1.中性粒细胞在制备阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体中的应用，其特征在于，将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合，在RPMI培养基中孵育2h，所述多粘菌素以脂质体形式添加。
2.中性粒细胞在制备抗感染药物中的应用，所述抗感染药物包括以中性粒细胞为阿奇霉素和多粘菌素递送载体的递送体系；
所述递送体系的制备方法为将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合，在RPMI培养基中孵育2h，所述多粘菌素以脂质体形式添加；
所述抗感染药物抗多重耐药铜绿假单胞菌。
3.一种递送体系，其特征在于，所述递送体系以中性粒细胞为递送载体，共同递送阿奇霉素和多粘菌素；
所述递送体系的制备方法为将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合，在RPMI培养基中孵育2h，所述多粘菌素以脂质体形式添加。
4.根据权利要求3所述递送体系，其特征在于，所述多粘菌素包括多粘菌素B和多粘菌素E。
5.根据权利要求3所述递送体系，其特征在于，所述中性粒细胞的来源包括鼠骨髓中性粒细胞或人血中性粒细胞。
6.权利要求3~5任一项所述递送体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合，在RPMI培养基中孵育2h；所述RPMI培养基中含有质量百分含量为20%的胎牛血清；
所述中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素的比例为106个：100~200 μg：0.1~1.2 μg。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，在所述孵育后还包括离心收集细胞沉淀，所述离心的离心力为300 g，时间为5min。
9.权利要求3~5任一项所述递送体系在制备抗感染药物中的应用，所述抗感染药物抗多重耐药铜绿假单胞菌。

技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用。
背景技术
[0002]目前细菌耐药性问题的日趋恶化严重威胁到公众健康。鉴于目前严重的细菌耐药问题，2017年世界卫生组织将耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌列为对人类健康构成极大威胁的细菌之一，亟需新型药物。
[0003]多粘菌素类药物包括多粘菌素B和E，是临床上作为治疗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线。然而多粘菌素具有较高的毒副作用，限制了其应用。阿奇霉素是大环内酯类抗生素，能够抑制细菌蛋白合成，同时，阿奇霉素具有免疫调节作用，并可以降低铜绿假单胞菌毒力因子表达。有研究表明，阿奇霉素与多粘菌素E具有协同杀菌作用。中性粒细胞在抗细菌感染中起重要作用，在感染时由血液中快速募集到感染部位，杀灭入侵细菌，因此是天然高效的药物递送载体。然而中性粒细胞杀伤病原菌的能力有限，且其引起的炎症反应有可能造成组织损伤，使病人状况恶化。目前并没有一种可同时将多粘菌素类药物、阿奇霉素和中性粒细胞共同作用的方法。
发明内容
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用，针对细菌耐药问题和治疗感染中的免疫调节问题，建立了以中性粒细胞递送阿奇霉素和多粘菌素的系统，同时克服了两个药物在药代动力学上的差异，使药物能够在感染部位同时释放，提升杀菌效果。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]本发明提供了中性粒细胞在制备阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体中的应用。
[0007]本发明还提供了中性粒细胞在制备抗感染药物中的应用，所述抗感染药物包括以中性粒细胞为阿奇霉素和多粘菌素递送载体的递送体系。
[0008]本发明还提供了一种递送体系，所述递送体系以中性粒细胞为递送载体，共同递送阿奇霉素和多粘菌素。
[0009]优选的，所述多粘菌素包括多粘菌素B和多粘菌素E。
[0010]优选的，所述中性粒细胞的来源包括鼠骨髓中性粒细胞或人血中性粒细胞。
[0011]本发明还提供了上述递送体系的制备方法，包括以下步骤：将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合，在RPMI培养基中孵育2h；所述RPMI培养基中含有质量百分含量为20％的胎牛血清；
[0012]所述中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素的比例为106个：100～200μg：0.1～1.2μg。
[0013]优选的，所述多粘菌素以脂质体形式添加。
[0014]优选的，所述孵育的温度为37℃。
[0015]优选的，在所述孵育后还包括离心收集细胞沉淀，所述离心的离心力为300g，时间为5min。
[0016]本发明还提供了上述递送体系在制备抗感染药物中的应用。
