本发明涉及神经退行性疾病的药物研究,具体涉及ACT001在制备治疗帕金森药物和治疗NLRP3炎症小体介导的神经炎药物上的应用,将ACT001与医药上可接受的辅料制备成药剂。本研究发现,ACT001可有效减缓帕金森症状,以及可以减缓NLRP3炎症小体介导的神经炎。
1.一种包括如下分子式的倍半萜内酯类化合物ACT001和L-DOPA的协同组合物在制备治疗帕金森药物上的应用:
所述ACT001与L-DOPA的给药剂量分别为20mg/kg、5mg/kg。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征是,所述帕金森是MPTP诱导帕金森综合症。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征是,将倍半萜内酯类化合物与医药上可接受的辅料制备成药剂。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征是,所述药剂为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征是,所述药剂为注射剂或口服剂。
技术领域
[0001]本发明属于神经退行性疾病的医药领域,具体涉及ACT001在制备治疗帕金森药物和治疗NLRP3炎症小体介导的神经炎药物上的应用。
背景技术
[0002]L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)是当前用于治疗帕金森氏病(PD)的主要药物。但是,长期使用L-DOPA会引起严重的副作用,主要表现在使神经元大量损伤与死亡,因为人体中除了多巴胺能神经元外,其他神经细胞缺少对多巴胺的储存和消除反馈机制,当L-DOPA进入人体后被吸收转化成多巴胺,对于非多巴胺能神经元而言,难以储存和消除多巴胺,会引起游离的多巴胺聚集极易被氧化形成醌,进而影响细胞活性。实验证明,其形成的多巴胺醌、多巴醌会与酪氨酸轻化酶(TH)、5-轻色胺轻化酶形成醌蛋白,进而引起帕金森患者在治疗过程中的神经元大量损伤与死亡。目前没有药物能有效地减轻或阻止L-DOPA所引起的副作用。
[0003]炎症小体在炎症相关疾病的发生发展中发挥重要作用,其中NLRP3炎症小体能够被多种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)激活,进而活化caspase-1,释放成熟形式的IL-1β和IL-18,引起机体的炎症反应,并参与多种疾病的发生发展,包括2型糖尿病、痛风、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、肿瘤、炎症性肠病等。因此,研究NLRP3炎症小体的作用机制不仅有助于加深对炎症性疾病发生发展的认识,也为寻找此类疾病的潜在治疗靶点提供了新的思路
[0004]鉴于NLRP3在神经退行性疾病中的重要作用,其靶向治疗存在一定潜力。但是由于其机制研究尚不完善,而单纯应用NLRP3炎症小体相关的抑制剂等可能会引起系统性反应,带来严重副反应。因此,研究新型治疗方法需要着眼于中枢神经系统中NLRP3激活的特异性通路,探究可能的相关受体或者抑制剂等。
发明内容
[0005]本发明为解决现有技术中的上述问题,通过研究,发明了一种倍半萜内酯类化合物即ACT001在制备治疗帕金森药物和治疗NLRP3炎症小体介导的神经炎药物上的应用。
[0006]我们希望找到一种与低剂量L-DOPA协同作用的生物活性成分,以达到与大剂量L-DOPA相同的治疗效果。天然活性物质小白菊内酯(PTL)是药用植物小白菊(艾菊)的活性成分,具有抗氧化和抗炎特性。ACT001是二甲基氨基间苯二酚内酯的富马酸盐形式(DMAMCL),是小白菊内酯的衍生物,具有与PTL相当的效果,但在血浆中显示出更高的稳定性,且价格较低。在我们的研究中,我们将ACT001与L-DOPA结合使用来治疗1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶(MPTP)诱发的小鼠帕金森氏病。具体而言,ACT001显着降低了MPTP治疗小鼠的运动功能障碍和多巴胺能神经退行性疾病。此外,ACT001消除了MPTP诱导的小鼠黑质和纹状体中α-突触核蛋白过表达,星形胶质细胞活化和白介素1β(IL-1β)的产生。另外,ACT001增加了黑质和纹状体中抗凋亡信号分子Bcl-2的水平和pAkt/Akt比率,并降低了促凋亡信号分子Bax的水平以及Caspase3的激活。
