抗体。 人抗体可以使用本领域技术人员已知的多种技术来制备。 人类抗体一般描述于 van Dijk 和 van de Winkel,Pharmacol 5:368-74 (2001) 和 Lonberg,Immunol 20:450-459 (2008)。
在一些实施方案中,抗CD40抗体是嵌合抗体。
在一个实施方案中,本发明的抗CD40抗体也是其抗体片段,优选Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab') 2 、单域抗体、双抗体 (dAb) 或线性抗体。
在一些实施方案中,抗CD40抗体分子是双特异性或多特异性抗体分子的形式。 在一个实施方案中,双特异性抗体分子具有针对CD40的第一结合特异性和针对PD-1或PD-L1或PD-L2或OX40或4-1BB或GITR等的第二结合特异性。 在一个实施方案中,双特异性抗体分子结合CD40和TNF或IL-17。 多特异性抗体分子可以具有针对所述分子的结合特异性的任意组合。

【0025】
在一些实施方案中,本发明的抗体具有一种或多种以下特性。
(1)CD40的选择性结合,其结合高于或不结合其他TNFR家族蛋白,但在一些实施方案中使用ELISA方法。
(2) 抑制CD40和CD40配体(CD40L)之间的结合。
(3)激活以交联或组成型形式、优选以交联形式表达CD40的细胞,例如激活NFκ-B信号通路。 在一些实施方案中,使用流式细胞术进行测量,而在一些实施方案中,使用的报告细胞是表达NF-κB-GFP和hCD40的细胞。
(4)CD40,例如,约5×10 -7 中号,4.5×10 -7 中号,4.4×10 -7 中号,4.3×10 -7 中号,4.2×10 -7 中号,4.1×10 -7 中号,4×10 -7 中号,3.9×10 -7 中号,3.8×10 -7 中号,3.7×10 -7 中号,3.6×10 -7 中号,3.5×10 -7 中号,或3.4×10 -7 与人 CD40 结合,平衡解离常数小于或等于 M。 在一些实施例中,测量是表面等离子体共振技术。
(5)特异性结合表达CD40的细胞(例如人CD40或恒河猴CD40)上的CD40。 在一些实施方案中,结合 CD40 (例如,人 CD40 和/或恒河猴 CD40) 的 EC50 小于或等于约 50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、14nM、13nM、12nM。纳米、10 纳米、9 纳米、8 纳米。 在一些实施方案中,结合使用流式细胞术检测。 在一些实施方案中,表达CD40的细胞是293细胞,例如293FT细胞。
(6)诱导肿瘤细胞凋亡。 在一些实施方案中,EC 50 为约4nM、3.5nM、3nM、2.9nM、2.8nM、2.7nM或2.6nM或更小。 在一些实施方案中,使用流式细胞术进行测量。 在一些实施方案中,肿瘤细胞是Raji细胞或Ramos细胞。
(7)具有激动剂活性,例如显着激活B细胞或T细胞或树突状细胞(例如在人类中);
(8)促进B细胞或T细胞的增殖(例如在人类中)。
(9)增强免疫反应。
(10)抑制肿瘤生长,同时优选维持个体体重。
在一些实施方案中,CD40抗体在交联时具有一种或多种上述特性。
在一些实施方案中,本发明还涵盖结合其他物质的抗体(“免疫缀合物”)。
【0026】
在一些实施方案中,其他物质包括治疗剂或标记物,例如细胞毒性剂、免疫抑制剂、化疗剂等。 本发明的细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。 细胞毒性药物(化疗剂)或适合形成免疫缀合物的其他物质的实例是本领域已知的,参见例如