1.AltL蛋白或altL基因在构建转运和/或降解C16、C20、C24、C28和C32烷烃的重组载体和/或重组菌株中的应用，所述AltL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.AltL蛋白或altL基因或能够过表达AltL蛋白的重组表达载体或能够过表达AltL蛋白的重组菌株在转运C16、C20、C24、C28和C32烷烃中的应用，所述AltL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.AltL蛋白或altL基因或能够过表达AltL蛋白的重组表达载体或能够过表达AltL蛋白的重组菌株在改善细胞C16、C20、C24、C28和C32烷烃利用能力和/或降解C16、C20、C24、C28和C32烷烃中的应用，所述AltL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.AltL蛋白或altL基因或能够过表达AltL蛋白的重组表达载体或能够过表达AltL蛋白的重组菌株在促进微生物采油和/或修复石油污染中的应用，所述AltL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及AltL蛋白或altL基因的应用及转运烷烃的重组表达载体和菌株。
背景技术
[0002]原油中长链烷烃的增加，会增加重质组分的含量，增大原油粘度，从而使原油的流动性降低，限制原油开采。20世纪80年代以来，利用微生物降解石油烃提高原油采收率逐渐得到全球范围的广泛关注。在微生物生长发育过程中，微生物通过降解原油产生的酸类、表面活性剂、气体等物质可溶解灰质胶结物、乳化原油、有效降低原油粘稠度，从而提高石油采收率。同时，石油的大量开采、加工与运输增加了石油泄漏的风险。每年有几百万吨的石油经由人类活动或自然释放进入环境，对生态环境和人类健康产生了极大的威胁。微生物对长链烷烃的降解是微生物采油过程和石油污染修复中发挥作用的重要一环。
[0003]由于微生物代谢烷烃所需的关键氧化酶大多位于胞内或内膜，因此烷烃的摄取成为微生物分解代谢烷烃的前提。烷烃属于非极性疏水分子，随着碳链长度的增加疏水性随之增强，形态呈气、液、固规律变化。相比长链烷烃，短中链烷烃更易进入胞内被微生物分解利用。而长链烷烃由于存在形态(固)、较低的水溶性和较高的疏水性很难被微生物摄取利用而多滞留于环境中。
[0004]很多烷烃降解菌属于革兰氏阴性菌，革兰氏阴性菌外膜的脂多糖层对疏水长链烷烃的运输造成了障碍。细菌外膜上通常分布烷烃转运蛋白用于物质的运输。实验证明来自P.putida GPo1中的AlkL可以促进C10-C16链长烷烃的转运，来自Marinobacterhydrocarbonoclasticus SP17的外膜蛋白AupA可以促进胶束中正十六烷的摄取。而对于运输长链烷烃的转运蛋白来说，目前研究较少，制约了烷烃降解工程菌的构建和工业及环境应用的进程。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供AltL蛋白或altL基因的应用及转运烷烃的重组表达载体和菌株。AltL蛋白能够对烷烃，尤其是长链烷烃实现转运，改善细胞烷烃利用能力和降解烷烃的能力，更好地应用于采油过程和石油污染修复过程，也有利于石油降解菌株的构建。
[0006]本发明提供了AltL蛋白或altL基因在构建转运和/或降解烷烃的重组载体和/或重组菌株中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0007](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0008](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0009](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0010]本发明还提供了一种转运烷烃的重组表达载体，所述重组表达载体能够过表达AltL蛋白，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0011](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0012](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0013](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0014]优选的是，所述重组表达载体的骨架载体包括pMMB67EH。
[0015]本发明还提供了一种转运烷烃的重组菌株，所述重组菌株能够过表达AltL蛋白，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0016](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0017](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0018](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0019]优选的是，所述重组菌株基于假单胞菌、不动杆菌、大肠杆菌、芽孢杆菌或酵母菌进行构建。
