1.一种DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：为具有腺苷母核的结构I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R1选自以下任一结构：

R2选自以下任一结构：
。
2.根据权利要求1所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：其中R1、R2需同时取代；均独立地选自上述结构。
3.根据权利要求1或2所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：其为具有式III到X任一所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：

4.根据权利要求1或2任一项所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：其用于抑制DNMT1蛋白的活性。
5.根据权利要求1或2任一项所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：其能以同时占据SAH和底物胞嘧啶结合空腔的方式抑制DNMT1蛋白的活性。
6.根据权利要求4所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：所述DNMT1蛋白是人源DNMT1。
7.根据权利要求5所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：具有式III到X所示结构的化合物在20μM浓度条件下能不同程度的有效抑制DNMT1蛋白发挥甲基化功能，其中III、IV、V、VI的抑制率与阳性对照RG108相当，所有化合物的抑制率均优于SAH。
8.根据权利要求3所述DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：具有X所示结构的化合物在HEK-293T细胞上有抑制DNMT1甲基化反应的活性，并且比SAH有更好的细胞活性。
9.一种药物组合物，包括权利要求1或2任一项所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂以及药剂学上可接受的辅料。

技术领域
[0001]本发明属于药物化学领域，尤其是涉及一种DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂及其应用。
背景技术
[0002]DNA 5-甲基胞嘧啶甲基化(胞嘧啶5号碳原子上修饰甲基基团)是哺乳动物中一种重要的表观遗传修饰，参与调节多种生物学过程。如基因组印记、X染色体失活、转录抑制、胚胎发育等。介导DNA甲基化过程的主要是一类名为DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)家族的蛋白。其发挥催化作用机制是：通过将催化辅因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团转移到胞嘧啶5位的碳原子上，同时脱去甲基的SAM被还原为S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH是生物体内天然的DNMTs抑制剂。DNMTs家族成员包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B，及无催化活性的结构亚基DNMT3L。其中DNMT1是DNMTs家族中第一个被发现，同时也是含量最多的一种亚型，发挥甲基化维持的作用，这对于抵抗由于细胞有丝分裂而引起的被动去甲基化、维持胚胎发育早期建立起来的甲基化模式起着至关重要的作用；DNMT3A/3B介导DNA的从头甲基化,对于生殖细胞和早期胚胎细胞建立甲基化模式至关重要；DNMT3L本身无催化活性，通过与DNMT3A/3B结合辅助其发挥催化功能。
[0003]人体内约60-70％的CpG位点被甲基化，并形成了细胞类型特异性的DNA甲基化模式。正确的甲基化模式对于维持细胞正常发育至关重要。甲基化模式的改变往往与疾病的发生、发展相关。近年来，越来越多的研究表明，DNA过度甲基化与包括乳腺癌、直肠癌、膀胱癌等在内的多种癌症相关。体外实验结果表明，通过施加DNMT1抑制剂或敲除DNMT1基因可以促使癌细胞凋亡。人们普遍认为这是由于DNA启动子区域去甲基化从而导致抑癌基因重新激活而导致的。目前，已有以DNMT1为靶点的药物上市，如核苷类似物地西他滨、吉西他滨等。这类药物虽然可在很大程度上抑制癌细胞中DNA的过甲基化，但其发挥作用的方式是与DNMT1非可逆地共价结合，若长久使用则容易对人体产生各种毒副作用，甚至有危及生命的可能性。因此，开发新型的、选择性高且具有活性的DNMT1抑制剂就显得尤为重要。
[0004]现有的DNMT1抑制剂主要分为两类。第一类是核苷类似物，这类化合物的化学骨架及作用模式都比较相似，即通过模拟胞嘧啶参与到DNA合成过程中，进而”捕获”DNMT1，形成共价复合物(如图1所示)，最终达到抑制DNMT1甲基化的作用。这类化合物中，以地西他滨和吉西他滨为代表的多种药物已投入临床使用，用于治疗骨髓增生异常综合征及急性髓性白血病等。从其作用机制中不难发现，这类药物会伴随DNA复制而嵌入到人类基因组中，非可逆地与DNMT1结合，极易产生严重的毒副作用，若大剂量使用可引起神经毒性，嗜睡、失语、偏瘫等症状。由于是核苷类似物，该类化合物缺乏对DNMTs家族的选择性。此外，该类化合物存在药动学性质不稳定、半衰期短等问题，对于药物存储和运输也带来了诸多不便。目前在临床中多仅用于应对非实体瘤，使用范围狭窄。第二类则是非核苷类药物，这类药物通过模拟DNMT1活性口袋中辅因子SAM的结合模式从而发挥与其竞争结合的作用，如SAM脱去甲基后的产物SAH就属于该类抑制剂。这类化合物在过去的二十几年间已有多个研究团队对此进行了探索，获得了一系列潜在的针对DNMT1的有效抑制剂。
