1.一种药物组合物在制备治疗肠道疾病和/或提高肠道免疫力的药物中的用途，其特征在于所述药物组合物包含活性组分和药学上可接受的载体，其中,所述活性组分是保藏编号为GDMCC No: 63728的汉逊酵母（Ogataea polymorpha）菌株 。

技术领域
[0001]本发明属于医药领域，具体而言，提供了含重组碱性磷酸酶的酵母细胞在制备治疗肠道疾病和提高肠道免疫力的药物中的用途；同时，本发明也提供了以酵母细胞为载体将重组碱性磷酸酶递送至肠道的给药方法。
背景技术
[0002]碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,简称ALPase)是一类水解酶，其分子功能是去磷酸化。在哺乳动物体内，碱性磷酸酶主要分布在肠道、肝脏、骨骼和胎盘等组织中。碱性磷酸酶在肠道对生理的调节主要包括帮助消化蛋白质与脂肪，保护肠黏膜以及抗菌免疫等。市场上比活力最高的天然碱性磷酸酶由英国BBI公司提取自牛肠，而高比活力(>3000U/mg)的重组牛肠碱性磷酸酶(简称bIALPase)由瑞士罗氏公司独家拥有专利[1]。相对于天然碱性磷酸酶，重组碱性磷酸酶降低了成本，提高了产能，但售价仍高达每克20/70万，仅用于检测试剂，尚无法应用于治疗或保健，关键技术亟待突破。大量科学研究已证实，补充外源碱性磷酸酶可以治疗多种疾病(如上皮细胞损伤和炎症、代谢综合征或脓毒血症等[2-4])并提高肠道免疫力。特别是2022年，补充口服碱性磷酸酶可以调节肠道生理的分子机制得以初步揭示[5]，因此，递送任何有活性的碱性磷酸酶至肠道都有治疗疾病或保健的应用价值。然而，递送至肠道的碱性磷酸酶要求比活力高、稳定性高而且能应对降解等问题。因此，截止到本专利申请日，市场上未见用于治疗或保健的口服碱性磷酸酶产品，仅有SyntheticBiologics公司口服重组bIALPase产品SYN-020[6]获得美国FDA的临床研究许可，但SYN-020纯化成本高，且对递送载体要求高。
[0003]2016年，南开大学高山等首次在酵母中表达了原核碱性磷酸酶，该酶源自一种海洋微生物—海洋科贝特氏菌(Cobetia marina)，其比活力高达14,580U/mg[7]，而且稳定性高。2022年，高山等申请了制备汉逊酵母重组海洋科贝特氏菌碱性磷酸酶(简称CmALPase)的发明专利[8]，罗氏公司的重组bIALPase专利不再是独家专利。在长期的基础研究中，高山等观察发现，即任何酵母表达的分泌型重组碱性磷酸酶都有一定比例滞留在细胞内且不断积累，只要分泌到胞外的部分有活性，胞内积累的部分就有活性。这一发现的理论和应用价值极大，其不仅颠覆了对蛋白质胞内滞留的经典认识，而且直接的启示是，口服表达分泌型重组碱性磷酸酶的酵母细胞就可以实现以酵母细胞为载体将重组碱性磷酸酶递送至肠道。后来，高山等通过大量实验又发现汉逊酵母表达的CmALPase的分泌比例(Secretionratio)最低可以达到2％，此时，胞内积累比例(Intracellular accumulation ratio)达到了最高的98％。因此，在实际生产中，高山等最终选中胞内积累比例最高的表达分泌型CmALPase的汉逊酵母制备成口服酵母粉产品，这是全球首个可以低成本制备且量产的口服碱性磷酸酶产品；这也是全球首次以酵母细胞为载体将重组碱性磷酸酶递送至肠道用于治疗疾病或保健，这样不仅解决了碱性磷酸酶在递送过程中的降解问题，又可以同时补充酵母含有的其它营养成分，而且不需要蛋白质纯化，极大降低了成本。动物实验显示该产品可以治疗多种肠道疾病并提高肠道免疫力。根据碱性磷酸酶对生理调节的分子机制[2-4]，该产品可用于满足当前社会上的多项重大需求，最重要的就是“长新冠”患者的肠道修复以及预防肠道恶性肿瘤。
发明内容
[0004]截止到本专利申请日，未见文献公开报道以酵母细胞为载体将重组碱性磷酸酶递送至肠道用于治疗疾病或保健。本发明源于本发明人在全球的首次发现，即任何酵母表达的分泌型重组碱性磷酸酶都有一定比例滞留在细胞内且不断积累，只要分泌到胞外的部分有活性，胞内积累的部分就有活性。本发明人是实验以酵母细胞为载体将重组碱性磷酸酶递送至人或动物肠道用于治疗疾病和提高肠道免疫力而且观察到效果的第一人，并提供了实验结果。因此，本发明提供了含重组碱性磷酸酶的酵母细胞在制备治疗肠道疾病和/或提高肠道免疫力的药物中的用途；同时，本发明也提供了以酵母细胞为载体将重组碱性磷酸酶递送至肠道的给药方法。