[0020]本发明还提供了AltL蛋白或altL基因或上述技术方案所述的重组表达载体或上述技术方案所述的重组菌株在转运烷烃中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0021](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0022](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0023](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0024]本发明还提供了AltL蛋白或altL基因或上述技术方案所述的重组表达载体或上述技术方案所述的重组菌株在改善细胞烷烃利用能力和/或降解烷烃中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0025](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0026](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0027](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0028]本发明还提供了AltL蛋白或altL基因或上述技术方案所述的重组表达载体或上述技术方案所述的重组菌株在促进微生物采油和/或修复石油污染中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0029](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0030](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0031](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0032]优选的是，所述烷烃包括长链烷烃，所述长链烷烃包括C10～C38链长的直链烷烃和支链烷烃。
[0033]优选的是，所述直链烷烃包括C16～C32链长的直链烷烃。
[0034]本发明提供了AltL蛋白或altL基因的应用。AltL蛋白能够对烷烃，尤其是长链烷烃实现转运，改善细胞烷烃利用能力和降解烷烃的能力，更好地应用于采油过程和石油污染修复过程，也有利于石油降解菌株的构建。同时该蛋白弥补了长链烷烃转运领域研究上的不足，为长链烷烃转运机制的解析提供了基础。
附图说明
[0035]图1为本发明提供的AltL对菌株利用正二十八烷的影响结果图；其中，A：WT、△altL、altL::P和△altL::PaltL在正二十八烷无机盐培养基中培养5天的生长曲线；B：WT、△altL、△altL::P和△altL::PaltL培养5天对正二十八烷的降解率；
[0036]图2为本发明提供的AltL的跨膜结构分析结果图；
[0037]图3为本发明提供的AltL的信号肽预测结果图；
[0038]图4为本发明提供的AltL保守结构域分析结果图；
[0039]图5为本发明提供的验证AltL在菌株转运正二十八烷中的作用结果图；其中，A：菌株WT、△altL和△altL::PaltL在补充乙酸钠的C28-1,2-13C2无机盐培养基中培养3h的生长曲线；B：菌株WT、△altL和△altL::PaltL在补充乙酸钠的C28-1,2-13C2无机盐培养基中培养76h的生长曲线；C:菌株WT、△altL和△altL::PaltL在补充乙酸钠的C28-1,2-13C2无机盐培养基中培养不同时间的δ13CV-PDB值；
[0040]图6为本发明提供的AltL异源表达增强Pseudomonas aeruginosa PAO1的烷烃利用结果图；其中，A：菌株PAO1::P和PAO1::PaltL在不同链长烷烃(C16、C20、C24、C28和C32)无机盐培养基中的生长曲线；B：菌株PAO1::P和PAO1::PaltL培养7天后对不同链长烷烃(C16、C20、C24、C28和C32)的降解。
具体实施方式
[0041]本发明提供了AltL蛋白或altL基因在构建转运和/或降解烷烃的重组载体和/或重组菌株中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0042](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0043](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0044](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0045]本发明所述AltL蛋白为广谱烷烃转运蛋白，特别是可以作为长链烷烃转运蛋白，具有转运长链烷烃的作用，本发明所述AltL蛋白来源于威尼斯不动杆菌(Acinetobactervenetianus RAG-1)，相比于已报道的短/中链烷烃转运蛋白，能够对长链烷烃实现高效转运，改善细胞烷烃利用能力和降解烷烃的能力，更好地应用于采油过程和石油污染修复过程。本发明所述AltL蛋白可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。
[0046]在本发明中，所述烷烃优选包括长链烷烃，所述长链烷烃包括C10～C38链长的直链烷烃和支链烷烃。本发明所述AltL蛋白能够实现短链、中链和长链烷烃的高效转运，对长链烷烃的转运作用能够弥补现有技术长期存在的缺乏长链烷烃转运元件的问题，进而更有利于构建性能优异的长链烷烃降解菌，促进长链烷烃的利用。
[0047]在本发明中，所述直链烷烃优选包括C16～C32链长的直链烷烃。在本发明的一种实施方式中，所使用的烷烃优选包括但不限于十六烷、二十烷、二十四烷、二十八烷和三十二烷。