[0007]本发明的方案是,一种如下分子式的倍半萜内酯类化合物在制备治疗帕金森药物上的应用:本发明所述的上述分子式的倍半萜内酯类化合物即为所述的ACT001。
[0008]本发明另一优选方案是,所述帕金森是MPTP诱导帕金森综合症。
[0009]本发明另一优选方案是,将倍半萜内酯类化合物与医药上可接受的辅料制备成药剂。
[0010]本发明另一优选方案是,所述药剂为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。
[0011]本发明另一优选方案是,所述药剂为注射剂或口服剂。
[0012]本发明还提供上述ACT001在制备治疗NLRP3炎症小体介导的神经炎药物上的应用。
[0013]优选地,将ACT001与医药上可接受的辅料制备成药剂。
[0014]更优选地,所述药剂为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。
[0015]另一优选方案,所述药剂为注射剂或口服剂。
[0016]通过研究,我们发现,在MPTP诱发的帕金森氏病小鼠中,ACT001和L-DOPA(5mg/kg)共同给药的效果与8mg/kg L-DOPA共同给药的效果相同。因此,这些数据表明L-DOPA+ACT001可用于治疗PD。
[0017]另通过研究,我们的发现首次证明了ACT001减轻了MPTP诱导的PD中NLRP3介导的神经炎症。
附图说明
[0018]图1是本发明实施例1总运动距离检测结果图。
[0019]图2是本发明实施例1平均速度检测结果图。
[0020]图3是本发明实施例1触壁次数检测结果图。
[0021]图4是本发明实施例1黑质中TH阳性多巴胺能神经元的免疫染色结果示意图。图5是本发明实施例1图5黑质中TH阳性神经元数量的量化结果示意图。
[0022]图6是本发明实施例1纹状体中TH阳性纤维的免疫染色结果示意图。
[0023]图7是使用Image Pro Premier软件对纹状体中TH阳性末端进行定量结果示意图。
[0024]图8是通过Western印迹对纹状体中TH和α-突触核蛋白的水平进行定量分析结果图。
[0025]图9通过Western印迹对黑质中TH和α-突触核蛋白的水平进行定量分析结果图。
[0026]图10是通过Western印迹在纹状体中定量分析IL-1β,Bcl-2,Bax和裂解的caspase3表达结果示意图。
[0027]图11是通过Western印迹在黑质中对IL-1β,Bcl-2,Bax和裂解的caspase3表达的定量分析结果图。
[0028]图12是黑质中GFAP的免疫染色结果图。
[0029]图13是黑质中星形胶质细胞所占区域的百分比图。
[0030]图14是在纹状体中对GFAP进行免疫染色结果图。
[0031]图15是纹状体中星形胶质细胞所占区域的百分比图。
[0032]图16A通过Western blot检测纹状体中Akt和磷酸化Akt(Ser473)的表达示意图。
[0033]图16B是纹状体的p-Akt/Akt的蛋白质水平量化示意图。
[0034]图16C是Western blot检测黑质中Akt和磷酸化Akt(Ser473)的表达结果示意图。
[0035]图16D黑质中定p-Akt/Akt的蛋白水平结果示意图。
[0036]图17A是实施例2实验设计的时间表示意图。
[0037]图17B是爬杆测试结果图。
[0038]图17C是后肢紧扣严重程度评分图。
[0039]图17D是小鼠认知缺陷测试结果图。
[0040]图18A是黑质中TH阳性多巴胺能神经元的免疫染色图。
[0041]图18B是TH阳性神经元计数的直方图。
[0042]图18C是纹状体中TH阳性纤维的免疫染色图。
[0043]图18D是TH的代表性蛋白质印迹带示意图。