[0017]有益效果：本发明针对细菌耐药问题和治疗感染中的免疫调节问题，建立了以中性粒细胞递送阿奇霉素和多粘菌素的系统，整合了以下优点：(1)中性粒细胞快速募集到感染部位；(2)多粘菌素的高效杀菌活性和目前临床革兰氏阴性病原体的低耐药率；(3)多粘菌素与阿奇霉素的协同杀菌作用；(4)阿奇霉素的免疫调节和抗菌毒力活性；(5)在没有病原体的情况下稳定保留药物；(6)同时递送药物以克服药代动力学差异。本发明所述递送体系以中性粒细胞为载体，对抗生素阿奇霉素和多粘菌素进行感染部位的靶向递送，能够实现低剂量药物产生高疗效的效果。
附图说明
[0018]图1为小鼠中性粒细胞与阿奇霉素和带有多粘菌素E的脂质体孵育后，检测细胞携带的药量，其中AZM表示阿奇霉素，CST表示多粘菌素E，下同；
[0019]图2为携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞对PA14菌株的杀菌能力，其中Cell表示中性粒细胞，CST0.4-NPs和CST0.8-NPs表示携带有不同量多粘菌素E的脂质体，下同；
[0020]图3为携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞对多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株26、71(A)，150、195(B)和肺炎克雷伯菌KP43、鲍曼不动杆菌AB224(C)的杀菌效果；
[0021]图4为携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞与耐药铜绿假单胞菌孵育后，炎症因子基因的表达水平；
[0022]图5为携带阿奇霉素和多粘菌素E的人中性粒细胞对铜绿假单胞菌标准菌株PA14。多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株150。肺炎克雷伯菌KP43和鲍曼不动杆菌AB224的杀菌效果；
[0023]图6为采用小鼠急性肺炎模型，感染后2小鼠尾静脉注射2×106中性粒细胞或同等剂量的阿奇霉素和多粘菌素E；A：12小时后，取出肺进行细菌计数；B：连续观察小鼠存活率；C：感染后12小时，检测肺中炎症因子基因表达水平。
具体实施方式
[0024]本发明提供了中性粒细胞在制备阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体中的应用。
[0025]在本发明中，中性粒细胞在感染时被大量募集到感染部位，是抗感染反应中重要的免疫细胞，因此，选择中性粒细胞作为药物靶向递送载体，从而达到清除病原细菌的作用；阿奇霉素与多粘菌素对多种临床革兰氏阴性多重耐药菌具有协同杀伤作用。中性粒细胞能够富集阿奇霉素，并稳定维持胞内浓度。以脂质体为媒介可以使中性粒细胞吸收多粘菌素，并稳定维持胞内浓度。以中性粒细胞为载体递送阿奇霉素和多粘菌素同时克服了两个药物在药代动力学上的差异，使药物能够在感染部位同时释放，提升杀菌效果。所以可将中性粒细胞作为阿奇霉素和多粘菌素的共同递送载体，从而满足抗生素阿奇霉素和多粘菌素进行感染部位的靶向递送的目的，实现低剂量药物产生高疗效的效果。
[0026]本发明还提供了中性粒细胞在制备抗感染药物中的应用，所述抗感染药物包括以中性粒细胞为阿奇霉素和多粘菌素递送载体的递送体系。
[0027]本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
[0028]本发明还提供了一种递送体系，所述递送体系以中性粒细胞为递送载体，共同递送阿奇霉素和多粘菌素。
[0029]本发明所述多粘菌素优选包括多粘菌素B和多粘菌素E，由于多粘菌素B和多粘菌素E的结构和功能高度相似，所以实施例中以多粘菌素E为例进行实验，但不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
[0030]本发明对所述中性粒细胞的来源并没有特殊限定，优选包括鼠骨髓中性粒细胞或人血中性粒细胞。本发明对所述中性粒细胞的分离方法并没有特殊限定，利用本领域的常规分离方法即可。
[0031]本发明还提供了上述递送体系的制备方法，包括以下步骤：将中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素混合，在RPMI培养基中孵育2h；所述RPMI培养基中含有质量百分含量为20％的胎牛血清；
[0032]所述中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素的比例为106个：100～200μg：0.1～1.2μg。
[0033]本发明所述多粘菌素优选以脂质体形式添加，所述脂质体的添加量以多粘菌素的量计。本发明将中性粒细胞与阿奇霉素和脂质体混合后，优选在含有20％(w/w)胎牛血清(FBS)的RPMI中于37℃孵育2h，离心去除细胞外阿奇霉素和脂质体后，得到所述递送体系。本发明所述离心的离心力优选为300g，时间优选为5min。
[0034]本发明还提供了上述递送体系在制备抗感染药物中的应用。
[0035]本发明所述递送体系，经实施例证实，每106个中性粒细胞可携载0.88μg阿奇霉素和0.952μg多粘菌素，并显著提高对铜绿假单胞菌标准菌株和临床多重耐药菌的杀菌能力，并减少促炎因子的产生。