[0048]本发明还提供了一种转运烷烃的重组表达载体，所述重组表达载体能够过表达AltL蛋白，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0049](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0050](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0051](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0052]在本发明中，所述重组表达载体的类型优选包括质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒。在本发明中，当所述重组表达载体为质粒时，所述重组表达载体的骨架载体优选包括pMMB67EH。
[0053]本发明还提供了一种转运烷烃的重组菌株，所述重组菌株能够过表达AltL蛋白，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0054](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0055](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0056](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0057]在本发明中，所述重组菌株优选基于假单胞菌、不动杆菌、大肠杆菌、芽孢杆菌或酵母菌进行构建。更优选的，本发明所述重组菌株基于铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa PAO1进行构建。
[0058]本发明还提供了AltL蛋白或altL基因或上述技术方案所述的重组表达载体或上述技术方案所述的重组菌株在转运烷烃中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0059](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0060](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0061](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0062]在本发明所述烷烃的限定同上文，在此不再赘述。
[0063]本发明还提供了AltL蛋白或altL基因或上述技术方案所述的重组表达载体或上述技术方案所述的重组菌株在改善细胞烷烃利用能力和/或降解烷烃中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0064](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0065](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0066](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0067]在本发明所述烷烃的限定同上文，在此不再赘述。
[0068]本发明还提供了AltL蛋白或altL基因或上述技术方案所述的重组表达载体或上述技术方案所述的重组菌株在促进微生物采油和/或修复石油污染中的应用，所述AltL蛋白包括如下蛋白质(a)、(b)或(c)的氨基酸序列：
[0069](a)如SEQ ID NO.2所示的AltL蛋白；
[0070](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有转运烷烃功能的由(a)衍生的蛋白质；
[0071](c)在(a)限定的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的蛋白质。
[0072]在本发明所述烷烃的限定同上文，在此不再赘述。
[0073]本发明具体实施例中，将AltL蛋白(也可称为长链烷烃转运蛋白)的编码基因导入受体细胞(Pseudomonas aeruginosa PAO1)后，受体细胞降解不同链长烷烃(C16-C32)的能力均得到提高，本发明的AltL蛋白能够应用于细胞烷烃利用能力的改善或烷烃的降解中，在微生物采油和石油污染修复中也具有较好的应用前景。
[0074]在本发明中，所述altL基因包括如下基因(1)、(2)或(3)的核苷酸序列：
[0075](1)如SEQ ID NO.1所示的altL基因，由1668个核苷酸组成；
[0076](2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码的蛋白功能不变的DNA分子；在本发明中，所述严格条件优选为：在6×SCC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SCC，0.1％SDS和1×SCC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0077](3)与(1)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码的蛋白功能不变的DNA分子；
[0078]所述蛋白功能不变是指在相同的测定条件下，由(2)或(3)编码的蛋白质的转运烷烃的能力与(1)编码的蛋白质的转运烷烃的能力之间的相对活性百分比不低于95％、不低于96％、不低于97％、不低于98％不低于99％，或为100％。