[0044]图18E是表示TH定量分析的直方图。
[0045]图19A是测定MDA水平结果图。
[0046]图19B是测定SOD的活性结果图。
[0047]图19C是测定CAT的活性结果图。
[0048]图19D是IL-6水平结果示意图。
[0049]图19E是TNF-α水平结果示意图。
[0050]图19F是IL-1β的水平结果示意图。
[0051]图20A是在黑质中对ox42进行免疫染色图。
[0052]图20B是对纹状体中的ox42进行免疫染色图。
[0053]图21A是caspase-8,p65,p-p65的蛋白质印迹带示意图。
[0054]图21B是caspase-8定量分析直方图。
[0055]图21C是p-p65定量分析直方图。
[0056]图22A是lpr3,Caspase-1,ProIL-1β,IL-1β的蛋白质印迹带示意图。
[0057]图22B是表示Nlpr3,Caspase-1,ProIL-1β,IL-1β水平定量分析的直方图。
具体实施方式
[0058]下面结合附图对本发明进行详细描述,本部分的描述仅是示范性和解释性,不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。此外,本领域技术人员根据本文件的描述,可以对本文件中实施例中以及不同实施例中的特征进行相应组合。
[0059]实施例一ACT001对帕金森症治疗过程中副作用的减轻
[0060]1、实施例所研究的用于制备疗帕金森药物和治疗NLRP3炎症小体介导的神经炎药物的倍半萜内酯类化合物分子式如下:又称为ACT001,化学名称为:(3R,3aS,9R,9aS,9bS)-3-((二甲基胺基)甲基)-9-羟基-6,9-二甲基-3,3a,4,5,7,8,9,9a-八氢化薁并[4,5-b]呋喃-2(9bH)-酮富马酸盐,是一种含笑内酯衍生物。
[0061]2.实验流程
[0062]6组小鼠分别接受0.9%生理盐水,MPTP(15mg/kg),MPTP(15mg/kg)+ACT001(20mg/kg),MPTP(15mg/kg)+L-DOPA(5mg/kg)kg),MPTP(15mg/kg)+L-DOPA(8mg/kg)或MPTP(15mg/kg)+ACT001(20mg/kg)+L-DOPA(5mg/kg)。即将给药前,将MPTP,ACT001和L-DOPA溶解在0.9%的盐水中。每24小时腹腔注射MPTP一次,共7天,而每次MPTP给药前1小时,灌胃给药ACT001的剂量为20mg/kg,每24小时一次,共7天。在最后两天连续注射MPTP 2小时后,腹膜内注射L-DOPA或0.9%盐水。
[0063]3.实验结果
[0064]3.1.ACT001与L-DOPA协调作用改善了帕金森病小鼠的运动功能障碍
[0065]首先通过行为测试来评估ACT001和L-DOPA的协同作用,包括旷场实验和圆筒测试。MPTP治疗可导致PD样运动功能障碍,因此我们在半自然条件下使用开放视野测试检查了行为表现。运动行为分类和轨迹表明,小鼠表现出明显的发抖和僵硬。MPTP给药后,总运动距离、平均速度和跑步时间减少了,并且ACT001与L-DOPA的共同给药显着改善了这些测量结果(图1,图2)。这些结果表明ACT001对MPTP引起的运动行为障碍具有良好的治疗作用。之后进行了圆筒实验以检查每只小鼠的前肢接触圆柱体壁的次数(图3)。结果表明MPTP给药显著减少了小鼠的探索行为,并且与旷场试验的结果一致,ACT001和L-DOPA的共同给药增加壁接触的数目。
[0066]3.2.ACT001与L-DOPA协同改善了MPTP诱导的黑质纹状体途径多巴胺能神经元的丢失。