[0005]2006年，Siedlecki,P.等人通过虚拟筛选获得了第一个活性突出的非核苷类DNMT1抑制剂—RG108。进一步研究结果表明，它可以抑制细菌的DNA甲基转移酶M.Sss I，体外活性IC50可以达到纳摩尔级别。虽然RG108对几种类别的癌细胞展现出良好的杀伤能力，但对细胞内甲基化水平无明显降低作用，暗示了其可能通过其他途径发挥的抗肿瘤活性。2011年，Medina-Franco,J.L.等人通过虚拟筛选的手段获得了一种对DNMT1有抑制作用的天然产物—SGI-1027，其在细胞水平上可以极大幅度地降低甲基化水平，在浓度达到25μM条件下可以使甲基化水平降低90％。2014年，Shijie Chen等人基于计算机虚拟筛选(占据SAM结合口袋)获得了一类结构新颖的咔唑类DNMT1选择性抑制剂DC-05。其具有较高的活性(IC50＝10.3μM)和对DNMT1良好的选择性(对DNMT3A、DNMT3B、组蛋白甲基化酶G9a、SUV39H1、MLL1、SET7/9和PRMT1等各类甲基转移酶抑制活性较差)。接着他们对DC-05又进行了分子结构相似性搜索，鉴定得到了化合物DC_501(IC50＝2.5μM)、DC_517(IC50＝1.7μM)，它们有着比DC_05更高的抑制活性。这三种有效化合物具有显著的抑制癌细胞增殖作用。2017年，SanJosé-Enériz,E等人依据经验和以结构为基础设计合成了一种4-氨基喹啉类为骨架的G9a/DNMT1双靶点抑制剂CM-272[G9a(IC50＝8nM)and DNMT1(IC50＝382nM)]，在小鼠中展现出较好的效力及低毒性。
[0006]尽管上述研究已经取得了令人激动的成果，但到目前为止还没有相关的药物分子通过临床研究上市。非核苷类药物虽然避免了胞苷类似物非可逆结合带来的潜在毒副作用，但考虑到这类药物设计初衷是通过占据SAM结合位点发挥抑制作用，而人体内还存在多种蛋白甲基转移酶也存在SAM结合位点，这可能导致此类药物选择性较差，影响了临床试验的结果。
发明内容
[0007]有鉴于此，为解决上述问题，本发明利用分子虚拟筛选、分子骨架跃迁的手段筛选并设计获得了一种针对DNMT1的双底物抑制剂，该抑制剂可以同时占据SAM/SAH结合位点以及底物结合口袋。并以此作为先导化合物改造合成了一系列衍生物。并对这些衍生物进行了体外生化水平、细胞内的活性研究，获得了同时具有体外和细胞内活性的改造产物，并以分子对接为辅助进行了构效关系研究。由此本发明提出了一种DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂及其应用。
[0008]具体而言，本发明一方面提供了一种DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，其技术方案是这样实现的：
[0009]一种DNA甲基化酶DNMT1双底物抑制剂，其特征在于：为具有腺苷母核的结构I所示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0010]
[0011]其中，R1选自以下任一结构：
[0012]
[0013]
[0014]R2选自以下任一结构：
[0015]
[0016]其中R1、R2需同时取代；均独立地选自上述结构。
[0017]进一步的，所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂为具有式子II到X任一所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
[0018]
[0019]十四种以核苷为母核的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂是基于DNMT1辅因子SAM/SAH结合口袋及底物胞嘧啶结合口袋筛选设计改造而来。这十四种以核苷为母核的DNMT1双底物抑制剂均可在体外抑制DNMT1与DNA的甲基化反应，是DNMT1蛋白的有效抑制剂。
[0020]进一步的，所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂用于抑制DNMT1蛋白的活性。
[0021]进一步的，所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂能以一种非共价的方式抑制DNMT1蛋白的活性。
[0022]进一步的，所述DNA甲基转移酶DNMT1是人源DNMT1。
[0023]进一步的，所述DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂，具有式Ⅱ到X所示结构的化合物体外在20μM浓度能不同程度的有效抑制DNMT1蛋白发挥甲基化功能，其中III、IV、V、VI的抑制率与阳性对照RG108相当，所有化合物的抑制率均优于SAH。
[0024]进一步的，具有式X所示结构的化合物在HEK-293T细胞上有抑制DNMT1甲基化反应的活性，并且和SAH相比有更好的细胞活性。
[0025]本发明另一还提供了一种药物组合物，包括所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂以及药剂学上可接受的辅料、稀释剂、载体或它们的组合。
[0026]本发明再一方面还提供了所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂或药物组合物，在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0027]所述药物是通过抑制DNMT1对DNA甲基化催化功能，进而上调抑癌基因表达，从而达到治疗癌症相关疾病的作用。
[0028]相对于现有技术，本发明所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂及其应用具有以下优势：
[0029](1)本发明利用虚拟筛选手段获得了能够很好占据DNMT1底物结合口袋的碎片分子，然后基于组合化学的思想将碎片分子与SAH分子组合，并利用虚拟骨架跃迁的手段对组合后的分子结构虚拟优化，最终获得了两个体外活性良好的DNMT1双底物抑制剂——即上文所述的式II、III。DNMT1双底物抑制剂对于提高与DNMT1亲和力以及选择性有重要意义。主要体现在活性更高，毒副作用更小。
[0030](2)以II、III为先导化合物改造合成了一系列衍生物。通过体外活性检测和HEK-293T细胞上的细胞活性实验，最终获得细胞水平活性高于SAH的化合物——即上文所述的式X。
[0031](3)本发明所述的DNA甲基转移酶DNMT1双底物抑制剂作为抗多种癌症靶点DNMT1蛋白的有效双底物抑制剂，可将其作为进一步开发的候选或者先导化合物用于制备相关药物。
附图说明
[0032]构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0033]图1为核苷类DNMT1抑制剂通过共价结合DNMT1发挥作用原理示意图；
[0034]图2为已报道的活性较强的DNMT1非核苷类抑制剂结构示意图；
[0035]图3为DNMT1 SAM/SAH结合口袋以及底物结合口袋表面图；
[0036]图4为所筛选获得的占据DNMT1底物结合口袋的碎片分子结构及与DNMT1结合模式；
[0037]图5为通过组合化学思想结合骨架跃迁设计得到先导化合物思路示意图；
[0038]图6为通过组合化学思想结合骨架跃迁设计得到的两个先导化合物分子——II、III二维结构；