[0079]本发明上述的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。
[0080]本发明实施例涉及了一种鉴定长链烷烃转运蛋白功能的方法，所述方法包括如下步骤：通过比较转录组学筛选潜在的长链烷烃转运蛋白；通过基因敲除及生长和降解表型实验鉴定蛋白的功能；通过稳定同位素标记的正二十八烷(C28-1,2-13C2)转运测定验证蛋白的功能。
[0081]在本发明中，所述基因敲除优选采用pK18mobsacB自杀质粒进行。
[0082]在本发明中，所述转运测定培养基优选为包含乙酸钠和C28-1,2-13C2的BSM无机盐培养基。
[0083]下面结合具体实施例对本发明所述的AltL蛋白或altL基因的应用及转运烷烃的重组表达载体和菌株做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
[0084]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中使用的烷烃均为直链烷烃。
[0085]实施例中使用到的引物的序列如表1所示：
[0086]表1引物及序列
[0087]
[0088]
[0089]实施例1
[0090]Acinetobacter venetianus RAG-1的转录组测序及比较转录组学分析
[0091]从-80℃冰箱中取甘油管，划线至LB固体培养基中，30℃培养12h。挑取单克隆菌落于5ml LB液体培养基中，于30℃恒温摇床中200rpm培养12h。按1％的接种量转接到20ml LB液体培养基中，30℃培养4h。待OD600值约为2.0，取5ml培养液于无菌离心管中，6000rpm离心5min。使用BSM无机盐培养基(3.815g/LK2HPO4，0.5g/LKH2PO4，0.825g/L(NH4)2HPO4，1.2625g/LKNO3，0.2g/LNa2SO4，0.02g/LMgCl2，0.02g/L CaCl2，0.002g/L FeCl3，pH 7.2)洗涤2次，收集菌体，分别接种到100ml乙酸钠(0.2％)BSM无机盐培养基和正二十八烷(0.1％)BSM无机盐培养基中，于30℃恒温摇床中200rpm培养至生长对数期，50ml离心管4℃，6000rpm离心5min收集菌体，进行RNA的提取。
[0092]RNA提取的步骤如下：
[0093](1)收集的菌体中加入1ml RNAiso Plus，吹打混匀，50℃孵育10min。
[0094](2)按照常规方法，使用200μl氯仿和500μl异丙醇抽提RNA。
[0095](3)异丙醇加入后混匀的样品转移到RNA提取试剂盒的吸附柱CR3中，按照说明书进行后续DNA的去除、蛋白质的去除、RNA的洗涤，最终获得RNA样品。
[0096](4)提取得到的RNA使用NanoDrop微量分光光度计(Thermo Scientific)进行定量和定性分析。
[0097]检测合格的样品接着进行mRNA的富集、文库的构建、Illumina sequencing及数据分析。测序和分析部分交由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成。
[0098]通过筛选正二十八烷培养相比乙酸钠培养时上调表达的基因，获得了潜在的长链烷烃转运蛋白基因F959_RS14525。该基因在比较转录组中表达上调2.66倍，编码蛋白注释为假定的外膜蛋白。本发明将其命名为altL。
[0099]实施例2
[0100]altL基因敲除载体的构建
[0101]靶基因通过双交换同源重组而失活。使用提取试剂盒提取菌株RAG-1的基因组，靶基因的上下游同源臂以RAG-1基因组为模板，分别使用引物up-F/up-R和dn-F/dn-R(引物序列如表1)和PrimeSTAR DNA聚合酶(Takara Bio，Tokyo，Japan)扩增。通过overlap PCR将上下游DNA片段连接，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组片段。将重组片段和pK18mobsacB质粒使用限制性酶EcoRI和XbaI进行酶切，酶切后片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4 DNA连接酶于22℃连接3～4h，得到重组质粒pK18-ΔaltL，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。
[0102]实施例3
[0103]altL缺失突变株的构建
[0104]在平板培养基挑RAG-1单菌落接种至含10μg/ml Cmr的5ml LB培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养12h，挑取E.coli s17/pK18-ΔaltL的单菌落至含有50μg/ml Kmr的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/L的MgSO4溶液洗涤两次，离心，再用MgSO4溶液重悬菌体，将RAG-1和E.coli s17混匀后置于0.22um的滤膜上，在无抗性平板上培养12h进行接合转移。用MgSO4溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有Cmr和Kmr的双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。在双抗平板上挑取单菌落划线至新的双抗平板上，30℃培养12h。挑取单交换重组子于10％蔗糖平板上划线，30℃培养36h。挑取单菌落分别转至无抗平板和Kmr抗性平板，30℃培养12h。挑取无抗平板上生长，Kmr平板上不生长的菌落使用引物jd-F/jd-R(引物序列如表1)进行菌落PCR验证，获得无痕缺失altL的菌株(ΔaltL)。