[0005]本发明提供了一种药物组合物，其包含活性组分和药学上可接受的载体，其中所述活性组分为含重组碱性磷酸酶的酵母细胞。
[0006]根据本发明，酵母细胞所含的重组碱性磷酸酶和/或以酵母细胞为载体递送的重组碱性磷酸酶可以是酵母细胞表达的分泌型重组碱性磷酸酶在胞内积累的部分，其中所述分泌型重组碱性磷酸酶包含N端的15-40个氨基酸残基长度的供酵母细胞识别分泌蛋白所需的信号肽和碱性磷酸酶成熟体。
[0007]例如，当所述分泌型重组碱性磷酸酶包含N端的供酵母细胞识别分泌蛋白所需的信号肽时，它可以是酿酒酵母交配因子Alpha1的信号肽；优选地，所述信号肽的氨基酸序列为“MRFPSIFTAVLFAASSALA”。
[0008]根据本发明，所述碱性磷酸酶成熟体可以源自任何物种或组织；优选地，源自海洋科贝特氏菌或牛肠。
[0009]例如，当所述碱性磷酸酶成熟体源自海洋科贝特氏菌时，其氨基酸序列可以由来自GenBank数据库的基因序列(检索号为DQ435608)翻译得到的氨基酸序列去掉N端的34个氨基酸得到；当所述碱性磷酸酶成熟体源自牛肠时，其氨基酸序列可以由来自UniProt数据库的氨基酸序列(检索号为F1N6T5)去掉N端的19个氨基酸和C端的27个氨基酸得到。优选地，源自海洋科贝特氏菌的碱性磷酸酶成熟体的编码基因为参考文献[8]中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；源自牛肠的碱性磷酸酶成熟体的编码基因为本发明中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(见序列表)。
[0010]根据本发明，所述碱性磷酸酶成熟体的比活力不低于200U/mg，其中碱性磷酸酶的活力单位(U)采用罗氏公司的标准定义，即在测试条件(37℃，pH＝9.8)下，1分钟内水解pNPP生成1微摩pNP所需要的酶量定义为1个U。
[0011]根据本发明，所述酵母细胞可以是无致病性、无毒副作用且不会引起人体不适的任何酵母细胞；优选地，是酿酒、毕赤或汉逊酵母。
[0012]例如，当所述酵母细胞是毕赤或汉逊酵母时，可以根据中国发明专利ZL202210118943.9(详见参考文献[8])中描述的方法构建大量酵母菌株，然后通过筛选获得生产菌株，再对生产菌株进行细胞培养和诱导表达，最终得到所述含重组碱性磷酸酶的酵母细胞用于治疗或保健。
[0013]根据本发明，所述生产菌株可以是筛选得到的所述分泌型重组碱性磷酸酶在所述酵母细胞的胞内积累比例为10％以上的菌株；优选地，所述胞内积累比例为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％以上。
[0014]根据本发明，肠道疾病包括细菌/病毒感染、炎症、腹泻、便秘、消化不良、各种代谢疾病或已经在公开发表的文献中记录的任何一种可以由碱性磷酸酶治疗的肠道疾病。
[0015]根据本发明，药物可以是口服药物，选自包含液体制剂、口服粉剂、多颗粒系统和口服可分散剂的组。
[0016]例如，当所述药物是口服药物时，它可以选自包含溶液、糖浆、悬浮液、乳剂和口服滴剂的组的液体制剂形式。当所述药物是口服粉剂或多颗粒系统的形式时，它可以选自包含珠子、微粒、迷你片剂和微颗粒的组。当所述药物是口服可分散剂的形式时，它可以选自包含冻干粉、口分散片剂和胶囊的组；优选地，选自冻干粉。
[0017]根据本发明，所述口服药物可以包含任何药学上可接受的和有效剂量的所述含重组碱性磷酸酶的酵母细胞来治疗肠道疾病和/或提高肠道免疫力。例如，当所述口服药物是冻干粉的形式时，它可以包含一种剂量，其容许范围可以是每天1到20mg冻干粉/kg体重。
附图说明