[0067]帕金森氏病的主要病理特征是黑质TH阳性神经元的丢失和纹状体TH的降低,而TH是多巴胺合成中的限速酶。因此,我们通过免疫组织化学检测了黑质纹状体途径中的TH阳性神经元。图4-图7是L-DOPA和ACT001协同给药对黑质纹状体途径中MPTP诱导的多巴胺能神经毒性的影响结果图,其中图4是黑质中TH阳性多巴胺能神经元的免疫染色结果示意图。在黑质中,MPTP导致了多巴胺能神经元的大量丧失(图4)。通过定量TH阳性神经元的数量,我们发现MPTP+ACT001组和MPTP+LD5组增加了黑质中TH阳性神经元的数量,但与对照组相比仍存在显着差异。并且,我们发现ACT001和L-DOPA(5mg/kg)共同给药的效果等同于8mg/kg L-DOPA的给药效果,与对照组无显着差异(图4,图5)。在纹状体中我们得到了相同的结果(图6,图7)。为了证实结果,我们对黑质和纹状体中的TH蛋白水平进行了蛋白质印迹分析,结果显示与对照相比,TH蛋白水平明显降低。然而,ACT001和LD的施用增强了TH蛋白的表达。值得一提的是,协同治疗组在增强TH表达方面比其他治疗组表现出更好的效果。
[0068]此外,帕金森氏病(PD)的另一个重要的生化特征是纤维状α-突触核蛋白错误折叠,这与黑质纹状体变性有关。因此,我们还通过蛋白质印迹法检测了黑质和纹状体中α-突触核蛋白的表达水平。MPTP显着增加了α-突触核蛋白的表达,并且ACT001和L-DOPA的共同给药抑制了MPTP诱导的α-突触核蛋白的过度表达,从而保护了多巴胺能神经元。这些结果表明,小白菊内酯衍生物ACT001与L-DOPA协同可以治疗帕金森氏病。
[0069]通过图4-图7检测L-DOPA和ACT001协同给药对黑质纹状体途径中MPTP诱导的多巴胺能神经毒性的影响。(A)黑质中TH阳性多巴胺能神经元的免疫染色。(B)黑质中TH阳性神经元数量的量化。通过在显微镜下成像的3个切片中盲目计算来确定黑质中TH阳性神经元的数量。(C)纹状体中TH阳性纤维的免疫染色。(D)使用Image Pro Premier软件对纹状体中TH阳性末端进行定量。
[0070]我们再用Western印迹分析显示小鼠黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)和α-突触核蛋白蛋白水平的表达。图8、图9是通过Western印迹分析显示小鼠黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)和α-突触核蛋白蛋白水平的表达图,图8是通过Western印迹对纹状体中TH和α-突触核蛋白的水平进行定量分析结果图,图9通过Western印迹对黑质中TH和α-突触核蛋白的水平进行定量分析结果图。可见ACT001和L-DOPA的共同给药抑制了MPTP诱导的α-突触核蛋白的过度表达,从而保护了多巴胺能神经元。
[0071]3.3.ACT001与L-DOPA协同改善了MPTP诱导的黑质纹状体途径神经炎症和细胞凋亡。
[0072]神经炎症和细胞凋亡是MPTP诱导神经元死亡的主要机制。因此,我们检测了炎性因子IL-1β,促凋亡信号分子Bax,抗凋亡信号分子Bcl-2和凋亡激活因子cleaved-caspase3在黑质和纹状体中的表达(图10和图11)。如预期的那样,MPTP导致黑质和纹状体中IL-1β,Bax和Caspase3的蛋白表达显着增加,而Bcl-2的蛋白表达显着下降。然而,L-DOPA和ACT001均抑制IL-1β,Bax,cleaved-caspase3的增加和Bcl-2的减少。此外,单独接受8mg/kg L-DOPA的组和接受ACT001与5mg/kg L-DOPA的组表现出最好的改善作用,表明ACT001与L-DOPA协同抑制细胞凋亡和炎症。图10和图11是Western blot定量法测定黑质和纹状体中IL-1β,Bcl-2,Bax和Caspase3的蛋白水平。图10是通过Western印迹在纹状体中定量分析IL-1β,Bcl-2,Bax和裂解的caspase3表达结果示意图,图11是通过Western印迹在黑质中对IL-1β,Bcl-2,Bax和裂解的caspase3表达的定量分析结果图。
[0073]3.4.ACT001与L-DOPA协同改善了MPTP诱导的星形胶质细胞活化。