[0105]实施例4
[0106]altL基因回补重组质粒的构建
[0107]以RAG-1基因组为模板，使用引物PaltL-F/PaltL-R(引物序列如表1)和PrimeSTARDNA聚合酶(TakaraBio，Tokyo，Japan)扩增altL片段并进行PCR产物纯化回收。将pMMB67EH质粒使用限制性内切酶BamHI进行酶切，酶切后的质粒使用试剂盒进行PCR纯化回收。将纯化回收的酶切质粒和片段用Gibson预混液(NEB，America)于50℃连接1h，得到重组质粒pMM-altL，并将重组质粒转入E.coli DH5α感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。
[0108]实施例5
[0109]altL基因回补菌株(ΔaltL::PaltL)的构建
[0110]将pMMB67EH质粒和pMM-altL重组质粒分别通过电转化方式(1.8KV，200Ω)转入ΔaltL感受态细胞中获得空白质粒对照菌株(ΔaltL::P)和altL基因回补菌株(ΔaltL::PaltL)。
[0111]实施例6
[0112]RAG-1及其突变株的生长和降解表型
[0113]从-80℃冰箱中取甘油管(RAG-1、ΔaltL、ΔaltL::P和ΔaltL::PaltL)，划线至LB固体培养基中，30℃培养12h。挑取单克隆菌落于5ml LB液体培养基中，于30℃恒温摇床中200rpm培养12h。按1％的接种量转接到20ml LB液体培养基中，30℃培养4h。待OD600值约为2.0，取2.5ml培养液于无菌离心管中，6000rpm离心5min。使用BSM无机盐培养基洗涤2次，收集菌体，分别接种到50ml正二十八烷(0.1％)无机盐培养基中，于30℃恒温摇床中200rpm培养5天。菌株ΔaltL::P和ΔaltL::PaltL在培养过程中添加相应的抗生素(Ampr 150μg/ml)和诱导剂(IPTG 0.1mM)。每个样品6个重复，其中三个重复样品用于在不同时间点取样测定OD600值以绘制生长曲线，三个重复样品在第5天时使用等体积正己烷进行萃取，并取1ml萃取液上层，加入10μl角鲨烷母液(10％)作为内参，进行气相色谱检测。
[0114]图1为AltL对菌株利用正二十八烷的影响结果。其中，A：WT、△altL、altL::P和△altL::PaltL在正二十八烷无机盐培养基中培养5天的生长曲线；B：WT、△altL、△altL::P和△altL::PaltL培养5天对正二十八烷的降解率。
[0115]野生型菌株WT在正二十八烷无机盐培养基中可以进行生长和降解，而缺失菌株△altL失去了对正二十八烷的利用能力。使用重组质粒对altL进行回补后，回补菌株△altL::PaltL恢复了对正二十八烷的利用能力。这些结果表明AltL影响RAG-1对正二十八烷的利用(图1)。
[0116]实施例7
[0117]AltL蛋白二级结构分析
[0118]使用BOCTOPUS2方法进行AltL蛋白的拓扑预测。图2为AltL的跨膜结构分析结果图，结果表明该蛋白包含多个β-折叠并形成跨膜桶状结构，说明它位于细胞膜上，属于跨膜蛋白。使用SignalP-5.0进行AltL蛋白的信号肽预测。图3为AltL的信号肽预测结果图，结果表明该蛋白N端包含25个氨基酸组成的信号肽序列。使用InterPro进行AltL蛋白的保守结构域分析。图4为AltL保守结构域分析结果图，结果表明该蛋白可以归入OMPP1/FadL/TodX外膜蛋白家族(IPR005017)、Toluene_X(PF03349)和外膜蛋白NMB0088相关蛋白(PTHR35093)。使用BLASTP进行AltL蛋白的相似性序列检索。结果表明AltL与FadL家族成员具有一定的序列相似性，其中与该家族成员二甲苯转运蛋白XylN(Pseudomonas.putida)、甲苯转运蛋白TbuX(Ralstonia Pickettii PKO1)和TodX(P.putida F1)在417、380和319个氨基酸残基覆盖度上具有25％、21％和22％的序列同一性，与长链脂肪酸转运蛋白FadLEc(E.coli)在217个氨基酸覆盖度上具有20％的序列同一性(详见表2)。这些证据表明该蛋白可能属于OMPP1/FadL/TodX外膜蛋白家族，参与了疏水底物正二十八烷的跨外膜转运。
[0119]表2AltL与已知OMPP1/FadL/TodX家族成员的序列相似性比对
[0120]
[0121]实施例8
[0122]稳定同位素标记的正二十八烷(C28-1,2-13C2)转运测定
[0123]从-80℃冰箱中取甘油管(RAG-1、ΔaltL和ΔaltL::PaltL)，划线至LB固体培养基中，30℃培养12h。挑取单克隆菌落于5ml LB液体培养基中，于30℃恒温摇床中200rpm培养12h。按1％的接种量转接到20ml乙酸钠(0.2％)无机盐培养基中，待OD600值约为0.5～0.6时，6000rpm离心5min收集菌体。将菌体全部转移到添加乙酸钠(0.05％)和C28-1,2-13C2(0.025％)的无机盐培养基中，测定不同时间点的OD600值用于绘制生长曲线。其中ΔaltL::PaltL在培养过程中添加相应的抗生素(Ampr 150μg/ml)和诱导剂(IPTG 0.1mM)。