[0039]图7为化合物II、III核磁共振氢谱图；
[0040]图8为式II、III与DNMT1的结合模式图；
[0041]图9为DNMT1体外活性检测原理示意图；
[0042]图10为DNMT1体外活性检测荧光强度随时间变化；
[0043]图11为使用分子筛分离DNMT1出峰位置图；
[0044]图12为DNMT1蛋白表达纯化后得到的SDS-PAGE电泳图；
[0045]图13为对DNMT1双底物抑制剂细胞活性检测原理示意图；
[0046]图14为DNMT1双底物抑制剂细胞活性检测结果；
[0047]图15为分子X细胞活性定量检测结果；
[0048]图16为细胞活性良好的分子(式X)与DNMT1结合模式图。
具体实施方式
[0049]除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些属于进行下述定义。
[0050]在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。
[0051]所有的数字标识，例如pH、温度、时间、浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。同时也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。
[0052]除了特别说明，本文中提及的各种试剂均为市收购得。
[0053]下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
[0054]一、先导化合物获得方式
[0055]1.基于DNMT1底物结合口袋的三维结构，利用虚拟筛选的手段获得了能够很好结合在该位置处的碎片分子。如图2和图3所示。
[0056]2.图3展示了DNMT1底物结合口袋以及SAM/SAH结合口袋。利用组合化学的思想将筛选到的碎片分子(如图4、5)与SAH分子拼接，使之能够同时占据SAH和底物的结合位点。
[0057]3.如图6所示，使用虚拟骨架跃迁的方式优化获得虚拟打分更好，体外活性更优的先导化合物分子——式II、III。
[0058]二、先导化合物优化
[0059]1、为了提高先导化合物跨越细胞膜的能力，在其基础上删减极性官能团，设计合成一系列结构衍生物；
[0060]2、使用分子对接的手段预测改造产物结合DNMT1的能力。图8展示了最初优化得到的式II、III结合DNMT1的3D、2D结合模式图。
[0061]表一改造产物和DNMT1分子对接打分结果
[0062]CompoundsDocking score(kcal/mol)SAH-11.019II-11.545III-13.627IV-11.866V-10.598VI-11.591VII-12.134VIII-11.121IX-10.733X-12.644
[0063]三、化合物合成方法及表征数据
[0064]实施例1：(S)-2-氨基-4-((R)-3-氨基-3-羧丙基)((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氨基)丁酸(化合物II)
[0065]
[0066](1)2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯
[0067]将4-叔丁氧基-3-叔丁氧羰基氨基-4-氧代丁酸(300mg，1.04mmol)，碘甲烷(148mg，1.04mmol)溶于DMF(6ml)中，常温反应过夜得到产物1-(叔丁基)4-甲基(叔丁氧羰基)天冬氨酸。随后将其与NaBH4(39mg，1.04mmol)共同添加至适量体积的甲醇溶液中，室温反应6h，向得到的反应产物中加入DMP(4ml)，室温下反应过夜得到产物2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-氧代丁酸叔丁酯。
[0068](2)9-(3aR，4R，6R，6aR)-6-氨甲基-2，2-二甲基四氢呋喃[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-胺
[0069]将(3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2，2-二甲基四氢呋喃[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-甲醇(300mg，0.98mmol)，4-甲基苯磺酰氯(186mg，0.98mmol)溶于吡啶(6ml)中，随后先后加入1，3-二氧代异吲哚啉-2-酯(143mg，0.98mmol)、肼(35mg，1.1mmol)，室温反应过夜得到9-(3aR，4R，6R，6aR)-6-氨甲基-2，2-二甲基四氢呋喃[3，4-d][1，3]二氧杂环戊烯-4-基)-9H-嘌呤-6-胺。
[0070](3)(2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氮杂二基)双(2-氨丁酸酯)
[0071]分别取实例1步骤1、2得到的产物各200mg共同溶于20ml DCE中，加入4ml TFA,加热回流，反应四小时后加入4ml水，继续搅拌。用薄层层析板监控反应进度。得到的反应液旋蒸除去溶剂，加入4ml甲醇溶解，补加适量的乙醚，抽滤，收集沉淀物。通过硅胶柱层析分离纯化，其中洗脱剂配置比例为二氯甲烷：甲醇：氨水＝1：1：0.1。得到的目标产物为白色粉末，产率在30％-32％之间。HRMS(ESI-TOF):m/z 468.210[M+H]+。1H NMR(400MHz,D2O):δ8.08(d,J＝3.1Hz,1H),7.95(d,J＝3.0Hz,1H),5.88(t,J＝3.9Hz,1H),4.62(d,J＝4.4Hz,9H),4.18(dq,J＝31.9,5.5,4.3Hz,2H),3.63(q,J＝4.9,3.4Hz,2H),3.16–2.45(m,6H),1.93(ddt,J＝48.7,14.8,7.1Hz,4H).
[0072]实施例2：(R)-2-氨基-5-((R)-3-氨基-3-羧丙基)((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氨基)戊酸(化合物III)
[0073]
[0074](1)2-[双(叔丁氧羰基)氨基]-5-叔丁基氧戊酸酯
[0075]2-(叔丁氧羰基)氨基-5-甲氧基-5-氧代戊酸(300mg，1.15mmol)，2，2，2-三氯乙酰亚胺酸叔丁酯(251mg，1.15mmol)溶于二氯甲烷(6ml)，随后先后加入二碳酸二叔丁酯(251mg，1.15mmol)、硼氢化钠(48mg，1.27mmol)、DMP(4ml)室温反应过夜得到2-[双(叔丁氧羰基)氨基]-5-叔丁基氧戊酸酯。