[0018]图1左部为实施例6中一只连续腹泻2周以上的成年鸡(体重1.5kg)治疗前的粪便；图1右部为同一只鸡服用含重组CmALPase的口服汉逊酵母粉7天后的粪便；
具体实施方式
[0019]在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验或生产的操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
[0020]为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0021]实施例1.各类样品中碱性磷酸酶的检测
[0022]本发明涉及的所有样品(人和动物血液、粪便以及酵母发酵液等)中碱性磷酸酶的活力单位(U)统一采用罗氏公司的标准定义，即在测试条件(37℃，pH＝9.8)下，1分钟内水解pNPP生成1微摩pNP所需要的酶量定义为1个U。具体实施检测时，采用碱性磷酸酶检测试剂盒(贝尔曼库尔特，苏州)在全自动生化分析仪Cobas C701(罗氏，瑞士)上按照罗氏公司的标准(默认设置)自动检测碱性磷酸酶的酶活浓度(单位是U/L)，重复检测三次，取平均值作为检测值。人和动物的血液需要抽取2毫升，放置30分钟，离心取血清用于检测碱性磷酸酶的酶活浓度；人和动物的粪便需要取0.1g的固体部分，加入1毫升0.02M浓度的Tris-HCl(pH＝10.4)，再加入玻璃珠震荡3分钟，离心(16000g，10min)后取上清用于检测碱性磷酸酶的酶活浓度。对于每个酵母菌株，其培养和诱导表达后得到的发酵液，在震荡混匀后，直接检测到的是该菌株表达的重组碱性磷酸酶的总酶活浓度；总酶活是分泌到胞外的(简称分泌的)和胞内积累的两部分酶的活力之和，其浓度可以分别检测，方法是：取1毫升酵母发酵液，离心(16000g，10min)得到上清和沉淀两部分，上清检测到的酶活浓度代表分泌的酶活浓度，记作a；再将发酵液沉淀重悬于1毫升0.02M浓度的Tris-HCl，震荡混匀后进行检测，检测到的酶活浓度代表胞内积累的酶活浓度，记作b。于是，可以用分泌的和胞内积累的酶活浓度估计重组碱性磷酸酶在该菌株的分泌比例Rs＝a/(a+b)和胞内积累比例Rc＝1-Rs。
[0023]实施例2.表达重组碱性磷酸酶的酵母菌株的构建与筛选
[0024]根据中国发明专利ZL202210118943.9中实施例2、4和1中描述的方法(详见参考文献[8])分别构建三组(即表达重组CmALPase的汉逊酵母组、表达重组CmALPase的毕赤酵母组和表达重组bIALPase的毕赤酵母组，CmALPase和bIALPase在[8]中简写为CmAP和bIAP)菌株；再用酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSC1和pYC2质粒构建表达重组CmALPase和bIALPase的酿酒酵母菌株各一组，构建方法详见参考文献[9]。以上5组菌株，每组600只，总共3000只菌株，其中，CmALPase和bIALPase的编码基因分别为参考文献[8]中SEQ ID NO:1和本发明中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(见序列表)。摇瓶培养全部3000只菌株24小时，分别用甲醇和半乳糖诱导毕赤/汉逊酵母和酿酒酵母表达70小时后，每只菌株收获约10毫升发酵液，取1毫升用于检测，根据本发明实施例1中描述的方法检测每一只菌株表达的重组碱性磷酸酶的总酶活浓度；从每组菌株中选取总酶活浓度最大的菌株一只，继续进行筛选。