[0036]下面结合实施例对本发明提供的一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0037]实施例1
[0038]多粘菌素E采用脂质体进行包装，脂质体载药量为40mg/ml。提取小鼠骨髓中性粒细胞，以106/ml细胞与100μg/ml阿奇霉素和20μl含多粘菌素E的脂质体在含有20％胎牛血清(FBS)的RPMI中于37℃孵育2小时。以300g离心5分钟去除细胞外阿奇霉素和脂质体后，可用于体外杀菌实验和小鼠尾静脉注射抗感染实验。
[0039]1、中性粒细胞与阿奇霉素和多粘菌素E脂质体孵育后，细胞内累积的药物量。以300g离心5分钟收集细胞，用1ml超纯水裂解细胞，以10000g离心2分钟去除细胞碎片。采用ELISA试剂盒(江苏维赛科技生物发展有限公司)检测上清中阿奇霉素和多粘菌素E的浓度。
[0040]结果如图1和表1所示，中性粒细胞可同时携载阿奇霉素和多粘菌素E。
[0041]表1 中性粒细胞的载药量
[0042]
[0043]2、携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞杀菌能力显著增强
[0044]小鼠中性粒细胞与阿奇霉素和带有多粘菌素E的脂质体孵育后，与铜绿假单胞菌标准菌株PA14共孵育(细胞与细菌比例为1:10)。每隔1小时，检测活细菌浓度。AZM，阿奇霉素；CST0.4-NPs，CST0.8-NPs，指10和20μl携带多粘菌素E的脂质体：
[0045](1)划线：从-80℃冰箱挑取临床菌在LB平板上进行分区划线，将划线平板放置在37℃进行培养。挑取平板上的单菌落进行后续杀菌实验。
[0046](2)挑取平板上形成的单菌落在LB液体培养基中培养过夜。过夜培养后的菌液按照1:100用4ml LB液体培养基稀释，稀释后37℃，200rpm摇床培养。
[0047](3)对数期杀菌实验，摇床培养2.5h左右，OD600为0.8。
[0048](4)12000rpm离心1分钟收集菌体用1ml PBS洗一次。
[0049](5)用RMPI培养基重悬菌体至107CFU/ml，与106中性粒细胞混合，37℃孵育。
[0050](6)每隔1小时，取0.1ml混合物进行梯度稀释，每个梯度取10μl稀释液滴于LB平板上。平板放置37℃培养24小时后进行菌落计数，根据结果计算细菌活菌数。
[0051]结果如图2和表2所示，携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞杀菌能力显著增强。
[0052]表2 携带阿奇霉素和多粘菌素E的中性粒细胞杀菌能力
[0053]
[0054]3、携带药物的中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力显著增强
[0055]实验方法同2。
[0056]结果如图3和表3所示，携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞对多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株26、71(图3中A)，150、194(图3中B)和肺炎克雷伯菌KP43、鲍曼不动杆菌AB224(图3中C)的杀菌效果。
[0057]表3 携带药物的中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力
[0058]
[0059]
[0060]4、携带药物的中性粒细胞产生较少的促炎因子
[0061]设计特异性引物，分别测定促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达量，以β-actin为内参基因，设计的引物序列分别为：
[0062]IL-1β-F(SEQ ID NO.1)：GAGCACCTTCTTTTCCTTCATCTT
[0063]IL-1β-R(SEQ ID NO.2)：TCACACACCAGCAGGTTATCATC
[0064]IL-6-F(SEQ ID NO.3):TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC
[0065]IL-6-R(SEQ ID NO.4):TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC
[0066]IL-8-F(SEQ ID NO.5):CACCTCAAGAACATCCAGAGCT
[0067]IL-8-R(SEQ ID NO.6):CAAGCAGAACTGAACTACCATCG
[0068]TNF-α-F(SEQ ID NO.7)：CCCTCACACTCAGATCATCTTCT
[0069]TNF-α-R(SEQ ID NO.8)：GCTACGACGTGGGCTACAG
[0070]β-actin-F(SEQ ID NO.19):GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC
[0071]β-actin-R(SEQ ID NO.10):GACTCATCGTACTCCTGCTTGC
[0072]细菌培养方法同2中的(1)～(4)；
[0073](5)用RMPI培养基重悬菌体至106CFU/ml，与106中性粒细胞混合，37℃孵育。
[0074](6)1小时后，2500rpm离心3分钟离心收集细胞。