[0076](2)(2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氮杂二基)双(2-氨丁酸酯)
[0077]分别取实例1步骤2和实例2步骤1中得到的产物各250mg共同溶于20ml DCE中，加入4ml TFA,加热回流，反应四小时后加入4ml水，继续搅拌。用薄层层析板监控反应进度。得到的反应液旋蒸除去溶剂，加入4ml甲醇溶解，补加适量的乙醚，抽滤，收集沉淀物。通过硅胶柱层析分离纯化，其中洗脱剂配置比例为二氯甲烷：甲醇：氨水＝1：1：0.1。得到的目标产物为白色粉末，产率在30％-32％之间。HRMS(ESI-TOF):m/z 482.220[M+H]+。1H NMR(400MHz,D2O):
[0078]δ8.10(s,1H),7.99(s,1H),5.90(d,J＝4.6Hz,1H),4.65(t,J＝5.0Hz,9H),4.20(dt,J＝24.9,5.6Hz,2H),3.88–3.37(m,2H),3.23–2.47(m,6H),2.22–1.06(m,6H).实施例3：(S)-2-氨基-5-(((R)-4-氨基-4-羧基丁基)((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氨基)戊酸(化合物Ⅳ)
[0079]
[0080](1)叔丁基(R)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯
[0081]将9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(氨基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(150mg，0.49mmol),(S)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯溶(20mg，0.49mmol)溶于DCM(3mL)中，反应体系在室温下搅拌1小时。将反应体系温度降至0℃，向反应体系中分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(310mg，1.47mmol)。反应体系在室温下搅拌过夜。加入适量饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，混合液使用DCM分液萃取，有机相依次用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，经硅胶柱分离纯化得到叔丁基(R)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(170mg，收率：52％)，白色固体。
[0082](2)叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代醇-4-基)甲基)((R)-4-(双(叔丁氧基羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊基)氨基)-2-(双(特丁氧基酰基)氨基)戊酸酯
[0083]参照实例3步骤(1)的方法，使用叔丁基(R)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(170mg，0.25mmol)，(S)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)-5-氧代戊酸叔丁酯溶(10mg，0.25mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(155mg，0.75mmol)为原料，得到(2)叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代醇-4-基)甲基)((R)-4-(双(叔丁氧基羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊基)氨基)-2-(双(特丁氧基酰基)氨基)戊酸酯(147mg，收率：56％)，白色固体。
[0084](3)(S)-2-氨基-5-(((R)-4-氨基-4-羧基丁基)((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氨基)戊酸
[0085]将叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代醇-4-基)甲基)((R)-4-(双(叔丁氧基羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊基)氨基)-2-(双(特丁氧基酰基)氨基)戊酸酯(147mg，0.14mmol)溶于1，4-二氧六环(3mL)中，加入4M/L的盐酸水溶液(0.1mL)，于50℃搅拌过夜。用4M/L的氢氧化钠水溶液中和反应液至PH中性，减压浓缩，干法上样，经硅胶柱分离纯化得到(S)-2-氨基-5-(((R)-4-氨基-4-羧基丁基)((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氨基)戊酸(84mg，收率：60％)，白色固体。HRMS(ESI-TOF):m/z 497.2462[M+H]+。1H NMR(400MHz,D2O):8.24(s,1H),8.19(s,1H),6.04(d,J＝4.7Hz,1H),4.80(t,J＝5.1Hz,1H),4.47–4.33(m,2H),3.67(h,J＝2.6Hz,2H),3.52(s,2H),3.16(d,J＝8.3Hz,4H),1.80(s,8H)。
[0086]实施例4：(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(4-羧基丁基)氨基)戊酸(化合物Ⅴ)
[0087]
[0088](1)叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代醇-4-基)甲基)(5-(叔丁氧基)-5-氧代戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯
[0089]参照实例3步骤(1)的方法，使用叔丁基(R)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(170mg，0.25mmol)，5-氧代戊酸叔丁酯(43mg，0.25mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(155mg，0.75mmol)为原料，得到叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代醇-4-基)甲基)(5-(叔丁氧基)-5-氧代戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(150mg，收率：72％)，白色固体。