[0025]上一步得到的5只菌株用摇瓶放大发酵后，各收获约100毫升发酵液，取1毫升用于检测，根据本发明实施例1中描述的方法检测分泌的和胞内积累的两部分重组碱性磷酸酶的酶活浓度并估计胞内积累比例：5只菌株(即一只表达重组CmALPase的汉逊酵母，一只表达重组CmALPase的毕赤酵母、一只表达重组bIALPase的毕赤酵母、一只表达重组CmALPase的酿酒酵母、一只表达重组bIALPase的酿酒酵母)分泌的酶活浓度分别是444、5937、171、182、112U/L；胞内积累的酶活浓度分别是22242、9731、2117、1116和899U/L；则重组碱性磷酸酶的胞内积累比例分别是98％、62.11％、92.53％、86％和88.9％。在5只菌株中，表达重组CmALPase的汉逊酵母菌株(命名为HU-11ALP1)的总酶活浓度最大，而且胞内积累比例最高，因此，被选为生产菌株，在广东省微生物菌种保藏中心(地址是：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)进行长期保存，编号为GDMCC 63728，拉丁文名称是Ogataeapolymorpha，保藏日期是2023年8月14日。
[0026]为验证酵母细胞中积累的重组碱性磷酸酶释放到胞外依然有活性，从5只菌株中选中表达重组CmALPase的汉逊酵母菌株HU-11ALP1用5升发酵罐放大发酵，甲醇诱导表达72小时后，收获2.4升发酵液；取1毫升发酵液离心，上清的酶活浓度为4960U/L；收集沉淀的细胞，重悬于0.02M浓度的Tris-HCl，破碎离心(16000g，10min)，上清的酶活浓度为52120U/L；弃沉淀，再离心(20000g，20min)，上清的酶活浓度为44460U/L；收集沉淀的细胞碎片，从中取129微克溶于4毫升去离子水，溶液的酶活浓度为3778U/L。以上结果说明，酵母细胞破壁释放出来的重组碱性磷酸酶依然有活性。
[0027]实施例3.制备含重组碱性磷酸酶的口服酵母粉
[0028]用本发明实施例2中的5只菌株进行30升发酵罐发酵：表达重组CmALPase的汉逊酵母HU-11ALP1的发酵根据中国发明专利200810103154.8(详见参考文献[10])中实施例1中描述的方法实施，收获约20升发酵液，取1毫升检测总酶活浓度是99861U/L；表达重组CmALPase的毕赤酵母和表达重组bIALPase的毕赤酵母的发酵根据《毕赤酵母实验流程手册》中描述的方法(详见参考文献[11])实施，分别收获约20升和21升发酵液，取1毫升检测总酶活浓度分别是10123和8864U/L；表达重组CmALPase和bIALPase的酿酒酵母的发酵根据参考文献[12]中描述的方法实施，分别收获约19升和18升发酵液，取1毫升检测总酶活浓度分别是4434和2271U/L。分别收集5只菌株的全部发酵液，离心后，收集沉淀的细胞，冷冻干燥后，分别得到含重组CmALPase的口服汉逊酵母粉、含重组CmALPase的口服毕赤酵母粉、含重组bIALPase的口服毕赤酵母粉、含重组CmALPase的口服酿酒酵母粉和含bIALPase的口服酿酒酵母粉1532、1301、1299、899和901g，-20℃长期保存，将作为药物用于后续动物实验。根据中国发明专利200810103154.8(详见参考文献[10])中实施例1中描述的发酵方法，选用(不表达重组碱性磷酸酶的)汉逊酵母HU-11菌株(CGMCC 1218)进行30升发酵罐发酵，用同样方法处理发酵液，得到不含重组碱性磷酸酶的口服酵母粉1676g，-20℃长期保存，将作为药物对照用于后续动物实验。
[0029]实施例4.在提高大鼠肠道免疫力方面的应用
[0030]用于实验的36只成年Wistar大鼠，平均体重300g，被随机分入给药组1、给药组2、给药组3、给药组4、给药组5和对照组，每组6只；给药组1、2和3分别喂食本发明实施例3中制备的含重组CmALPase的口服汉逊酵母粉、含重组CmALPase的口服毕赤酵母粉和含重组bIALPase的口服毕赤酵母粉，每只每天100毫克；给药组4、5和对照组分别喂食含重组CmALPase的口服酿酒酵母粉、含bIALPase的口服酿酒酵母粉和不含重组碱性磷酸酶的口服酵母粉，每只每天300毫克；所有组连续喂食7天，喂食方式是将酵母粉混入鼠粮。第7天结束时，分别检测了所有大鼠粪便中的碱性磷酸酶的酶活浓度(单位是U/L)，取5个给药组的检测平均值分别与对照组的检测平均值对比，给药组1、2、3、4和5的检测平均值分别达到对照组的2.3、1.8、1.4、1.2和1.18倍，T检验的P值小于0.05。以上结果说明，根据本发明提供的方法可以向动物肠道补充足够多的重组碱性磷酸酶。