[0124]图5为验证AltL在菌株转运正二十八烷中的作用结果图。其中，A：菌株WT、△altL和△altL::PaltL在补充乙酸钠的C28-1,2-13C2无机盐培养基中培养3h的生长曲线；B：菌株WT、△altL和△altL::PaltL在补充乙酸钠的C28-1,2-13C2无机盐培养基中培养76h的生长曲线；C:菌株WT、△altL和△altL::PaltL在补充乙酸钠的C28-1,2-13C2无机盐培养基中培养不同时间的δ13CV-PDB值。
[0125]培养初期三株菌在培养基中生长迅速，很快到达平台期(图5中的A)。之后由于乙酸钠消耗殆尽，野生菌株因仍能利用正二十八烷而显示出增加的菌浓(图5中的B)。缺失菌株由于不能利用正二十八烷，菌浓不再增加，并在一段时间内稳定在一定的菌浓。同时回补菌株菌浓也有一定程度的降低，但后期有一定程度的菌浓增加(图5中的B)。
[0126]同样的条件培养细菌，收集菌体转移到添加乙酸钠(0.05％)和C28-1,2-13C2(0.025％)的无机盐培养基中，不同时间点取样，每次2mL，10000rpm离心2min收集菌体，并使用BSM洗涤2次，冰箱冷冻20h以上，真空冷冻干燥过夜，之后进行菌体稳定同位素含量检测。稳定同位素含量检测交由北京科荟测试技术有限公司进行。培养初期，野生菌株和回补菌株中便检测到δ13CV-PDB值的增加，并且随着培养时间的增加，δ13CV-PDB值持续增加，表明同位素标记的烷烃底物被持续摄取入胞内，作为碳源保证了菌体的生长(图5中的C)。而突变株△altL在培养期间始终保持一个极低的δ13CV-PDB值，没有检测到δ13CV-PDB值的增加(图5中的C)，表明突变株△altL并未摄取稳定同位素标记的正二十八烷进入胞内。综上，进一步证实了AltL参与长链烷烃正二十八烷的转运。
[0127]实施例9
[0128]AltL异源表达菌株(PAO1::PaltL)的构建
[0129]将pMMB67EH质粒和pMM-altL重组质粒通过电转化方式(2.5KV，200Ω)转入Pseudomonas aeruginosa PAO1感受态细胞中获得空白质粒对照菌株(PAO1::P)和altL异源表达菌株(PAO1::PaltL)。
[0130]实施例10
[0131]PAO1::P和PAO1::PaltL的生长和降解表型
[0132]从-80℃冰箱中取甘油管(PAO1::P和PAO1::PaltL)，划线至LB固体培养基中，30℃培养12h。挑取单克隆菌落于5ml LB液体培养基中，于30℃恒温摇床中200rpm培养12h。按1％的接种量转接到20ml LB液体培养基中，30℃培养4h。待OD600值约为2.0，取2.5ml培养液于无菌离心管中，6000rpm离心5min。使用BSM无机盐培养基洗涤2次，收集菌体，分别接种到50ml含不同链长烷烃(C16、C20、C24、C28和C32)的BSM无机盐培养基中，于30℃恒温摇床中200rpm培养7天。菌株PAO1::P和PAO1::PaltL在培养过程中添加相应的抗生素(Cbr 150μg/ml)和诱导剂(IPTG 0.1mM)。每个样品6个重复，其中三个重复样品用于在不同时间点取样测定OD600值以绘制生长曲线，三个重复样品在第7天时使用等体积正己烷进行萃取，并取1ml萃取液上层，加入10μl角鲨烷母液(10％)作为内参，进行气相色谱检测。
[0133]图6为AltL异源表达增强Pseudomonas aeruginosa PAO1的烷烃利用结果图。其中，A：菌株PAO1::P和PAO1::PaltL在不同链长烷烃(C16、C20、C24、C28和C32)无机盐培养基中的生长曲线；B：菌株PAO1::P和PAO1::PaltL培养7天后对不同链长烷烃(C16、C20、C24、C28和C32)的降解。
[0134]AltL在PAO1中的异源表达增强了PAO1对不同链长烷烃的利用(图6)，表明烷烃转运可能是烷烃降解的限制因素之一，而AltL有望作为功能元件用于烷烃降解工程菌株的构建。
[0135]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
<120> AltL蛋白或altL基因的应用及转运烷烃的重组表达载体和菌株
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgaaat atcctaagtt atgtccttta gcgtttggta ttttcgttgc aggactttcg 60
aatataacta atgcccaatt agggcaagat ttatcagtgg atttacgctc cttatcttta 120
ggtaatgctg ttacggctga ccctccaggg attagtgcag tacattttaa tcccgcagca 180
ttgacgaaga ttgatggatt acaaacagat gttcagggca ttttagctaa ctttgccatc 240
aaacgagatt atgccgctcc tgcgggttat aatgtttttg gatattcaga tgatccatta 300
gtctgtaatg atgggccaga agtggacacg ggtatctgta ctgattttaa aggtacggta 360
tccggtgatg ttgaatatgc tagtatttat gttcctattc ttaaaaaaat tgtagatttg 420
ggtcctaact ctcctttagc agcaccaact gctggtatag cttataagcc gccaggatca 480
aaagtgactt atgctacagc agtttatgct ccgttagttg ctggttttgg tgcagaagat 540
ggtaacccta gtaattatat gggacaacaa gttgctttag agcgtattac ttacttatct 600