[0090](2)(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(4-羧基丁基)氨基)戊酸
[0091]参照实例3步骤(3)，使用叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧代醇-4-基)甲基)(5-(叔丁氧基)-5-氧代戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(150mg，0.18mmol),4M/L的盐酸水溶液为原料，得到(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(4-羧基丁基)氨基)戊酸(43mg，收率：50％)，白色固体。HRMS(ESI-TOF):m/z482.2352[M+H]+。1H NMR(400MHz,D2O):8.26(s,1H),8.20(s,1H),6.07(d,J＝4.6Hz,1H),4.86(t,J＝5.0Hz,1H),4.50–4.36(m,2H),3.69(t,J＝5.8Hz,1H),3.43(h,J＝5.3Hz,2H),3.13–2.99(m,4H),2.11(t,J＝7.1Hz,2H),1.91–1.71(m,4H),1.64–1.40(m,4H)。
[0092]实施例5：(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(5-羟基戊基)氨基)戊酸(化合物Ⅵ)
[0093]
[0094](1)叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯
[0095]参照实例3步骤(1)的方法，使用叔丁基(R)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(170mg，0.25mmol)，5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊醛(54mg，0.25mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(155mg，0.75mmol)为原料，得到叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(149mg，收率：68％)，白色固体。
[0096](2)(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(5-羟基戊基)氨基)戊酸
[0097]参照实例3步骤(3)，使用叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(149mg，0.17mmol),4M/L的盐酸水溶液为原料，得到(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(5-羟基戊基)氨基)戊酸(54mg，收率：68％)，白色固体。HRMS(ESI-TOF):m/z 468.2562[M+H]+。1H NMR(400MHz,D2O):8.28(s,1H),8.20(s,1H),6.04(d,J＝4.3Hz,1H),4.32(q,J＝6.9,5.7Hz,2H),3.62(t,J＝5.9Hz,1H),3.46(tt,J＝6.5,3.4Hz,2H),3.03–2.88(m,2H),2.65(dt,J＝30.6,10.4Hz,4H),1.80(q,J＝7.1Hz,2H),1.62(p,J＝7.5Hz,2H),1.35(dd,J＝14.2,7.4Hz,4H),1.16(tt,J＝15.0,7.1Hz,2H)。
[0098]实施例6：(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(5-氨基戊基)氨基)戊酸(化合物Ⅶ)
[0099]
[0100](1)叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)(5-(1,3-二氧异吲哚-2-基)戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯
[0101]参照实例3步骤(1)的方法，使用叔丁基(R)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(170mg，0.25mmol)，5-(1,3-二氧异吲哚-2-基)戊醛(54mg，0.25mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(155mg，0.75mmol)为原料，得到叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)(5-(1,3-二氧异吲哚-2-基)戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(167mg，收率：75％)，白色固体。
[0102](2)(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(5-氨基戊基)氨基)戊酸
[0103]将叔丁基(S)-5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)(5-(1,3-二氧异吲哚-2-基)戊基)氨基)-2-(双(叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(167mg，0.18mmol)溶于乙醇(3mL)中，加入水合肼(90mg，2.88mmol)，于78℃回流3小时，过滤除去生成的副产物，将滤液旋干，重复操作至无白色絮状物产生。将粗产物溶于1，4-二氧六环(3mL)中，加入4M/L的盐酸水溶液(0.1mL)，于50℃搅拌过夜。用4M/L的氢氧化钠水溶液中和反应液至PH中性，减压浓缩，干法上样，经硅胶柱分离纯化得到(R)-2-氨基-5-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(5-氨基戊基)氨基)戊酸(42mg，收率：50％)，白色固体。HRMS(ESI-TOF):m/z 467.2719。1H NMR(400MHz,D2O):8.29(s,1H),8.21(s,1H),6.03(d,J＝4.5Hz,1H),4.28(td,J＝9.5,8.5,3.7Hz,2H),3.27(s,1H),2.96–2.70(m,4H),2.49(ddd,J＝17.5,11.9,7.1Hz,4H),1.57–1.07(m,10H)ppm。