[0074]此外,通常认为神经胶质细胞的激活指示神经炎症,因此我们通过GFAP免疫染色检测了黑质和纹状体中星形胶质细胞的激活程度。我们观察到MPTP导致黑质和纹状体的星形胶质细胞活化显着增加。ACT001和L-DOPA的协同给药可显着改善星形胶质细胞的激活,并减少黑质和纹状体中星形胶质细胞的数量。这些结果表明ACT001与L-DOPA协同抑制星形胶质细胞的激活。图12-图15是ACT001与L-DOPA协同抑制星形胶质细胞的激活的影响结果图。图12和图13是黑质中GFAP的免疫染色。图14和图15在纹状体中对GFAP进行免疫染色。数据表示为平均值±S.E.M.(n=10)。Tukey的多重比较测试,与对照组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。比例尺:100μm和40μm。
[0075]3.5.ACT001与L-DOPA协同促进了神经元存活。
[0076]为了进一步确定ACT001介导的神经保护机制,我们通过Western blot检测了黑质和纹状体中Akt和磷酸化Akt(Ser473)的表达(图16A-16D)。MPTP处理显着降低了p-Akt/Akt的比率,并且ACT001和L-DOPA的共同施用显着增加了p-Akt/Akt的比率。这些结果表明ACT001与L-DOPA结合可以诱导Akt信号通路的激活以治疗PD。
[0077]图16A、16B、16C、16D进行黑质和纹状体中p-Akt/Akt蛋白水平的蛋白质印迹分析。图16A通过Western blot检测纹状体中Akt和磷酸化Akt(Ser473)的表达示意图,图16B纹状体的p-Akt/Akt的蛋白质水平量化示意图,图16C是Western blot检测黑质中Akt和磷酸化Akt(Ser473)的表达结果示意图,图16D黑质中定p-Akt/Akt的蛋白水平结果示意图。(A)和(B)进行了纹状体蛋白质的蛋白质印迹,以确定p-Akt/Akt的蛋白质水平。(C)和(D)黑质蛋白的蛋白质印迹法测定p-Akt/Akt的蛋白水平。数据表示为平均值±S.E.M.(n=10)。Tukey的多重比较测试,与对照组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
[0078]实施例二ACT001减轻了MPTP诱导的PD小鼠中NLRP3炎症小体介导的神经炎症
[0079]天然产物小白菊内酯(PTL)是药用植物艾菊中的活性成分,具有抗氧化和抗炎特性。ACT001是二甲基苯酚内酯的衍生物,即富马酸酯形式的二甲基氨基甲烷(DMAMCL),其效果与PTL相当,但在血浆中显示出较高的稳定性,并且可以较低的成本获得。有证据表明,NOD样受体家族,含吡啶结构域的3(NLRP3)介导的神经炎症在PD的发病机理中起着非常重要的作用。在我们的研究中,我们检测了ACT001是否能减轻1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶(MPTP)诱发的小鼠帕金森氏病中NLRP3介导的神经炎症。通过极点测试和后肢扣紧测试运动能力。通过新颖的物体识别测试和昼夜活动测试来检测认知功能。通过免疫染色和蛋白质印迹分析评估多巴胺能神经变性。通过分光光度法测定氧化应激水平。通过实时定量PCR检测促炎细胞因子的表达。Western印迹分析用于评估NLRP3炎症小体信号途径中的相关蛋白。我们的结果表明,ACT001可以减少PD小鼠的运动障碍和认知缺陷。此外,它减轻了黑质中的多巴胺能神经变性和纹状体中多巴胺的消耗,并且抑制了MPTP诱导的PD小鼠中脑的氧化应激、炎症反应和NLRP3炎性体的激活。更重要的是,它减弱了黑质纹状体途径中的小胶质细胞活化。总的来说,我们首次发现了ACT001减轻了MPTP诱导的PD中NLRP3介导的神经炎症。
[0080]1、实验流程:
[0081]4组小鼠分别接受0.9%生理盐水,MPTP(15mg/kg),MPTP(15mg/kg)+ACT001(20mg/kg),MPTP(15mg/kg)+ACT001(50mg/kg)。即将给药前,将MPTP,ACT001溶解在0.9%的盐水中。每24小时腹腔注射MPTP一次,共7天,而每次MPTP给药前1小时,灌胃给药ACT001的剂量为20mg/kg,每24小时一次,共7天。
[0082]2.实验结果
[0083]2.1 ACT001减轻了MPTP引起的行为障碍。