第7天结束时，又分别检测了所有大鼠粪便中的IgA的含量(单位是g/L)，取5个给药组的检测平均值分别与对照组的检测平均值对比，给药组1、2、3、4和5的检测平均值分别达到对照组的3.2、2.6、1.5、1.2和1.05倍，T检验的P值小于0.05。以上结果说明，根据本发明提供的方法向动物肠道补充的重组碱性磷酸酶可以提高IgA含量。IgA是黏膜免疫系统的主要成分，向肠道补充碱性磷酸酶可以通过提高IgA得以提高肠道黏膜的免疫力(详见参考文献[5])。因此，IgA的显著提高说明了根据本发明提供的方法向动物肠道补充重组碱性磷酸酶可以提高肠道免疫力。大鼠粪便中碱性磷酸酶的检测根据本发明实施例1中描述的方法实施；大鼠粪便中IgA的检测根据参考文献[5]中描述的方法实施。
[0031]实施例5.在治疗大鼠肠道炎症中的应用
[0032]用于实验的36只患有肠炎的成年Wistar大鼠，平均体重300g；36只大鼠血液的白细胞数量均高出正常范围([5-25]×109/L)，粪便中均检出白细胞，应该是肠炎导致。36只大鼠被随机被随机分入给药组1、给药组2、给药组3、给药组4、给药组5和对照组，每组6只；给药组1、2和3分别喂食本发明实施例3中制备的含重组CmALPase的口服汉逊酵母粉、含重组CmALPase的口服毕赤酵母粉和含重组bIALPase的口服毕赤酵母粉，每只每天100毫克；给药组4、5和对照组分别喂食含重组CmALPase的口服酿酒酵母粉、含bIALPase的口服酿酒酵母粉和不含重组碱性磷酸酶的口服酵母粉，每只每天300毫克；所有组连续喂食7天，喂食方式是将酵母粉混入鼠粮。第7天结束时，分别检测了所有大鼠血液中的白细胞数量，结果是：治疗组1、2、3、4和5的白细胞数量平均值回归到正常范围，说明炎症已经消退；对照组的白细胞数量平均值未回归到正常范围，说明炎症尚未消退。大鼠血液中的白细胞数量采用BC5310血液分析仪(迈瑞，中国)自动检测。大鼠粪便中的的白细胞检测采用显微镜下细胞计数的方法，具体操作是：使用无菌棉签蘸取大鼠的新鲜粪便制作涂片；使用甲醇(瑞式染色试剂自带)在涂片上固定样品；使用瑞式染色；在显微镜(目镜10X，物镜40X)下观察涂片，每个粪便样品观察3个视野，每一个视野面积为10毫米*10毫米，记录每个视野中的白细胞数量；如果3个视野中的白细胞总数大于或等于10，判定该样品中检出白细胞，否则判定为没有检出。
[0033]实施例6.在治疗鸡腹泻中的应用
[0034]用于实验的24只腹泻的成年鸡，平均体重1.5kg，均连续腹泻2周以上；24只鸡血液中的C反应蛋白的检测平均值高于未腹泻的鸡的C反应蛋白的检测平均值2倍以上。鸡腹泻根据其粪便中水分的比例进行判定，该比例在80％以上时判定为腹泻(见附图1左)，否则判定为未腹泻(见附图1右)。粪便中水分的比例用新鲜粪便总重量减去烘干的粪便的重量除以新鲜粪便总重量来计算。由于C反应蛋白是微生物感染的标记物，鸡腹泻应该是细菌或其它微生物感染导致。24只鸡被随机分入治疗组和对照组，治疗组(12只鸡)喂食本发明实施例3中制备的含重组CmALPase的汉逊酵母粉，每只每天500毫克，连续喂食7天，喂食方式是将酵母粉混入饲料；而对照组(12只鸡)喂食同等剂量的本发明实施例3中制备的不含重组碱性磷酸酶的口服酵母粉7天。第7天结束时，观察并对比了第7天和治疗前鸡的粪便，结果是：治疗组的鸡不再腹泻，而对照组的鸡依然腹泻。第7天结束时，又分别检测了所有鸡血液中的碱性磷酸酶(单位是U/L)和C反应蛋白(单位是ng/L)，并与治疗前的检测结果进行对比，结果是：治疗组的碱性磷酸酶的酶活浓度的检测平均值提高到治疗前的约1.2倍，C反应蛋白的检测平均值降低到与未腹泻的鸡的C反应蛋白的检测平均值无显著差异；对照组的碱性磷酸酶的酶活浓度的检测平均值和C反应蛋白的检测平均值与治疗前相比均无显著变化。鸡血液中的C反应蛋白的检测需要抽取2毫升血液，放置30分钟，离心取血清，用鸡C反应蛋白(CRP)Elisa试剂盒(恒远生物，上海)检测。
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