[0104]实施例7：(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(5-氨基戊基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(化合物Ⅷ)
[0105]
[0106](1)2-(5-(((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)甲基)氨基)戊基)异吲哚-1,3-二酮
[0107]参照实例3步骤(1)的方法，以9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(氨基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(150mg，0.49mmol),5-(1,3-二氧异吲哚-2-基)戊醛(107mg，0.49mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(310mg，1.47mmol)为原料，得到2-(5-(((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)甲基)氨基)戊基)异吲哚-1,3-二酮(112mg，收率：44％)，白色固体。
[0108](2)2,2'-(3-(3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氮杂二基)双(戊烷-5,1-二基))双(异吲哚-1,3-二酮)
[0109]参照实例3步骤(1)的方法，以2-(5-(((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧-4-基)甲基)氨基)戊基)异吲哚-1,3-二酮(112mg，0.21mmol),5-(1,3-二氧异吲哚-2-基)戊醛(48mg，0.21mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(130mg，0.63mmol)为原料，得到2,2'-(3-(3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氮杂二基)双(戊烷-5,1-二基))双(异吲哚-1,3-二酮)(108mg，收率：70％)，白色固体。
[0110](3)(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(5-氨基戊基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇
[0111]参照实例7步骤(3)的方法，以2,2'-(3-(3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氮杂二基)双(戊烷-5,1-二基))双(异吲哚-1,3-二酮)(108mg，0.15mmol)，水合肼(75mg，2.4mmol)，4M/L的盐酸水溶液(0.1mL)为原料，得到(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(5-氨基戊基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(32mg，收率：50％)，白色固体。HRMS(ESI-TOF):m/z437.2984。1H NMR(400MHz,D2O):δ＝8.27(s,1H),8.19(s,1H),6.00(d,J＝4.6Hz,1H),4.86(t,J＝4.8Hz,2H),4.29–4.19(m,2H),2.89–2.71(m,2H),2.52(t,J＝7.2Hz,4H),2.43(dd,J＝10.0,5.9Hz,3H),1.38–1.21(m,8H),1.10(tq,J＝13.2,6.9Hz,4H)。
[0112]实施例8：5,5'-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氮二基)二戊酸(化合物Ⅸ)
[0113]
[0114](1)5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)戊酸叔丁酯
[0115]参照实例3步骤(1)的方法，以9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(氨基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(150mg，0.49mmol),，5-氧代戊酸叔丁酯(85mg，0.49mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(310mg，1.47mmol)为原料，得到5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)戊酸叔丁酯(68mg，收率：30％)，白色固体。
[0116](2)5,5'-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氮杂二基)二戊酸二叔丁酯
[0117]参照实例3步骤(1)的方法，以5-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氨基)戊酸叔丁酯(68mg，0.15mmol)，5-氧代戊酸叔丁酯(25mg，0.15mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(93mg，0.45mmol)为原料，得到5,5'-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氮杂二基)二戊酸二叔丁酯(33mg，收率：36％)，白色固体。
[0118](3)5,5'-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氮二基)二戊酸