[0084]运动障碍是PD的特征之一。图17A是实施例2实验设计的时间表示意图。进行爬杆实验和后肢扣紧以测试MPTP引起的小鼠运动障碍。图17B是爬杆测试结果图,与对照组相比,MPTP的给药显着增加了小鼠爬下杆的时间(图17B)。ACT001治疗可以剂量依赖性方式降低其时间。此外,在ACT001处理后,MPTP诱导的小鼠后肢扣紧行为显着降低(图17C),图17C是后肢紧扣严重程度评分图。
[0085]接下来,我们还进行了新颖的物体识别测试,以研究MPTP诱导的小鼠认知缺陷(图17D),图17D是小鼠认知缺陷测试结果图。与对照组相比,MPTP组中新对象的识别百分比显着降低。ACT001治疗可逆转这种短期识别障碍。
[0086]可见,ACT001减轻了MPTP引起的行为障碍。(A)实验设计的时间表。(B)小鼠在爬杆测试中从杆上爬下来的时间。(C)后肢扣紧的严重程度。(D)在新物体识别测试中,小鼠在每个区域中花费时间。在新物体识别测试中,小鼠靠近每个物体所花费时间的统计结果表明ACT001减轻了MPTP引起的行为障碍。数据表示为平均值±S.E.M.(n=8)。Tukey的多重比较测试,与对照组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。与MPTP处理组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001。
[0087]2.2.ACT001可改善MPTP引起的昼夜节律活动障碍。
[0088]昼夜活动紊乱可能导致轻度认知障碍,然后我们在Clocklab生物节律数据采集和分析系统中,在12:12h暗(LD)和24h暗(DD)周期中分别进行了10天的昼夜活动。在正常的12:12小时光节律(Light:Dark,LD)阶段,在此阶段,MPTP组的昼夜节律活动显着降低,而ACT001显着改善了这种状态。24小时黑暗环境检测(Dark,DD)阶段可在内源时钟基因调节下检测昼夜活动的节奏变化。在此阶段,ACT001给药组也以剂量依赖的方式减轻了MPTP引起的运动活性的下降。结果表明ACT001可以恢复MPTP引起的节律障碍。经统计然后我们对行为参数进行了聚类分析。结果将行为参数分为两组,锻炼活动组和休息时间组。结果ACT001对MPTP引起的运动/休息节律障碍有改善的作用。为了进一步分析每组行为参数之间的差异,我们还进行了主成分分析,并获得了相同的结果。
[0089]2.3.ACT001减轻黑质纹状体途径中的多巴胺能神经元变性。
[0090]PD的行为障碍被认为是黑质中多巴胺能神经元进行性变性和纹状体TH水平降低的结果。因此,我们通过免疫组织化学检查了黑质和纹状体中的TH水平(图18A,18B,18C)。图18A是黑质中TH阳性多巴胺能神经元的免疫染色图,图18B是TH阳性神经元计数的直方图,计数3-5个切片的图像以分析TH阳性神经元的数量。图18C是纹状体中TH阳性纤维的免疫染色图。结果表明,与对照组相比,用MPTP处理的小鼠在黑质和纹状体中表现出明显的多巴胺能神经元缺失。与MPTP组相比,ACT001治疗可减轻MPTP诱导的TH水平下降。此外,通过蛋白质印迹法检测MPTP诱导的PD小鼠中脑中TH的表达,可获得相同的结果(图18D,18E)。图18D是TH的代表性蛋白质印迹带示意图,图18E是表示TH定量分析的直方图。数据表示为平均值±S.E.M.(n=8)。Tukey的多重比较测试,与对照组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。与MPTP处理组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001。比例尺:40μm(黑质);1mm(纹状体)。
[0091]2.4 ACT001减轻了MPTP诱导的PD小鼠中脑的氧化应激和炎症反应。