ccttcatttg gttatcaggt taatgatcat ttatctcttg gtgcatcatt tggtatgtct 660
tatcaagcga tcgctatgaa aactgattta cgatttccta atgagatgat tggtgttctg 720
cgaatggttg atgaggttgt ctgtggtcca ttcaaggaca atggagatat catcactgat 780
ctacttcttt ttggtatgtg taacgcgaaa gaagggatga acccatttaa taaaatggga 840
gcattagatg tttcattaga acaatcatta agtcctagct ataacttagg cttactgtgg 900
gagccaactg atgactttag tttcggcatg gtttatcaaa gtgaagcaaa aatgcgttta 960
cgggggaagt atttaattaa taatgcgaat gctcctcagc aactgattgc tggtttgaac 1020
tcttctgcta cgggtcagat tcttgctgca attttgggtt tacctggata tgtaccgaat 1080
attgaatctg gcttagtcgc tatggatttc aaatatccac agcattttaa ggctggaata 1140
aaatataaaa tttttcctga tttacaaatg aattttgatg ttggatggac tgatttctcc 1200
gcatgggata agtttaaatt cgaatttgat cgacaaatct cactattaaa agtagcaaag 1260
ttattatctg cagatgtaac tgatcgctca ttagctttac ctttaaaatt tcagtcttct 1320
tggcgttggg gaataggttt cgaatattcg gcaacggatc gtttgaaatt gagaattgga 1380
tatgaaccac gtacgagttc tattcctgac gataagcgca atacgatggt gccgattaac 1440
aatgcacaat tatttggtct aggtcttggt tatcgttttg atcaagatac agatttagat 1500
ttatctgtcg gttttttgcg cagtcgtgat gatattccag caaatacaag tagtctatca 1560
aataagacag gggtagataa tattttatta aacccttatg ccggactgaa tgttaaaacc 1620
aataccaaag tcactttact tggtatcaac tatagaacta gatggtaa 1668
<210> 2
<211> 555
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Lys Tyr Pro Lys Leu Cys Pro Leu Ala Phe Gly Ile Phe Val
1 5 10 15
Ala Gly Leu Ser Asn Ile Thr Asn Ala Gln Leu Gly Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Val Asp Leu Arg Ser Leu Ser Leu Gly Asn Ala Val Thr Ala Asp Pro
35 40 45
Pro Gly Ile Ser Ala Val His Phe Asn Pro Ala Ala Leu Thr Lys Ile
50 55 60
Asp Gly Leu Gln Thr Asp Val Gln Gly Ile Leu Ala Asn Phe Ala Ile
65 70 75 80
Lys Arg Asp Tyr Ala Ala Pro Ala Gly Tyr Asn Val Phe Gly Tyr Ser
85 90 95
Asp Asp Pro Leu Val Cys Asn Asp Gly Pro Glu Val Asp Thr Gly Ile
100 105 110
Cys Thr Asp Phe Lys Gly Thr Val Ser Gly Asp Val Glu Tyr Ala Ser
115 120 125
Ile Tyr Val Pro Ile Leu Lys Lys Ile Val Asp Leu Gly Pro Asn Ser
130 135 140
Pro Leu Ala Ala Pro Thr Ala Gly Ile Ala Tyr Lys Pro Pro Gly Ser
145 150 155 160
Lys Val Thr Tyr Ala Thr Ala Val Tyr Ala Pro Leu Val Ala Gly Phe
165 170 175
Gly Ala Glu Asp Gly Asn Pro Ser Asn Tyr Met Gly Gln Gln Val Ala
180 185 190
Leu Glu Arg Ile Thr Tyr Leu Ser Pro Ser Phe Gly Tyr Gln Val Asn
195 200 205
Asp His Leu Ser Leu Gly Ala Ser Phe Gly Met Ser Tyr Gln Ala Ile
210 215 220
Ala Met Lys Thr Asp Leu Arg Phe Pro Asn Glu Met Ile Gly Val Leu