[0119]参照实例3步骤(3)的方法，使用5,5'-((((3aR，4R，6R，6aR)-6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)甲基)氮杂二基)二戊酸二叔丁酯,4M/L的盐酸水溶液为原料，得到5,5'-((((2R，3S，4R，5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)氮二基)二戊酸(6mg，收率：23％)，白色固体。HRMS(ESI-TOF):m/z 467.2246[M+H]+。1H NMR(400MHz,D2O):8.24(s,1H),8.19(s,1H),6.06(d,J＝4.6Hz,1H),4.89(t,J＝4.9Hz,2H),4.46(dq,J＝15.7,4.9Hz,2H),3.70–3.54(m,2H),3.21(t,J＝8.2Hz,4H),2.14(t,J＝7.2Hz,2H),1.67–1.57(m,4H),1.48(p,J＝7.9Hz,4H)。实施例9：(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(5-羟基戊基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(化合物Ⅹ)
[0120]
[0121](1)9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(((5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺
[0122]参照实例3步骤(1)的方法，以9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(氨基甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(150mg，0.49mmol),5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊醛(106mg，0.49mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(310mg，1.47mmol)为原料，得到9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(((5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(102mg，收率：41％)，白色固体。
[0123](2)9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-((双(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺
[0124]参照实例3步骤(1)的方法，以9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-(((5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(102mg，0.20mmol)，5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊醛(43mg，0.20mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(124mg，0.60mmol)为原料，得到9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-((双(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(99mg，收率：70％)，白色固体。
[0125](3)(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(5-羟基戊基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇
[0126]参照实例3步骤(3)的方法，使用9-((3aR，4R，6R，6aR)-6-((双(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)戊基)氨基)甲基)-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]二氧基-4-基)-9H-嘌呤-6-胺(99mg，0.14mmol),4M/L的盐酸水溶液为原料，得到(2R，3R，4S，5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((双(5-羟基戊基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(28mg，收率：45％)，白色固体。HRMS(ESI-TOF):m/z 439.2661[M+H]+。1H NMR(400MHz,D2O):8.25(s,1H),8.20(s,1H),6.05(d,J＝4.6Hz,1H),4.92(t,J＝4.6Hz,1H),4.50–4.40(m,2H),3.67–3.48(m,3H),3.42(s,2H),3.17(t,J＝8.2Hz,4H),1.57(s,5H),1.27(d,J＝85.0Hz,8H)。
[0127]四、对改造所得化合物进行体外活性检测验证
[0128]1.进行DNMT1蛋白的表达纯化
[0129]把编码人源DNMT1-728-1600(DNMT1编码728-1600号残基的序列)的目的基因片段插入pFastbac-GST载体的多克隆位点中,构建好插入DNMT1(728-1600)的原核扩增重组质粒。
[0130]将该重组质粒转入大肠杆菌DH5α，涂布于含有100μg/ml氨苄霉素的LB固体培养基中，于37℃培养8-12h。挑取单菌落，在LB培养基中培养过夜，提取质粒。
[0131]测序无误后，将重组质粒转入大肠杆菌DH10bac，涂布于含有10μg/ml四环素、7μg/ml庆大霉素、50μg/ml卡那霉素、40μg/ml IPTG、100μg/ml X-gal的LB固体培养基中，于37℃培养48h。
[0132]挑取白色单菌落，使用异丙醇沉淀法提取重组bacmid。
[0133]将提取的bacmid在脂质体的协助下转染进入昆虫细胞SF21，扩增传代，收集三代病毒悬液。使用三代病毒悬液对大量昆虫细胞SF21侵染。