[0075](7)用1ml TRIzol试剂重悬细胞，按照说明书提取总RNA。
[0076](8)利用反转录试剂盒(Takara，货号：RR036A)配制20μL反转录体系，在PCR仪器上运行(37℃，30min，85℃，5s)程序。
[0077](9)实时定量(Real-Time)PCR
[0078]配制Real-Time PCR体系：2×ChamQ Universal SYBR 8μl、RNase-free水6μl、cDNA模板1μl、上下游引物各0.5μl。
[0079]运行程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，40个循环；95℃变性10s，55℃退火10s、72℃延伸30s。
[0080]结果如图4和表4所示，携带阿奇霉素和多粘菌素E的小鼠中性粒细胞与耐药铜绿假单胞菌孵育后，炎症因子基因的表达水平显著降低。
[0081]表4 携带药物的中性粒细胞产生较少的促炎因子
[0082]
[0083]5、携带药物的人中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力显著增强
[0084](1)菌悬液制备：以PA14为例，过夜培养的菌液1:100转接至LB液体培养基中，培养至OD600为1左右，准确测定OD600。取1ml菌液12000rpm离心2min收集菌体，加入1ml生理盐水重悬菌体，再离心。如此用生理盐水将菌液洗涤2次以去除残留培养基，最终根据之前测得的OD600加入相应量的生理盐水重悬菌体，使菌液浓度为2×108CFU/ml。
[0085](2)麻醉：每只小鼠腹腔注射100μl 7.5％水合氯醛。
[0086](3)感染：小鼠麻醉后，单手固定小鼠，将上述菌液滴入小鼠鼻腔，每个鼻孔10μl，相应接种量PA14菌株为4×106CFU/小鼠。
[0087](4)给药：感染2小时后尾静脉注射的方式给每只小鼠注射2×106中性粒细胞或同等剂量的阿奇霉素和多粘菌素E。
[0088](5)指标测定：小鼠的细菌载量和小鼠存活率。
[0089]测定方法如下：
[0090]1)细菌载量：
[0091]感染12h后在鼠笼内通入CO2处死小鼠，取小鼠的肺分别放入离心管中，加入1ml生理盐水，用研磨仪将组织研磨，研磨后稀释滴板，进行菌落计数。
[0092]2)小鼠存活率：
[0093]给药后持续观察小鼠的生存状况，记下小鼠的死亡时间，连续观察5天，绘制生存曲线。
[0094]结果如图5和表5所示，携带药物的人中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力显著增强。
[0095]表5 携带药物的人中性粒细胞对临床多重耐药菌的杀菌能力
[0096]
[0097]6、与同等剂量的药物相比，以中性粒细胞为药物载体显著提高杀菌效果，降低炎症反应
[0098]采用小鼠急性肺炎模型，感染后2小鼠尾静脉注射2×106中性粒细胞或同等剂量的阿奇霉素和多粘菌素E。
[0099]结果如图6和表6～表8所示，与同等剂量的药物相比，以中性粒细胞为药物载体显著提高杀菌效果，降低炎症反应。
[0100]表6 12小时后，取出肺进行细菌计数
[0101]
[0102]
[0103]表7 小鼠存活率(每组7只小鼠)
[0104]
[0105]表8 肺中炎症因子基因表达水平
[0106]
[0107]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种递送体系及在制备抗感染药物中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gagcaccttc ttttccttca tctt 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tcacacacca gcaggttatc atc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
tagtccttcc taccccaatt tcc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ttggtcctta gccactcctt c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
cacctcaaga acatccagag ct 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
caagcagaac tgaactacca tcg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ccctcacact cagatcatct tct 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gctacgacgt gggctacag 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
gattactgct ctggctccta gc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
gactcatcgt actcctgctt gc 22