[0092]为了研究ACT001对MPTP诱导的脂质过氧化的影响,我们检查了小鼠中脑中MDA的水平。MPTP组的MDA水平显着高于对照组,而ACT001治疗可减轻MDA水平的升高。此外,SOD和CAT是重要的抗氧化剂激酶。与对照组相比,MPTP组的小鼠显示出较低的SOD和CAT活性,而ACT001处理显着提高了SOD和CAT的活性(图19B,19C),图19A是测定MDA水平结果图,图19B是测定SOD的活性结果图,图19C是测定CAT的活性结果图。IL-6,TNF-α和IL-1β是神经炎症过程中的关键促炎细胞因子。与对照组相比,MPTP给药显着上调了小鼠中脑中IL-6,TNF-α和IL-1β的mRNA水平。ACT001处理以剂量依赖性方式显着抑制IL-6,TNF-α和IL-1βmRNA表达(图19D,19E,19F),图19D是IL-6水平结果示意图,图19E TNF-α水平结果示意图,图19F是IL-1β的水平结果示意图。可见,ACT001减轻了MPTP诱导的PD小鼠中脑的氧化应激和炎症反应。(A,B,C)通过分光光度法测定MDA水平以及SOD和CAT的活性。(D,E,F)通过定量实时PCR确定IL-6,TNF-α和IL-1β的基因表达。数据表示为平均值±S.E.M.(n=8)。Tukey的多重比较测试,与对照组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。与MPTP处理组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001。
[0093]2.5 ACT001减弱了黑质和纹状体中的小胶质细胞活化。
[0094]此外,神经胶质细胞的激活是炎症进展的重要因素,我们通过ox42免疫染色检查了黑质和纹状体中小神经胶质细胞的激活程度。我们观察到MPTP给药后黑质和纹状体中的小胶质细胞活化显着增加。用ACT001处理可显着改善小胶质细胞的活化,显示黑质和纹状体中小胶质细胞数量的减少。图20A和图20B表明ACT001减弱了黑质纹状体途径中的小胶质细胞活化。(A)在黑质中对ox42进行免疫染色。(B)对纹状体中的ox42进行免疫染色。比例尺:100μm和40μm。
[0095]2.6.ACT001抑制MPTP诱导的PD小鼠中脑中的NLRP3炎症小体信号通路。
[0096]据报道,NLRP3炎性体参与PD的发展。我们使用蛋白质印迹来检测经典的Nlrp3激活途径(图21A、21B、21C和图22A、22B)。NLRP3炎症小体的激活介导IL-1β的成熟和释放,这需要两个信号。第一个信号是MPTP诱导procaspase-8的裂解并促进p65的磷酸化,从而增加NLRP3和proIL-1β的表达。如图22A、22B所示,第二个信号是活化的NLRP3炎性体诱导caspase-1的裂解,促进pro-IL-1β向成熟IL-1β的转化。ACT001的治疗显着抑制了中脑中NLRP3炎性小体的活化。图21A、21B、21C表明ACT001抑制了MPTP诱导的PD小鼠中脑中的NLRP3炎症小体引发信号的激活。(A)caspase-8,p65,p-p65的蛋白质印迹带。(B,C)直方图代表caspase-8和p-p65水平的定量分析。数据表示为平均值±S.E.M.(n=8)。Tukey的多重比较测试,与对照组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。与MPTP处理组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001。
[0097]图22A和图22B表明ACT001抑制PD小鼠中脑中的NLRP3炎症小体活化。(A)Nlpr3,Caspase-1,ProIL-1β,IL-1β的蛋白质印迹带。(B)表示Nlpr3,Caspase-1,ProIL-1β,IL-1β水平定量分析的直方图。数据表示为平均值±S.E.M.(n=8)。Tukey的多重比较测试,与对照组相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。与MPTP处理组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001。
[0098]上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。