[0134]等待3天，收集昆虫细胞，将细胞悬浮在冰冷的缓冲液(20mM Tris pH 8.0,1MNaCl,1mM DTT,1mM PMSF)中超声裂解细胞，通过高速离心除去细胞碎片，收集上清。随后使用GST柱纯化目标蛋白。待上清与GST磁珠充分结合后，使用洗涤缓冲液(20mM Tris-HClpH8.0,1M NaCl,1mM DTT)进行洗涤去除不与磁珠结合的杂蛋白。最后使用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0,1M NaCl,1mM DTT)洗脱目的蛋白。向洗脱后的蛋白溶液中加入适量的PreScission Protease蛋白酶进行酶切以除去融合蛋白上的GST标签。切除标签后的蛋白质经过浓缩后,用分子筛Superdex 200(GE Healthcare)进行进一步的分离纯化。收集DNMT1蛋白所对应的峰(图11)，经SDS-PAGE验证后，浓缩，降盐，最后分装冻存于-80℃。图12为DNMT1蛋白的表达纯化后得到的SDS-PAGE电泳图。
[0135]2.化合物筛选和活性测试
[0136]检测原理：
[0137]见图9，本发明采用的酶活检测方法是基于酶偶联的方式进行的，DNMT1通过SAM依赖的甲基化作用可以特异性识别底物发卡DNA中半甲基化CpG识别位点，并催化胞嘧啶成为甲基胞嘧啶。此时，完全甲基化的CpG位点被Gla I核酸内切酶特异性识别并切割。致使发卡DNA原本靠近的5‘端和3’端分离。在5‘端存在荧光基团，3’端存在荧光淬灭接团。随着5‘端和3’端的分离，荧光基团远离荧光淬灭基团，反应体系荧光强度增加。荧光增加的强度与DNA甲基化程度正相关。
[0138]实验操作：
[0139]实验组：向96孔板黑色板中先后加入SAM、测试化合物、bufferA、DNA，使终体积达90微升。其中buffer A成分为：100mM NaCl，10mM Tris-HCl 7.5,5mM MgCl2,1mM DTT,5％甘油,0.1mg/ml BSA。于37℃预平衡20-25分钟。向每孔中加入10微升反应液，反应液由buffer A、Gla I、DNMT1组成，加入后使最终各成分浓度或含量达到如下标准：DNMT1:80nM、Gla I:1U、SAM:20μM、DNA:50nM、测试化合物:20μM。
[0140]对照组：将测试化合物用等体积DMSO替代，其余条件同实验组。
[0141]实验结果：
[0142]表二展示了改造后的产物在终浓度20μM条件下对DNMT1的抑制率。从结果可以看出式II～X九种DNMT1双底物抑制剂对DNMT1展现出中等及以上的抑制能力，大多数活性超过产物SAH，其中III、IV、V、VI的抑制率与阳性对照RG108相当，所有化合物的抑制率均优于SAH。
[0143]
[0144]表二化合物(式II～X)体外活性检测结果
[0145]Compoundsinhibition rate in 20μM(％)RG10877.9SAH52.3II62.7III74.4IV81.5V73.5VI73.4VII68.1VIII65.1IX60.6X64.0
[0146]3.HEK-293T细胞上的DNA甲基化定性活性检测实验
[0147]检测原理：
[0148]如图13所示，本发明所采用的DNMT1双底物抑制剂细胞活性检测方法是一种荧光素酶报告基因指示的方法。首先，将调控下游荧光素酶基因的启动子区域体外甲基化，然后转染进入HEK-293T细胞内。甲基化后的启动子启动转录的能力受到抑制，因此在进入HEK-293T细胞后，荧光素酶低量表达；此时施加DNMT1抑制剂则会抑制HEK-293T细胞内DNMT1甲基转移酶的活性，在经历几次细胞分裂后，报告基因上游的启动子甲基化水平降低。相应地下游荧光报告基因的启动转录的能力增强，荧光强度随之增加。
[0149]实验操作：
[0150]首先，对PGL-GFP荧光报告基因载体的TA启动子进行体外突变，破坏其原有的增强下游报告基因转录的能力。并在GFP荧光基因上游多克隆位点处插入一段预先经过M.Sss I体外甲基化处理后的CMV序列。
[0151]将HEK-293T细胞在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，在37℃和5％CO2的环境下保持。
[0152]当细胞在60mm培养皿中覆盖80％-90％时，用以下转染混合物转染：6μg荧光素酶报告基因，20μg PEI Max。
[0153]转染48h后，用胰蛋白酶消化。接种到96孔板中，保证每孔细胞数目控制在10000-30000个之间。放置在37℃，5％ CO2培养箱中6h,使接种的HEK-293T细胞充分贴壁生长。
[0154]向接种有HEK-293T细胞的96孔板中施加稀释成不同浓度的测试药物，使培养基中药物终浓度达到0、3.2、6.3、12.5、25、50、100μM。空白对照组向培养液中添加等体积DMSO。
[0155]给药24h后，吸除96孔板中的培养液，并用磷酸盐缓冲液润洗两遍。向其中加入100微升的细胞裂解液，于冰上孵育30min。
[0156]每孔添加荧光素酶反应液，在酶标仪中检测360-700nm范围内的荧光强度。在室温下进行三次重复实验。其中荧光素酶反应液成分组成为：20μM ATP、20mM MgCl2、20μM荧光素。反应液buffer成分为：500mM NaCl2、20mM HEPES 8.0、1mM DTT。
[0157]检测结果：
[0158]由图10可知，式X所示化合物在HEK-293T细胞上与同为DNMT1非核苷类抑制剂的SAH相比有更好的细胞活性。此外图13展示了其与DNMT1的2D结合模式。
[0159]4.B2-11细胞上的DNA甲基化定量活性检测实验
[0160]检测原理：
[0161]本发明所采用的DNMT1双底物抑制剂细胞活性检测方法是一种稳定转染的荧光素酶报告基因指示的方法。首先，将调控下游EGFP(增强型荧光素酶)基因的启动子区域体外甲基化，转染进入B2-11细胞中，经抗性筛选获得稳定转染的细胞系。在施加DNMT1抑制剂后，报告基因启动子的甲基化水平降低，从而减弱对下游EGFP的抑制，荧光强度随之增加。
[0162]实验操作：
[0163]首先，将启动子区域甲基化的EGFP抗性基因转染进入B2-11细胞中。在新霉素存在的条件下经过几轮抗性筛选获得稳定转染的细胞系。
[0164]将筛选得到的稳定转染的B2-11细胞在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，在37℃和5％CO2的环境下保持。
[0165]将细胞按每孔1*106的密度接种到六孔板中，放置在37℃，5％CO2培养箱中6h，使其充分贴壁。
[0166]向接种有B2-11细胞的六孔板中施加稀释成不同浓度的测试药物，使培养基中药物终浓度达到8、16、32、64、128、256μM。空白对照组向培养液中添加等体积DMSO。给药4d后，吸出上清，胰蛋白酶消化90s,离心弃上清,用1ml PBS重悬底层细胞。重悬的细胞用检测型细胞流式仪记录单细胞荧光强度，每次吸取10000个细胞，PMT电压设置为200V。
[0167]检测结果：
[0168]由图15可知，式X所示化合物在B2-11细胞上与同为DNMT1非核苷类抑制剂的`SAH相比有更好的细胞活性,EC50为129.3μM。