225 230 235 240
Arg Met Val Asp Glu Val Val Cys Gly Pro Phe Lys Asp Asn Gly Asp
245 250 255
Ile Ile Thr Asp Leu Leu Leu Phe Gly Met Cys Asn Ala Lys Glu Gly
260 265 270
Met Asn Pro Phe Asn Lys Met Gly Ala Leu Asp Val Ser Leu Glu Gln
275 280 285
Ser Leu Ser Pro Ser Tyr Asn Leu Gly Leu Leu Trp Glu Pro Thr Asp
290 295 300
Asp Phe Ser Phe Gly Met Val Tyr Gln Ser Glu Ala Lys Met Arg Leu
305 310 315 320
Arg Gly Lys Tyr Leu Ile Asn Asn Ala Asn Ala Pro Gln Gln Leu Ile
325 330 335
Ala Gly Leu Asn Ser Ser Ala Thr Gly Gln Ile Leu Ala Ala Ile Leu
340 345 350
Gly Leu Pro Gly Tyr Val Pro Asn Ile Glu Ser Gly Leu Val Ala Met
355 360 365
Asp Phe Lys Tyr Pro Gln His Phe Lys Ala Gly Ile Lys Tyr Lys Ile
370 375 380
Phe Pro Asp Leu Gln Met Asn Phe Asp Val Gly Trp Thr Asp Phe Ser
385 390 395 400
Ala Trp Asp Lys Phe Lys Phe Glu Phe Asp Arg Gln Ile Ser Leu Leu
405 410 415
Lys Val Ala Lys Leu Leu Ser Ala Asp Val Thr Asp Arg Ser Leu Ala
420 425 430
Leu Pro Leu Lys Phe Gln Ser Ser Trp Arg Trp Gly Ile Gly Phe Glu
435 440 445
Tyr Ser Ala Thr Asp Arg Leu Lys Leu Arg Ile Gly Tyr Glu Pro Arg
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Pro Asp Asp Lys Arg Asn Thr Met Val Pro Ile Asn
465 470 475 480
Asn Ala Gln Leu Phe Gly Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Asp Gln Asp
485 490 495
Thr Asp Leu Asp Leu Ser Val Gly Phe Leu Arg Ser Arg Asp Asp Ile
500 505 510
Pro Ala Asn Thr Ser Ser Leu Ser Asn Lys Thr Gly Val Asp Asn Ile
515 520 525
Leu Leu Asn Pro Tyr Ala Gly Leu Asn Val Lys Thr Asn Thr Lys Val
530 535 540
Thr Leu Leu Gly Ile Asn Tyr Arg Thr Arg Trp
545 550 555
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgaaat atcctaagtt atgtc 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaccatcta gttctatagt tgatacc 27
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggaattcta ctgttcaata tggcgtctta g 31
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttttgcat catgtctcct taacgtagtt ttttt 35
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggagacatg atgcaaaaga acagaaatca acg 33
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctctagagc tgataaacgc atgtaacttt c 31
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggttaaggg ttgaagagg 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaagaaagc aacggtcat 19
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attcgagctc ggtacccggg ttggaaaaaa actacgttaa gg 42
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctgcaggtc gactctagag ttgtatagaa accatctgca tatag 45